\?0?10乂(￥&271116公司）10^1，上下游引物（1〇1111)各1^1，冊1(293細(xì)胞0嫩模板 Iy1 (約50ng)，用滅菌水補(bǔ)足20y1體系。反應(yīng)條件為：95°C5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95°C30s 變性，60°C30s退火，72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然 后20°C保存。第一輪PCR反應(yīng)完取每個(gè)片段的PCR產(chǎn)物Iy1進(jìn)行第二輪重疊PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，具體反應(yīng)體系是50y1 :具體是2XPCRMIX(Vazyme公司）25yI，Up-F和Down-R引物 (IOmM)各2. 5y1，第一輪PCR產(chǎn)物各段產(chǎn)物Iy1 (共3y1)，用滅菌水補(bǔ)足50y1體系。反 應(yīng)條件為：95°C5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95°C30s變性，60°C30s退火，72°C延伸lmin，共40個(gè) 循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然后20°C保存。
[0059] PCR完成后取3ylPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳結(jié)果參見圖2。其中，M為DNA Marker2000，右邊箭頭所指為本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架目標(biāo)條帶。
[0060] 將PCR產(chǎn)物切膠回收，使用膠回收試劑盒回收純化，然后用Nhel、XhoI酶切后，將 此框架構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)中，構(gòu)建得到含有環(huán)狀RNA過表達(dá)框架的載體，其 模式圖譜參見圖3。
[0061 ] 測試?yán)罕景l(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架過表達(dá)環(huán)狀RNA測試
[0062] 根據(jù)環(huán)狀RNA-MET基因，（circbae數(shù)據(jù)庫登錄號：hsa_circ_0082002,全長為 1214bp)序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增此環(huán)狀RNA的線性序列，環(huán)狀RNA-MET基因核苷酸序 列由1214bp組成；然后通過KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)將目標(biāo)核苷酸序列連接到本發(fā)明的環(huán) 狀RNA人工過表達(dá)框架中，構(gòu)建過表達(dá)載體，然后將此載體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。
[0063] 通過熒光定量PCR檢測，構(gòu)建的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架成功地過表達(dá)目標(biāo)環(huán)狀 RNA。其具體檢測步驟如下：
[0064] 1、環(huán)狀RNA-MET基因PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)
[0065] 引物設(shè)計(jì)好后，需在正向引物5'端加入KpnI酶切位點(diǎn)序列，反向引物5'端加入 BamHI酶切位點(diǎn)序列，引物序列如下：
[0066] RNA-MET-F: 5 'GGGGTACCAGATAAACCTCTCATAATGAAGG3 '
[0067] RNA-MET-R: 5 'CGGGATCCACCCTATTAAAGCAGTGCTCATGATT3 '
[0068] 2、PCR擴(kuò)增目標(biāo)環(huán)狀RNA序列
[0069] 用上述引物配合如下反應(yīng)體系：PCR為30y1總體系，具體是2XPCRMIX(Vazyme 公司）15y1，上下游引物（IOmM)各2yI，HEK293細(xì)胞DNA模板Iy1 (約50ng)，用滅菌水補(bǔ) 足30yl體系。反應(yīng)條件為：95°C5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95°C15s變性，62°C30s退火，72°C 延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然后16°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物通過割膠回收、酶切后連接到含有本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的載體中，構(gòu)建人 工過表達(dá)MET基因環(huán)狀RNA載體，命名為PCD-ciR-Met。
[0070] 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0071] 將上述過表達(dá)載體用lip〇2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，載體轉(zhuǎn)染濃度 Iyg/ml，轉(zhuǎn)然后培養(yǎng)48小時(shí)，檢測環(huán)狀RNA的表達(dá)情況。
[0072] 4、熒光定量PCR檢測環(huán)狀RNA的表達(dá)
[0073] 根據(jù)環(huán)狀RNA-MET基因（登錄號：hsa_circ_0082002)序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，特 異性檢測環(huán)狀RNA-MET引物序列為：
[0074] MET-F:5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
[0075] MET-R:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'
[0076] 選取P-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，作為熒光定量結(jié)果數(shù)據(jù)的矯正基因，序列如下：
[0077] 0 -actin F:5, GCATGGGTCAGAAGGATTCCT3'
[0078] 0-actin R:5，TCGTCCCAGTTGGTGACGAT3，；
[0079] 具體檢測方法如下：
[0080] (1)將轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體PCD-ciR-Met的細(xì)胞嚴(yán)格按照TRIzol? Reagent (Life technologies公司）試劑操作說明書提取細(xì)胞中的總RNA;
[0081] 提取詳細(xì)步驟為：
[0082] ①細(xì)胞取100萬個(gè)左右的細(xì)胞，加入1ml trizol。
[0083] ②加入200 y 1氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置15min ;
[0084] ③4°C下，12,OOOg離心15min，溶液分為三層，RNA溶解在水相中，轉(zhuǎn)移水相至另一 個(gè)新的RNase free EP管；
[0085] ④加入1倍體積異丙醇，渦旋充分混勻；
[0086] ⑤4°C下，12, OOOg離心lOmin，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄去上清；
[0087] ⑥加入Iml75%乙醇，用手輕輕顛倒，12,OOOg離心5min，棄去上清；
[0088] ⑦室溫晾干，加入20ylDEPC水溶解沉淀。
[0089] (2)除去提取的RNA中殘留的基因組DNA
[0090] 使用RNase-free的DNaseI(全式金公司），按照說明書配置反應(yīng)液，37°C消化 30min，加入 0.5ylEDTA，65°C滅活lOmin。
[0091]
[0092] (3)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
[0093] 嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme公司）操作說明書在PCR管中加入模板RNA、隨機(jī) 逆轉(zhuǎn)錄引物等，總量l〇ul。
[0094]
[0095] 反應(yīng)條件：25°C5min，42°C20min，85°C5min，4°C2min。
[0096] (4)熒光定量檢測環(huán)狀RNA-MET
[0097] 按照焚光定量反應(yīng)試劑盒Real-timePCR試劑盒（Vazyme公司）的說明書配置反 應(yīng)體系；具體檢測反應(yīng)體系如下：
[0098]
[0099] 其中，熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95°C5分鐘變性；95°C10秒，60°C35秒（此步驟 收集熒光信號）；40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行融解曲線分析：溫度60°C_95°C收集熒光信號。
[0100] 熒光定量結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞過表達(dá)框架載體后，目標(biāo)環(huán)狀RNA-MET分子成功檢 測出來高表達(dá)，相對于未轉(zhuǎn)染組，高表達(dá)30多倍（參見圖4)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀 RNA表達(dá)框架可以有效過表達(dá)環(huán)狀RNA。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其特征在于，包括上游框架序列、 填充序列、下游框架序列、以及環(huán)狀RNA插入酶切位點(diǎn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其特征在于，所述環(huán)狀RNA插入酶 切位點(diǎn)包括 NheI、KpnI、BamHI 和 XhoI。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其特征在于，該環(huán)狀RNA人工過表 達(dá)框架的堿基序列中，第1~492bp為上游框架序列，第493~635bp為填充序列，第636~ 1017bp為下游框架序列，其中，第1~6bp、487~492bp、636~641bp、1012~1017bp依次 為酶切位點(diǎn) NheI、KpnI、BamHI、XhoI。5. 包括權(quán)利要求1所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的表達(dá)載體。6. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的構(gòu)建方法，該方法包括以 下步驟：設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以人的HEK293細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用分段PCR擴(kuò)增，分別 擴(kuò)增表達(dá)框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全長序列兩端分別添加NheI、 XhoI酶切位點(diǎn)序列，方便將整個(gè)表達(dá)框架連接到質(zhì)粒載體中；在填充序列兩端添加KpnI和 BamHI酶切位點(diǎn)序列，用于連接所要研究的目標(biāo)環(huán)狀RNA的核苷酸序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增引物分為三段，其核苷酸序列如 下： 1) 第一段擴(kuò)增上游框架引物： Up-F:5' CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3，， Up-R:5' ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3，； 2) 第二段擴(kuò)增填充序列引物： stuffer-F ：5r GTTTTGGcGGTACCAGCTGAGCATAGTTCSr , StufTer-Rd' TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'; 3) 第三段擴(kuò)增下游游框架引物： Down-F :5^ TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'， Down-R :5^ GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述分段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：第一 輪PCR為20 yl總體系，PCR分別擴(kuò)增：具體是2XPCR MIX IOy 1，IOmM上下游引物各Iy 1， HEK293細(xì)胞DNA模板lyl，用滅菌水補(bǔ)足20yl體系；第一輪反應(yīng)條件為：95°C 5min預(yù) 變性，循環(huán)內(nèi)95°C 30s變性，60°C 30s退火，72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后 72°C繼續(xù)延伸7min，然后20°C保存；第一輪PCR反應(yīng)完取每個(gè)片段的PCR產(chǎn)物I y 1進(jìn)行第 二輪重疊PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體反應(yīng)體系是50 yl :具體是2XPCR MIX 25 yl，IOmM的Up-F和 Down-R引物各2. 5 y 1，第一輪PCR產(chǎn)物各段產(chǎn)物總共3 y 1，用滅菌水補(bǔ)足50 y 1體系；第二 輪反應(yīng)條件為：95°C 5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95°C 30s變性，60°C 30s退火，72°C延伸lmin， 共40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然后20°C保存。9. 權(quán)利要求1所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架應(yīng)用于人工表達(dá)目的基因。10. -種人工表達(dá)目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除環(huán)狀RNA人工過表 達(dá)框架中的填充序列，然后直接將目標(biāo)基因的核苷酸序列連接到所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá) 框架中進(jìn)行表達(dá)，其中所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其具有如SEQ？ID？NO.1所述的核苷酸序列。本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架能夠有效地過表達(dá)環(huán)狀RNA。
【IPC分類】C12N15/63, C12N15/11, C12N15/66
【公開號】CN105087570
【申請?zhí)枴緾N201510566302
【發(fā)明人】張茂雷, 劉明, 李自強(qiáng), 薛權(quán)燦
【申請人】廣州吉賽生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月7日