一種環(huán)狀rna人工過表達(dá)框架及其表達(dá)載體及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架及其表達(dá)載 體和構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)的環(huán)狀RNA(CircularRNA)是一類具有特殊功能的RNA分子，而且是客 觀大量存在的。環(huán)狀RNA(circRNA)由前體RNA通過剪切，然后由線性RNA的頭對尾連接形 成，以前的研究由于技術(shù)水平的限制，把這部分客觀存在的RNA忽略了，隨著深度RNA測序 及規(guī)?；镄畔⒓夹g(shù)的發(fā)展，研究者才真正發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)大量存在環(huán)化的RNA分子， 環(huán)化RNA由于形成閉合的環(huán)狀，在生物體內(nèi)非常的穩(wěn)定。對于環(huán)化RNA的具體功能尚未有 明確，目前只有幾種假定的說法：⑴環(huán)狀RNA可以作為"sponge"海綿吸miRNA，抑制其功 能；（2)環(huán)狀RNA通過堿基互補(bǔ)配對直接調(diào)控其他RNA水平；（3)環(huán)狀RNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合， 抑制蛋白質(zhì)活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性；（4)環(huán)狀RNA也可作為翻 譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。
[0003] 基因是具有遺傳效應(yīng)的核苷酸序列，研究特定分子的功能中通過克隆表達(dá)基因?qū)?研究者來說具有重要意義。為了使克隆的基因在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，就要依據(jù)不同的實 驗?zāi)康倪x擇不同的表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建不同的表達(dá)框架?？寺』蛟诓煌南到y(tǒng)中表達(dá)的成功 率取決于我們對這些系統(tǒng)中基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律的認(rèn)識程度，以及合理的實驗設(shè)計。過表達(dá) 線性的基因技術(shù)方法已經(jīng)非常成熟，可以把要克隆的基因通過PCR技術(shù)獲得，然后直接連 接到表達(dá)載體中即可；但是人工過表達(dá)環(huán)狀的RNA分子還存在不少問題，比如：如何人工地 使RNA分子在特定位點發(fā)生準(zhǔn)確環(huán)化，從而使生物體內(nèi)的環(huán)狀RNA可以通過外顯子上下游 的內(nèi)含子發(fā)生配對，形成局部雙鏈的RNA，然后通過細(xì)胞內(nèi)的RNA體的剪接生成環(huán)狀的RNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種能夠有效表達(dá)環(huán)狀RNA的 環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的表達(dá)載體。
[0006] 本發(fā)明的再一個目的是提供所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明的再一個目的是提供所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種人工表達(dá)目的基因的方法。
[0009] 為此，本發(fā)明提供了一種環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其具有如SEQIDNO. 1所述的 核苷酸序列。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架，其特征在于，包括上游框架序列、填充序 列、下游框架序列、以及環(huán)狀RNA插入酶切位點。
[0011] 術(shù)語"上游框架序列"指的是：框架中從第1個堿基算起到492個堿基結(jié)束的區(qū)域 核酸序列。
[0012] 術(shù)語"下游框架序列"指的是：框架中從第636個堿基算起到1017個堿基結(jié)束的 區(qū)域核酸序列。
[0013] 術(shù)語"填充（stuffer)序列"指的是：框架中存在于Kpnl、BamHI內(nèi)切酶中間的核 酸序列，用于替換目標(biāo)序列；如果沒有填充（StufTer)序列，Kpnl、BamHI緊連著，不容易 做酶切。
[0014] 優(yōu)選地，所述環(huán)狀RNA插入酶切位點包括NheI、KpnI、BamHI和XhoI。
[0015] 其中，該過表達(dá)框架的堿基序列中，第1~492bp為上游框架序列，第493~635bp 為填充序列，第636~1017bp為下游框架序列，其中，第1~6bp、487~492bp、636~ 641bp、1012 ~1017bp依次為酶切位點NheI、KpnI、BamHI、XhoI。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種包括所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的表達(dá)載體。
[0017] 優(yōu)選地，所述的表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的構(gòu)建方法，該方法包括以下步 驟：設(shè)計擴(kuò)增引物，以人的J1EK293細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用分段PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增 過表達(dá)框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全長序列兩端分別添加NheI、 XhoI酶切位點序列，方便將整個過表達(dá)框架連接到質(zhì)粒載體中；在填充序列兩端添加KpnI 和BamHI酶切位點序列，用于連接所要研究的目標(biāo)環(huán)狀RNA的核苷酸序列。
[0019] 優(yōu)選地，在該構(gòu)建方法中，所述擴(kuò)增引物分為三段，其核苷酸序列如下：
[0020] 1)第一段擴(kuò)增上游框架引物：
[0021] Up-F :5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3'，
[0022] Up-R :5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'；
[0023] 2)第二段擴(kuò)增填充序列引物：
[0024] stuffer-F : 5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC3'，
[0025] stuffer-R：5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'；
[0026] 3)第三段擴(kuò)增下游游框架引物：
[0027] Down-F :5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'，
[0028] Down-R :5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3' 〇
[0029] 優(yōu)選地，在該構(gòu)建方法中，所述分段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：第一輪PCR為 20y1總體系，PCR分別擴(kuò)增：具體是2XPCRMIXIOy1，IOmM上下游引物各Iy1，HEK293 細(xì)胞DNA模板Iy1，用滅菌水補(bǔ)足20y1體系；第一輪反應(yīng)條件為：95°C5min預(yù)變性，循環(huán) 內(nèi)95°C30s變性，60°C30s退火，72°C延伸40s，共35個循環(huán)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸 7min，然后20°C保存；第一輪PCR反應(yīng)完取每個片段的PCR產(chǎn)物Iy1進(jìn)行第二輪重疊PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，具體反應(yīng)體系是50y1 :具體是2XPCRMIX25yI，IOmM的Up-F和Down-R引物 各2. 5y1，第一輪PCR產(chǎn)物各段產(chǎn)物總共3y1，用滅菌水補(bǔ)足50y1體系；第二輪反應(yīng)條件 為：95°C5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95°C30s變性，60°C30s退火，72°C延伸lmin，共40個循環(huán)， PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然后20°C保存。
[0030] 本發(fā)明所述的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架應(yīng)用于人工表達(dá)目的基因。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種人工表達(dá)目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除所 述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架（具有如SEQIDNO. 1所述的核苷酸序列）中的填充序列，然 后直接將目標(biāo)基因的核苷酸序列連接到所述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架中進(jìn)行表達(dá)。
[0032] 本發(fā)明根據(jù)環(huán)狀RNA天然形成的分子分子機(jī)理，設(shè)計環(huán)狀RNA的人工過表達(dá)框架， 該框架包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、環(huán)狀RNA插入酶切位點。本框架可以 成功地使目標(biāo)RNA分子發(fā)生特定位點的環(huán)化，使用者可以直接將需要環(huán)化的基因的線性核 苷酸序列通過酶切位點直接連接到表達(dá)框架中，通過載體導(dǎo)入細(xì)胞中就可以獲得目標(biāo)環(huán)狀 RNA分子。本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架為廣大科研工作者提供了一種有效表達(dá) 環(huán)狀RNA的工具。此外，將本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架構(gòu)建到特定的真核表達(dá) 載體中，載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以在細(xì)胞內(nèi)通過RNA剪接形成環(huán)狀的RNA分子，為環(huán)狀RNA的 生物學(xué)功能研究提供一種不可缺少的技術(shù)方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的組成示意圖。
[0034] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖。
[0035] 圖3是含有根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的真核表達(dá)載體的圖譜。
[0036] 圖4是根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的熒光定量檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不限于此。
[0038] 實施例：構(gòu)建環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架
[0039] 一、設(shè)計環(huán)狀RNA人工討表汰框架
[0040] 本發(fā)明設(shè)計環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架包括上游框架序列、填充序列、環(huán)狀RNA插入 酶切位點、下游框架序列。該框架的組成示意圖如圖1所示。該框架的堿基序列如SEQID NO. 1所示。其中，該框架的堿基序列中，第1~492bp為上游框架序列（堿基長度共492bp)， 第493~635bp為框架填充（stuffer)序列（堿基長度共143bp)，第636~1017bp為下游 框架序列（喊基長度共382bp)，第1~6bp、487~492bp、636~641bp、1012~1017bp依 次為酶切位點（NheI、KpnI、BamHI、XhoI)。
[0041] 二、環(huán)狀RNA人工討表汰框架序列的獲得
[0042] 根據(jù)上述環(huán)狀RNA人工過表達(dá)框架的設(shè)計方案，通過設(shè)計擴(kuò)增引物，以人的 HEK293細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用分段PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增過表達(dá)框架的上游框架序 列、下游框架序列，及填充序列共1017BP，在全長序列兩端分別添加NheI、Xh〇I酶切位點序 列，方便將整個過表達(dá)框架連接到質(zhì)粒載體中；在填充序列兩端分別添加KpnI和BamHI酶 切位點序列，用于連接所要研究的目標(biāo)環(huán)狀RNA的核苷酸序列。
[0043] 具體的實施方案如下：
[0044] 1、設(shè)計PCR擴(kuò)增引物如下（分3段擴(kuò)增引物設(shè)計）：
[0045] (1)第一段擴(kuò)增上游框架引物
[0046] Up-F:5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA 3'（SEQ ID NO. 2)
[0047] Up-R:5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'（SEQ ID NO. 3)
[0048] 第一段擴(kuò)增大小為505bp ;
[0049] (2)第二段擴(kuò)增填充序列引物
[0050] stuffer-F:5'GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC3'(SEQIDNO. 4)
[0051] stuffer-R:5'TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'（SEQIDNO. 5)
[0052] 中間端擴(kuò)增填充序列，擴(kuò)增大小為169bp ;
[0053] (3)第三段擴(kuò)增下游游框架引物
[0054] Down-F:5'TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'（SEQIDNO. 6)
[0055] Down-R:5'GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'（SEQIDNO. 7)
[0056] 第一段擴(kuò)增大小為396bp。
[0057] 2、PCR擴(kuò)增環(huán)狀RNA過表達(dá)框架
[0058] 用上述引物配合如下反應(yīng)體系：第一輪PCR為20yl總體系，PCR分別擴(kuò)增：具 體是2