一種人2號染色體新型快速fish探針的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人2號染色體新型快速FISH探針的制備方法及其應用的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]焚光原位雜交(FISH,fluorescence in situ hybridizat1n)是一項在體外直接觀察細胞中特定核酸的技術。根據(jù)堿基互補配對的原則，特定的DNA序列與細胞內(nèi)的目標序列互補結合。由于探針帶有熒光，在合適的激發(fā)光照射下，雜交探針及目標DNA能夠在熒光顯微鏡下被清楚地觀察到，是一種直觀有效的檢測方法。
[0003]由于傳統(tǒng)FISH探針序列的長度較大，導致所需要的雜交時間很長(一般是過夜雜16-18小時)，不能及時的得到檢測結果，這不利于臨床的診斷及治療。對FISH探針進行改進，縮短雜交時間，提尚檢測效率，有利于臨床的診斷及治療。
[0004]有必要研究出一種新型快速FISH探針的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種人2號染色體新型快速FISH探針的制備方法及其應用。
[0006]本發(fā)明所采取的技術方案是:
人2號染色體新型快速FISH探針，包括FISH熒光探針，緩沖液和染色液，其中，2號染色體特異性探針的序列為:
探針 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探針 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探針 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探針 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探針 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探針 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探針 7: GTGTTGAAGCATTCTTTTGA
上述檢測試劑盒中的使用的探針中，2號染色體特異性探針連接的熒光基團為綠色熒光基團。
[0007]上述探針是在染色體上重復性高，特異性好的短序列。
[0008]上述探針所用緩沖液為:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10%?30%甲酰胺。
[0009]上述探針的雜交溫度為42°C，雜交時間為20分鐘。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明試劑盒，采用優(yōu)化的短序列熒光探針，將原有的FISH檢測時間由16?18小時縮短至I?2小時，可以快速、準確地檢測出人2號染色體，對未來染色體異?？焖贆z測方法的探究起指示性作用。
【附圖說明】
[0011]圖1是人2號染色體經(jīng)本試劑盒熒光探針染色后的檢驗結果。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:
一、人2號染色體新型快速FISH探針，包括FISH熒光探針，緩沖液和染色液，其中，人2號染色體特異性探針的序列如下，
探針 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探針 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探針 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探針 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探針 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探針 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探針 7: GTGTTGAAGCATTCTTTTGA
其中，人2號染色體特異性探針連接的熒光基團為綠色熒光基團。該探針是在染色體上重復性高，特異性好的短序列。
[0013]實驗時，加入10ul的緩沖液溶解探針干粉，緩沖液的成分為:20mM?50mMTris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10% ?30% 甲酰胺。
[0014]上述探針的雜交溫度為42°C，雜交時間為20分鐘。
[0015]二、FISH 檢測:
1.羊水樣本處理
1)取彡5ml羊水轉(zhuǎn)移到15ml的離心管(標記)中，2000rpm室溫離心10分鐘；
2)觀察并記錄沉淀情況，上清(約4ml)轉(zhuǎn)移到新15ml離心管(標記)，置4°C冰箱中保存；
3)沉淀加入5mlIxPBS并混勻，2000rpm室溫離心10分鐘，棄上清，管底留約Iml ；
4)加入5ml的0.05%胰酶溶液，反復吹打混勻，37°C放置5_10分鐘，2000rpm室溫離心10分鐘，棄上清，管底留約Iml ;
5)加入5ml0.075M KCl，反復吹打混勻，37°C孵育20分鐘；
6)緩慢貼壁加入Iml的固定液，室溫孵育5分鐘，2000rpm室溫離心10分鐘，棄上清至約 Iml ；
7)沉淀吹打混勻，緩慢加入Iml固定液，輕柔吹打混勻。再加入5ml的固定液，放入-20°C冰箱中至少I小時以上；
8)2000rpm室溫離心10分鐘，盡可能吸盡上清；
2.滴片
I)視細胞沉淀量酌情加入固定液，吹打混勻，滴于(3ul懸液)準備好的干燥玻片上，自然晾干后于光鏡下觀察細胞密度，10倍鏡下每一視野內(nèi)細胞數(shù)不少于100個，根據(jù)鏡檢結果用新鮮固定液調(diào)整細胞懸液濃度，重新滴片備用； 2)室溫下過夜老化或60°C熱臺烘烤30分鐘老化備用；
3.雜交前處理
1)取出玻片，放入IXPBS室溫洗滌3分鐘；
2)取出玻片，放入1%多聚甲醛/PBS室溫固定10分鐘；
3)取出玻片，放入室溫IXPBS中3分鐘；
4)取出玻片，放入另一缸室溫IXPBS中3分鐘；
5)取出玻片，再將其依次放入室溫70%，90%，100%梯度乙醇脫水各2分鐘；
6)取出玻片，室溫晾干。
[0016]4.雜交
I)從_20°C冰箱中取出探針干粉，震蕩混勻，瞬時離心；加入10ul的緩沖液，混勻后作為雜交液。
[0017]2)加10 μ I的雜交液(含人2號染色體探針)到雜交區(qū)域，迅速蓋上22 X 22mm蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡；
3)用橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片與載玻片接觸的邊緣；
4)將玻片放入雜交儀中，濕潤原位雜交儀濕度條，插入濕條，蓋上雜交儀上蓋，設置“Denat&Hyb”程序，變性85°C:10分鐘，雜交42°C:20分鐘。
[0018]5.雜交后處理
1)將玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片(若蓋玻片難以去除，可以將其放入洗液I中微微搖晃，以利于其脫落)；
2)玻片放入洗液中室溫孵育5分鐘；
3)取出玻片，再將其放入洗液中室溫孵育2分鐘；
4)取出玻片，自然干燥玻片；
6.鏡檢
相關熒光和DAPI需用合適的濾塊觀察；其中，2號染色體探針顯示為綠色信號。
[0019]注意事項:FISH檢測第4-6步需避光操作。
[0020]三、檢測結果:
鏡檢結果如圖1所示。從圖中可以看出，本發(fā)明的檢測試劑盒中所使用的探針可以與目的序列快速穩(wěn)定的結合，產(chǎn)生熒光信號，檢測結果準確可靠，同時大大縮短了人2號染色體熒光檢測時間。
【主權項】
1.一種人2號染色體新型快速FISH探針的制備方法及其應用，通過NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索并下載人2號染色體的序列，在染色體著絲粒上找到重復性高，特異性好的序列作為人2號染色體的特異性探針，其中，人2號染色體特異性探針的序列如下， 探針 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探針 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探針 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探針 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探針 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探針 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探針 7:GTGTTGAAGCATTCTTTTGA。2.根據(jù)權利要求1所述的人2號染色體新型快速FISH探針，其特征在于'2號染色體特異性探針連接的熒光基團為綠色熒光基團。3.根據(jù)權利要求1，2所述的人2號染色體新型快速FISH探針，其特征在于:探針是在染色體上重復性高，特異性好的短序列。4.根據(jù)權利要求1，2，3所述的人2號染色體新型快速FISH探針，其特征在于'2號染色體特異性探針所用緩沖液為:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0?8.8)，1mM MgCl2,10%?30%甲酰胺。5.根據(jù)權利要求1，2，3，4所述的人2號染色體新型快速FISH探針，其特征在于:2號染色體特異性探針的雜交溫度為42°C，雜交時間為20分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人2號染色體新型快速FISH探針的制備方法及其應用，用這種方法制備的人2號染色體特異性探針進行試驗，試驗結果表明，這種新型快速FISH探針能夠在較短時間內(nèi)準確地與人2號染色體進行定位，對未來染色體異?？焖贆z測方法的探究起指示性作用。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105087561
【申請?zhí)枴緾N201510498574
【發(fā)明人】陳華云, 劉淑園, 陳嘉昌, 丁渭, 肖湘文, 黃爽, 曾燁, 劉孝禮, 方鳳銀
【申請人】廣州和實生物技術有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月14日