應(yīng)體系:25 μ?
緩沖液(10 X PCR)2.5 μ?
VA toxR-V (10 Mmol/L)0.2 μ?
VAtoxR-R (10 Mmol/L)0.2 μ?
VP col -F (10 Mmol/L)0.4 μ?
VPcol -R (10 Mmol/L)0.4 μ?
VVvvM-F (10 Mmol/L)0.4 μ?
VVvvM-R (10 Mmol/L)0.4 μ?
16S -F (10 Mmol/L)0.4 μ?
16S-R (10 Mmol/L)0.4 μ?
MgCl2 (25 mM)1.5 μ?
dNTP(10 mM)2 μ?
Taq DNA 聚合酶(5 U/μΙ)0.2 μ?
DNA模板I μ? ddH2015μ1
(4) PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下:
94 0C 8 min ； [94 °C 40s, 65 °C (每循環(huán)降低 0.5°C) 25 s, 72 °C I min，20 個循環(huán)];[94 0C 40s, 55 °C 25s, 72 °C I min, 20 個循環(huán)];72 °C 8 min。
[0016]實施例2:
(1)以溶藻弧菌陽性樣本DNA、溶藻弧菌陰性樣本DNA、副溶血性弧菌陽性樣本DNAjiJ傷弧菌陽性樣本DNA、溶藻弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌陽性樣本DNA組、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌陽性樣本DNA組、溶藻弧菌和副溶血性弧菌陽性樣本DNA、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌陽性樣本DNA組為模板
(2)方法同實施例1(2)。
[0017](3)方法同實施例1 (3)。
[0018](4)方法同實施例1 (4)。
[0019]實施例3:
(I)以市售試劑盒檢測溶藻弧菌陽性樣本、副溶血性弧菌陽性樣本和創(chuàng)傷弧菌陽性樣本為模板(共10例)。
[0020](2 )方法同實施例1(2)。
[0021](3)方法同實施例1 (3)。
[0022](4)方法同實施例1 (4)。
[0023]實施例1結(jié)果如圖1所示，圖1為建立的多重降落PCR的特異性檢測結(jié)果；泳道I 一 9模板依次對應(yīng)為:大腸埃希氏菌(fccAericAia coW)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus')、肺炎鏈球菌(Strep tococcus pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseuckmonss aeruginosa)^ 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動桿菌i Acine tobac ter baumannii')、_腸王求菌(terococcus faecalis)、費希爾弧菌(Vibr1/iscAeri)、哈維氏弧菌(Vibr1 AsrKeja.);泳道10為:DL1000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道11為:陽性對照。
[0024]圖2為實施例29例模擬樣品檢測結(jié)果；泳道I 一 8模板為模擬樣品基因組DNA，泳道I于246 bp,598 bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出溶藻弧菌；泳道2于598 bp處出現(xiàn)I條對應(yīng)大小的條帶，判為陰性結(jié)果；泳道3于349 bp、598 bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出副溶血性弧菌；泳道4于598 bp、740bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出創(chuàng)傷弧菌；泳道5于246 bp、349bp、598 bp、740bp處出現(xiàn)4條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出溶藻弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌；泳道6于349bp、598 bp、740bp處出現(xiàn)3條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌；泳道7于246 bp、349bp、598 bp處出現(xiàn)3條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出溶藻弧菌和副溶血性弧菌；泳道8于246 bp、598bp、740bp處出現(xiàn)3條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌；泳道9為DL1000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道10為陽性對照。
[0025]圖3為實施例310例臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果:泳道I 一 10模板為相應(yīng)臨床標(biāo)本基因組DNA，泳道1、4、6、8、10均于598 bp處出現(xiàn)I條對應(yīng)大小的條帶，判為陰性結(jié)果；泳道2于598 bp、740bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出創(chuàng)傷弧菌；泳道3于246 bp,598bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出溶藻弧菌；泳道5、7、9于均349bp、598 bp處出現(xiàn)2條對應(yīng)大小的條帶，判為檢出副溶血性弧菌；泳道11為DLlOOO DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道12為陽性對照。
[0026]由以上實施例1、2、3可以看出，本實驗建立的多重降落PCR特異性好，準(zhǔn)確度高，可以適用于臨床實驗。
【主權(quán)項】
1.一種檢測溶藻弧菌、副溶血性弧菌及創(chuàng)傷弧菌多重降落PCR檢測方法，其特征在于，由以下步驟制備而成: 取待檢樣本于0.5ml堿性蛋白胨水中37°C培養(yǎng)6h，取液體300μ1，4000rmp離心，留取沉淀加入50μ1無菌水，震蕩15秒鐘，置100°C沸水中煮沸l(wèi)Omin，冰上放置3?5分鐘，.1，3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液約30μ1即為DNA提取液； 取下列濃度及體積的組分混合成25μ1的反應(yīng)體系: 緩沖液 1XPCR2.5 μ? ； VA toxR-V 10 MmoI/L0.2 μ? ； VAtoxR-R 10 Mmol/L0.2 μ? ； VP col -F 10 MmoI/L0.4 μ? ； VPcol -R 10 MmoI/L0.4 μ? ； VVvvM-F 10 Mmol/L0.4 μ? ； VVvvM-R 10 Mmol/L0.4 μ? ； 16S -F 10 MmoI/L0.4 μ? ； 16S -R 10 MmoI/L0.4 μ? ； MgCl225 mM1.5 μ? ； dNTP10 mM2 μ? ； Taq DNA 聚合酶 5 U/μΙ0.2 μ? ； DNA 模板I μ? ； ddH2015μ1 ； 進行PCR循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)如下: . 94 °C 8 min ；94 °C 40s, 65 °C:每循環(huán)降低 0.5°C，25 s, 72 °C I min，20個循環(huán)；.94 °C 40s, 55 °C 25s, 72 °C I min, 20 個循環(huán)；72 °C 8 min ； 電泳檢測鑒定: 對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，如電泳圖中含有740 bp,598 bp,349 bp和246bp條帶，其中740 bp, 349 bp和246 bp分別代表檢出創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌，.598 bp則代表提取出有效的模板； 所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； 所述VA toxR-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； 所述VPcol-V的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示； 所述VP col-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示； 所述VV vvhA-￥的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示； 所述VV vvhA-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示； 所述7_參-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示； 所述7_參-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可快速特異檢測溶藻弧菌(<i>VA</i>)、副溶血性弧菌(<i>VP</i>)及創(chuàng)傷弧菌(<i>VV</i>)的多重降落PCR檢測及方法。它包括：10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP，<i>Taq</i>？DNA聚合酶，創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌及16S內(nèi)參陽性對照DNA，4對特異性引物及增菌所需的堿性蛋白胨水；本發(fā)明所建立的多重降落PCR可克服常規(guī)培養(yǎng)的耗時長、靈敏度低等問題，具有快速、簡便、特異、靈敏度高等特征?？捎诋?dāng)天出檢測結(jié)果報告，可同時檢測3種臨床常見的海洋性弧菌，對創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌及溶藻弧菌的檢測下限分別為2×103CFU/μl、5.3×104CFU/μl、6.6×104CFU/μl。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/63
【公開號】CN105039562
【申請?zhí)枴緾N201510491816
【發(fā)明人】胡成進, 侯亞蘭, 甘宜梧, 譚柏清
【申請人】胡成進
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月12日