一種低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)前診斷是優(yōu)生學(xué)的重要組成部分，它是建立在遺傳咨詢基礎(chǔ)上通過產(chǎn)前檢測胎 兒健康情況，對患有嚴(yán)重遺傳病、先天畸形的患兒可以及早采取措施，減少人群中有害基因 積累，以減少患兒出生，提高人口素質(zhì)，因此具有十分重要的意義。產(chǎn)前診斷目前主要有孕 早期絨毛組織取材、孕中期羊水和臍帶血、孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞及植入前診斷等方法， 但孕中期羊水細(xì)胞檢查仍是最主要的診斷方法。
[0003] 羊水穿刺檢查的合適對象為高齡（大于34歲）、不良接觸史、既往畸胎弱智分娩 史、既往染色體異常兒分娩史、夫妻之一核型異常、B超示畸型、家族性連鎖遺傳病史、近親 婚配等的孕婦。其中，高齡孕婦是主要檢查對象。羊水細(xì)胞培養(yǎng)后通過染色體顯帶技術(shù)，能 夠辨別三體綜合癥、平衡易位、倒位以及性染色體異常等染色體方面的疾病。成功的羊水細(xì) 胞培養(yǎng)，除需要嚴(yán)格的實驗操作技術(shù)和經(jīng)驗外，培養(yǎng)基的組成也是非常關(guān)鍵的。羊水細(xì)胞可 能是胎兒皮膚、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脫落的細(xì)胞，其中只有小部分是有活力的細(xì) 胞（約0.1%)，而活力細(xì)胞又以貼壁型細(xì)胞為主。如何能促其在體外培養(yǎng)中貼壁增殖，是 成功培養(yǎng)羊水細(xì)胞的關(guān)鍵因素。
[0004] 傳統(tǒng)的羊水培養(yǎng)基組成是：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RPMI1640、DMEM或F12) +小牛血清（胎牛 血清）。但這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的成功率低，成功率低于30%，而且平均培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)周 期需要20天，且分裂相少，不能有效用于羊水細(xì)胞檢查；為了縮短羊水細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高 成功率，已有了改良型的培養(yǎng)基的研究報道，基本上是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加含有生 長因子的提取物組成。如ChangHC提供的配方如下：
[0005] 在DMEM與F12按1 :1混合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12)中添加10種促生長因 子，分別為：轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin) 5mg/L、亞硒酸鈉20nMol/L、胰島素（insulin) 10mg/ L、三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine)O.InMol/L、胰高血糖素（glucagon)lmg/L、堿 性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF) 10ug/L、氫化可的松（hydrocortisone)InMol/L、睪酮 (testosterone)InMol/L、雌二醇（estradiol)InMol/L、孕酮（progesterone)lnMol/L〇 ChangHC把含此10種促生長因子配方的培養(yǎng)基稱為H培養(yǎng)基，而將此10種促生長因子含 量增倍后的培養(yǎng)基稱為H-1培養(yǎng)基。生長因子加倍的H-1培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果要明顯好于H 培養(yǎng)基，H-1在培養(yǎng)基添加較低含量的胎牛血清的情況下，依然能夠顯著增加羊水細(xì)胞的克 隆形成率和克隆生長速度，使培養(yǎng)成功率達(dá)到99%以上。
[0006] 按ChangHC配制的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基在實際運用上依然存在克隆數(shù)目較低、克隆增 殖較慢、收獲的分裂相細(xì)胞仍較少等問題。當(dāng)種植的羊水樣品狀況不佳時，無法在短期內(nèi) 生成足夠的分裂相細(xì)胞，與臨床檢驗單位的需求仍有一定差距。
[0007] 中國專利申請CN101705207B公開了一種羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，該專利申請通過在 H-1培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同種類的抗氧化劑組合，從而能促進(jìn)羊水細(xì)胞的增殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種在低血清含量（1% )的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基新配方，相比 現(xiàn)有公開文獻(xiàn)報道的配方配制的培養(yǎng)基，能更迅速有效地增加體外增殖的羊水細(xì)胞克隆數(shù) 目和細(xì)胞增殖速度，縮短培養(yǎng)周期，獲得更多的分裂相染色體數(shù)目且成本更低。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI1640/ aMEM按1 :1混合的基礎(chǔ)上，添加包括以下組分：胰島素（Insulin)、堿性成纖維細(xì) 胞生長因子（bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子（EGF)、牛血清白蛋白（BSA)、氫化可的松 (hydrocortisone)、a生育酸（AlphaTocopherol)、NaHC03、朽1 檬酸鐵、吐溫8〇(Tween8〇)、 乙醇胺、油酸、亞油酸以及胎牛血清。
[0010] 所述胎牛血清添加含量占低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基總體積不超過1 %。
[0011] 優(yōu)選地，所述低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基各組分含量如下：
[0012] RPMI1640培養(yǎng)基干粉 5,Qg/L： a:M:EM培養(yǎng)基干務(wù) 5. ：l：g/L IaHC：〇3 2.Qg/L
[0013] 檸檬酸鐵 5mg/L 重組人膜島素（.Insulin) lOrng/L 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF) 30ug/L 重組人表皮細(xì)胞生長因子（BGF) lOug/L 牛血清白蛋白（BSa> 2. 0g/L 氛化可的松（hydrocortisone) 2nMol/L G生育酚（AlphaTocopheroL) Img/L 乙醇胺 Img/L 油酸 lmg/L 亞油酸 lmg/L 吐溫 80(Tween80) 0,5ml 胎牛血清（FBS) 10ml
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基可用于產(chǎn)前診斷的貼壁型羊水細(xì)胞生 長。
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 1、本發(fā)明的多次試驗改進(jìn)羊水細(xì)胞培養(yǎng)基各組分及其含量最終配制而成，獲得出 乎意料的效果，相比現(xiàn)有公開技術(shù)，效果有顯著改進(jìn)，克隆形成率和克隆生長速度明顯增 加，在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，可以培養(yǎng)得到比現(xiàn)有培養(yǎng)基多2~3倍數(shù)量的處于分裂期的羊水 細(xì)胞，能夠滿足臨床診斷和科研的要求，其次本發(fā)明各組分改進(jìn)后大大降低了胎牛血清含 量，進(jìn)而可獲得較高純度的羊水細(xì)胞，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。
[0017] 2、本發(fā)明提供的各組分確定的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基相比現(xiàn)有公開技術(shù)，降低了胎牛血 清含量，降低了成本，有利于規(guī)?；瘧?yīng)用。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
[0019] 實施例：配制本發(fā)明低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（代號HN-1):
[0020] 取RPMI1640培養(yǎng)基干粉5. 0g、a MEM培養(yǎng)基干粉5. lg，用950ml的超純水溶解后， 添加NaHC03 2. 0g、檸檬酸鐵5mg、重組人胰島素（Insulin) 10mg、重組人堿性成纖維細(xì)胞生 長因子（bFGF)30ug、重組人表皮細(xì)胞生長因子（EGF)lOug、牛血清白蛋白（BSA)2.0g、氫化 可的松（hydrocortisone)2nMol、a生育酸（Alpha Tocopherol) lmg、乙醇胺lmg、油酸、亞 油酸各lmg，其后加吐溫80 (Tween 80)0. 5ml、胎牛血清（FBS) 10ml，混勾后加超純水定容至 1000ml，即為HN-1羊水