一種利用酶制備葡磷酰胺及其類(lèi)似物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物生物合成領(lǐng)域，具體涉及利用酶制備葡磷酰胺及其類(lèi)似物的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是人類(lèi)健康的嚴(yán)重威脅，在癌癥治療中，需要用到更多的毒副作用小而療效 好的化學(xué)藥物，氮芥、鬼白毒素及磷酸二酰胺等都屬于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞毒素，但有的因毒性 太大，有的難以進(jìn)入癌細(xì)胞，從而影響療效。異磷酰胺氮芥（Isophosphormidemustard、IPM 帕利伐米、N，N' -雙-(2-氯乙基）磷酸二酰胺）為環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺的代謝物，有抗 腫瘤活性，但嘗試直接使用IPM作為抗癌藥，沒(méi)有成功，因?yàn)镮PM不穩(wěn)定，不能將單體用于人 體治療。IPM結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] 專(zhuān)利US5622936描述了IPM和單糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖多聚半乳糖、多聚糖 等的反應(yīng)，首先糖基保護(hù)后和IPM反應(yīng)，再脫保護(hù)，成糖苷，如葡磷酰胺、半乳糖-IPM、甘露 糖-IPM、多聚糖-IPM。但合成產(chǎn)物純度不高，一般為含有異構(gòu)體的混合物。在生物、醫(yī)藥等 對(duì)異構(gòu)體純度要求較高的領(lǐng)域受到嚴(yán)重地限制。其披露的反應(yīng)歷程如下：

[0008] 葡磷酰胺（Glc-P-IPM)的化學(xué)合成方法
[0009] 但是目前未見(jiàn)利用酶法制備葡磷酰胺及其類(lèi)似物的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種葡磷酰胺及其類(lèi)似物的制備方法，是針對(duì)上述現(xiàn)有技 術(shù)中存在的問(wèn)題而進(jìn)行的，用以提高反應(yīng)收率，得到構(gòu)型單一的化合物。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0012] -種利用酶制備葡磷酰胺及其類(lèi)似物的方法，所述方法的合成路線(xiàn)如下：
[0013]
[0014] 其中，R1J2相同或不同，各自獨(dú)立地表示H、未經(jīng)取代的C^C4的烷基或鹵素，優(yōu) 選R1、R2各自獨(dú)立地表示氯、溴或碘。
[0015] 其中，所述糖來(lái)源于P-D-葡萄糖、P-D-半乳糖、P-D-甘露糖、P-L-阿拉伯糖 或低聚糖等，所述低聚糖包括低聚半乳糖等。
[0016] 其中，所述糖苷酶選自P-D-葡萄糖苷酶、P-D-半乳糖苷酶、P-D-甘露糖苷酶或 P-L-阿拉伯糖苷酶等。
[0017]進(jìn)一步地，所述P-D-葡萄糖苷酶來(lái)源于米曲霉（Aspergillusoryzae)、檜 狀青霉（Penicilliumpiceum);所述0-D-半乳糖苷酶來(lái)源于細(xì)菌中的環(huán)狀芽孢桿 菌（B.circulans)、宋氏志賀氏菌（Shigellasonne)、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)、乳酸菌（Lactobacillus)、大腸桿菌（Escherichiacoli)、黃青霉 (P.chrysogenum)、霉菌中的米曲霉（Aspergillusoryzae)、黑曲霉（A.Niger);熱帶假絲 酵母（Candidatropicalis);放線(xiàn)菌中的天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor)、酵母中的脆壁克 魯維酵母（Kluyveromycesfragilis)和乳酸克魯維酵母（K.Iactis);所述P-D-甘露糖 苷酶來(lái)源于古細(xì)菌熱泉高溫神袍菌（Thermotogathermarum)、多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron) -L-阿拉伯糖苷酶來(lái)源于灰略紅鏈酶菌（Streptomycesgriseus)。
[0018] 具體而言，本發(fā)明所述的方法可包括如下步驟：
[0019] (1)按重量份計(jì)，將化合物I和化合物II按5~6 :2混合，并向其中加入磷酸二氫 鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液；
[0020] (2)向步驟⑴所得溶液中加入相應(yīng)的糖苷酶，并置于10~30°C水浴中開(kāi)始反 應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后超濾機(jī)超濾出酶成分，濃縮超濾液，純化產(chǎn)物，即得葡磷酰胺及其類(lèi)似物。
[0021] 本發(fā)明所述的上述方法，其中，糖苷酶的加入量為相當(dāng)于化合物II(如IPM)的用 量比為1:10~20。
[0022] 其中，磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉緩沖溶液的加入量為使化合物II的質(zhì)量體積比濃 度為20% -40% (以g/ml計(jì)），所述緩沖溶液的pH值優(yōu)選為6. 0-7. 5。
[0023] 上述糖苷酶反應(yīng)可以在10~30°C范圍內(nèi)進(jìn)行，當(dāng)使用熱穩(wěn)定的糖苷酶時(shí)，可以在 更高的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。優(yōu)選在15~25°C反應(yīng)10~20h，更優(yōu)選的，所述酶成糖苷反應(yīng)的 反應(yīng)溫度為20~25°C，反應(yīng)時(shí)間為15~18h。
[0024] 作為本發(fā)明的另一種技術(shù)方案，上述糖苷酶反應(yīng)（步驟2)可以在含有糖苷酶的緩 沖溶液內(nèi)進(jìn)行，所述糖苷酶由相應(yīng)酶菌發(fā)酵得到的含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液提供（緩沖溶液 加入含糖苷酶的菌體細(xì)胞，所述含酶菌體細(xì)胞由糖苷酶菌產(chǎn)生菌發(fā)酵得到），優(yōu)選所述緩沖 溶液的pH為6. 0~7. 5。
[0025] 優(yōu)選的，所述含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液通過(guò)下述步驟得到：
[0026] (1)對(duì)糖苷酶產(chǎn)生菌進(jìn)行種子培養(yǎng)，得到種子菌種；
[0027] (2)采用發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)種子菌種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，得到含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液。
[0028] 其中，糖苷酶產(chǎn)生菌的菌株需要先用斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)獲得活化菌種，活 化菌種再經(jīng)種子培養(yǎng)獲得種子菌種，再將種子菌種接入到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。 上述斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0029] 優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基按g/L計(jì)，包括：乳糖5~15,蛋白胨1~10,酵母提取物 5 ~15,NaCl2 ~6,X-gal0? 025 ~0? 045,pH6. 5 ~7. 5,瓊脂 15 ~25。
[0030] 發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計(jì)，包括：乳糖5~15,蛋白胨1~10,酵母提取物5~15,氯 化鈣0. 5~1. 5,硫酸錳0. 0005~0. 001，硫酸鎂0. 2~0. 4,磷酸二氫鉀0. 01~0. 1，硫酸 亞鐵 0? 01 ~0? 1，pH6. 5 ~7. 5。
[0031] 上述培養(yǎng)基中，所涉及的所有原料均為已知的市售產(chǎn)品。
[0032] 上述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度可以為15~60°C，搖床轉(zhuǎn)速可以為150~200r/ min，培養(yǎng)時(shí)間可以為5~20h。
[0033] 上述緩沖溶液可以為質(zhì)量濃度為0. 2~0. 4%的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩 沖溶液中還包括體積分?jǐn)?shù)為1 %~5%的乙醇，其中乙醇作為助溶劑，有利于提高化合物II 的溶解性。當(dāng)本發(fā)明采用以發(fā)酵液的形式提供糖苷酶時(shí)，發(fā)酵液的用量可依據(jù)其中糖苷酶 的含量給出，以最終使糖苷酶的加入量為相當(dāng)于化合物II(如IPM)的用量比為1:10~20。
[0034] 本發(fā)明所述的方法，在酶反應(yīng)制備生成產(chǎn)物糖苷后，還需要對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離純 化，所述分離純化方法如下：在糖苷反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)柱層析分離純化得到粗品，粗品經(jīng)重結(jié)晶 獲得高純度的產(chǎn)物糖苷，具體的分離操作為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，本發(fā)明對(duì)此不作特別 限定。
[0035] 利用本發(fā)明的方法制備葡磷酰胺及其類(lèi)似物時(shí)，由于不使用有機(jī)溶劑，因此能夠 減少高溫反應(yīng)時(shí)有機(jī)溶劑的爆炸風(fēng)險(xiǎn)，由于不使用含重金屬的催化劑，因此減少了重金屬 的危害。另外，由于利用酶進(jìn)彳丁專(zhuān)屬化成昔反應(yīng)，能提尚成品的構(gòu)型選擇性，從而提尚反應(yīng) 收率，減少雜質(zhì)的生成。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面基于具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的葡磷酰胺及其類(lèi)似物的制備方法，但本發(fā) 明并不被限制于所列舉的實(shí)施例。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中使用的原料P-D-葡萄糖、 0 -D-半乳糖、P-D-甘露糖、P-L-阿拉伯糖或低聚糖等購(gòu)自Sigma公司，糖苷化反應(yīng)酶 (0 -葡萄糖苷酶、P-D-半乳糖苷酶、P-甘露糖苷酶、P-L-阿拉伯糖苷酶）所用到的微 生物購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，IPM購(gòu)自Syngene公司。高效液相色譜儀為 島津公司所制造，型號(hào)為L(zhǎng)C-20A。
[0037] 本發(fā)明所述的方法可具體為（實(shí)施方式之一）：將IPM及其類(lèi)似物和所用糖加 入含酶菌體細(xì)胞（或直接加入糖苷酶）的緩沖溶液中，含酶菌體細(xì)胞可由按本發(fā)明所述 方法得到的含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液提供，采用高效液相色譜（HighPerformanceLiquid Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC)跟蹤轉(zhuǎn)化率，得到含有產(chǎn)物的反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后，超濾機(jī)超 濾，濃縮（溫度不超過(guò)30°C)，采用柱層析進(jìn)行過(guò)柱分離，收集含糖苷類(lèi)組分，濃縮（溫度不 超過(guò)30°C)，得到產(chǎn)物糖苷的粗品，粗品經(jīng)重結(jié)晶后得到產(chǎn)物，采用氫譜、碳譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行 檢測(cè)，確認(rèn)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并計(jì)算含量和摩爾收率。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例涉及一種利用酶制備P-D-葡磷酰胺的方法。
[0040] 具體步驟如下：
[0041] (1)稱(chēng)取IOg的IPM和25g的P-D-葡萄糖，加入濃度為0. 3%的磷酸二氫鈉-磷 酸氫二鈉緩沖溶液（PH6. 0)使IPM的質(zhì)量體積濃度為20% (以g/ml計(jì)）；
[0042] (2)向步驟（1)所得溶液中加入相當(dāng)于IPM0. 05倍量的P-D-葡萄糖苷酶，并置于 20~30°C水浴中開(kāi)始反應(yīng)，然后每隔4h取樣一次，當(dāng)P-D-葡萄糖含量為5%以下時(shí)，停 止反應(yīng)，超濾機(jī)超濾出酶成分，濃縮濾液，純化產(chǎn)物，經(jīng)驗(yàn)證核實(shí)，所得產(chǎn)物確系P-D-葡磷 酰胺。
[0043] 本實(shí)施例中，P-D-葡磷酰胺的產(chǎn)率為85%，純度為99. 2%。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 本實(shí)施例提供了一種P-D-甘露糖-IPM的合成方法，具體如下：
[0046] (1)稱(chēng)取IOg的IPM和30g的P-D-甘露糖，加入濃度為0? 4%的磷酸二氫鈉-磷 酸氫二鈉緩沖溶液（PH6. 5)使IPM的質(zhì)量體積濃度為25% (以g/ml計(jì)）；
[0047] (2)向步驟（1)所得溶液中加入相當(dāng)于IPM0. 1倍量的P-D-甘露糖苷酶，并置于 20~30°C水浴中開(kāi)始反應(yīng)，然后每隔4h取樣一次，當(dāng)IPM含量為5%以下時(shí)，停止反應(yīng)，超 濾機(jī)超濾出酶成分，濃縮濾液，純化產(chǎn)物，經(jīng)驗(yàn)證核實(shí)，所得產(chǎn)物確系P-D-甘露糖-IPM。
[0048] 本實(shí)施例中，-D-甘露糖-IPM的產(chǎn)率為76 %，純度為99. 4 %。
[0049] 實(shí)施例3
[0050] 本實(shí)施例提供了一種P-D-半乳糖-IPM的合成方法，具體如下：
[0051] (1)稱(chēng)取IOg的IPM和30g的P-D-半乳糖，加入濃度為0? 4%的磷酸二氫鈉-磷 酸氫二鈉緩沖溶液（PH7. 5)使IPM的質(zhì)量體積濃度為40% (以g/ml計(jì)）；
[0052] (2)向步驟（1)所得溶液中加入相當(dāng)于IPM0. 05倍量的P-D-半乳糖苷酶，并置于 20~30°C水浴中開(kāi)始反應(yīng)，然后每隔4h取樣一次，