海洋硫酸酯化糖胺聚糖se-3及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其單糖組分含有甘露糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：乙酰氨基半乳糖：半乳糖：巖藻糖的質(zhì)量比例為1:1.5:0.92:3:1.8:2；該海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量為10kDa至16kDa，硫酸基團(tuán)的含量為10%至14%之間。本發(fā)明還提供了一種相應(yīng)的提取方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提取、純化工藝較簡(jiǎn)單，提取純度好、易于操作，增加脾臟指數(shù)、造血功能活性顯著，安全無毒，對(duì)不良反應(yīng)有抑制作用。
【專利說明】海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從烏賊墨中提取分離純化的具有新穎結(jié)構(gòu)的胺聚糖及其提取方法，尤其涉及一種海洋硫酸酯化糖胺聚糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著復(fù)雜的生物學(xué)功能被不斷揭示，多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、抗腫瘤和調(diào)節(jié)血脂等方面得到了應(yīng)用。海洋生物處于高鹽、高壓寡營養(yǎng)等獨(dú)特的環(huán)境中，使得很多海洋來源的多糖具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物功能，使得開發(fā)海洋多糖資源成為目前海洋藥物學(xué)是研究的一大熱點(diǎn)。
[0003]對(duì)海洋生物多糖研究比較多的集中在了海洋藻類多糖，目前隨著資源的進(jìn)一步開發(fā)，海洋動(dòng)物來源的多糖也越來也受到關(guān)注。鮑魚中含有硫酸化雜多糖，由半乳糖(Gal )、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)和葡萄糖醛酸(GlcUA)組成，含有11%左右的硫酸基，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、改善記憶、抗凝血和抗炎等方面均具有顯著的活性。海參中富含由乙酰氨基半乳糖(Gal-NAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和巖藻糖(Fuc)組成的粘多糖和硫酸酯化的巖藻聚糖對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用和心血管疾病方面均具有保護(hù)作用。
[0004]烏賊又稱墨魚，海洋軟體動(dòng)物，屬頭足類。廣泛分布于我國沿海，尤以浙江省產(chǎn)量最高，是舟山市的四大經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)之一，烏賊墨是烏賊科動(dòng)物墨囊內(nèi)提取物質(zhì)，因其顏色和來源而得名。由細(xì)小黑色顆粒構(gòu)成的粘稠狀的混懸液，蛋白多糖復(fù)合物，含有多種活性成分，具有較高藥用價(jià)值。通常烏賊墨會(huì)作為廢棄物被扔掉，自從日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性后，烏賊墨的研究逐漸與日俱增，很多日本食品企業(yè)也開始將烏賊墨用于食品中。研究表明，蛋白多糖復(fù)合物是 烏賊墨重要的活性成分，也是海洋特征寡糖的一大來源。對(duì)烏賊墨來源的海洋多糖的研究將有助于進(jìn)一步利用烏賊產(chǎn)品加工的廢棄物，變廢為寶，為海洋多糖糖在醫(yī)藥等領(lǐng)域的利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，提高了烏賊的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)值。烏賊墨是烏賊加工過程中的廢棄物，研究表明新鮮烏賊墨中含有水分、色素、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)。烏賊墨也可作為一種中藥，文獻(xiàn)上早有記載?！侗静菔斑z》中有:“腹中墨,主治血刺心痛”。在《本經(jīng)》中有記載:“可收斂止血，固精止帶，制酸定痛，除濕斂瘡”。烏賊墨制劑臨床上主要作為止血?jiǎng)?，治療出血性疾病?功能性子宮出血、胃出血等。中國海洋藥物辭典也收錄了烏賊墨。20世紀(jì)90年代，日本青森產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心和弘前大學(xué)發(fā)現(xiàn)烏賊墨具有抗腫瘤作用，并從中提取得到一種具有高效抗癌活性的多糖一蛋白復(fù)合體，掀起了開發(fā)烏賊墨生物功能的熱潮，目前在日本主要是作為一種保健食品。
[0005]近年來國內(nèi)外對(duì)烏賊墨進(jìn)行了一系列研究和開發(fā)，研究表明烏賊墨具有止血、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等多種生理活性，特別是對(duì)烏賊墨多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)及生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究。對(duì)烏賊墨多糖的研究表明，其多糖部分主要是由等摩爾比的葡萄糖醛酸(GlcUA)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和巖藻糖(Fuc)構(gòu)成的一種全新結(jié)構(gòu)的類糖胺聚糖。該多糖結(jié)構(gòu)特異，含有等比例的酸性糖、堿性糖和六碳甲基糖組成的三糖線性重復(fù)單元，中國海洋大學(xué)的研究人員也從魷魚墨中分離得到類似的但具有分支結(jié)構(gòu)的非硫酸酯化的類糖胺聚糖[―3)-β-GlcA (I — 4)-a-GalNAc (I — 3)-a-Fuc (I — ]/?，山東大學(xué)從無針烏賊墨中分離得到一種主要由巖藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和甘露糖(Man)組成的雜多糖。這些頭足動(dòng)物來源的雜多糖作為一種天然生物活性物質(zhì)，能夠抑制突變，顯著促進(jìn)機(jī)體的粒系造血機(jī)能，抑制S180肉瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)小鼠的特異性免疫和非特異性免疫功能，調(diào)節(jié)機(jī)體血脂代謝，提高機(jī)體抗氧化能力?？删徑猸h(huán)磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能抑制作用烏賊墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致的免疫系統(tǒng)及抗氧化能力損傷具有顯著的拮抗作用和促進(jìn)其快速恢復(fù)的功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種能增加脾臟指數(shù)、造血功能并且對(duì)不良反應(yīng)有抑制作用的海洋硫酸酯化糖胺聚糖及其相應(yīng)的具有提取、純化工藝較簡(jiǎn)單，提取純度好、易于操作的制備方法。
[0007]本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案為:一種海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其單糖組分含有甘露糖:葡萄糖胺:葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:半乳糖:巖藻糖的質(zhì)量比例為1:1.5:0.92:3:1.8:2 ;該海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量為IOkDa至16kDa，硫酸基團(tuán)的含量為10%至14%之間。
[0008]本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制備方法，其包括以下步驟:
1)烏賊墨多糖的提取:取新鮮烏賊墨囊中烏賊墨濃縮后凍干后，采用酶解法處理后，沉淀烘干，再重新溶解后 使用截留分子量為3500的透析袋對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析脫鹽和除去小分子物質(zhì)，得到烏賊墨多糖；
2)分離純化:采用離子交換層析柱依次采用0.05mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液三個(gè)梯度濃度的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集0.01至0.1 mol/L,0.1至0.5 mol/L、0.2至I mol/L的NaCl溶液洗脫，并收集0.2至I mol/L的NaCl溶液洗脫產(chǎn)物；洗脫產(chǎn)物分子量為IOkDa至16kDa。
[0009]梯度洗脫的截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500，流速為0.5至3 mL/min。
[0010]酶解法為兩步酶解法，具體為按料液質(zhì)量體積比1:10至1:30加入蒸餾水，40°C下磁力攪拌2 h，使墨汁均勻分散后首先采用木瓜蛋白酶提取3 h，加酶量2%，提取溫度60°C，pH 7，接著采用胰蛋白酶水解3 h，提取溫度60°C，pH 10，加酶量0.5%。提取完后調(diào)pH至中性后100°C水浴加熱15 min滅酶。最后調(diào)節(jié)pH至弱酸性，靜置使黑色素沉淀后6000 rpm離心15 min,取上清調(diào)節(jié)pH至中性后濃縮至原體積的1/20，使用終濃度為80%的乙醇進(jìn)行沉淀。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:提取、純化工藝較簡(jiǎn)單，提取純度好、易于操作，增加脾臟指數(shù)、造血功能活性顯著，安全無毒，對(duì)不良反應(yīng)有抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明實(shí)施例烏賊墨多糖Q sepharose Fast Flow梯度洗脫硫酸苯酹檢測(cè)圖，其中橫軸為接收試管數(shù)，縱向軸是490nm吸光度；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例SE-3的PMP柱前衍生液相色譜圖，其中橫軸為洗脫時(shí)間(min)，縱向軸是245nm吸光度(mAU)；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP柱前衍生液相色譜圖，，其中橫軸為洗脫時(shí)間(min)，縱向軸是245nm吸光度(mAU)；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量對(duì)數(shù)值為縱坐
標(biāo)；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例SE-3的高效凝膠色譜圖，其中縱軸為單位折光率，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0014]實(shí)施例:參照?qǐng)D1至圖5，本發(fā)明所涉及的烏賊墨來源于舟山附近海域的金烏賊(Sepia esculenta Hoyle)。本發(fā)明的新穎硫酸化類糖胺聚糖就是一金烏賊墨為原料制備得到，其制備和結(jié)構(gòu)鑒定包括以下步驟:
(I)烏賊墨多糖的提取:
烏賊墨存在于烏賊墨消化道末端的墨囊中，為黑色固體懸浮顆粒。取新鮮烏賊墨囊中烏賊墨濃縮后凍干備用。采用兩步酶解法提取烏賊墨多糖。具體為按料液比1:20(質(zhì)量體積比)加入蒸餾水，40°C下磁力攪拌2 h，使墨汁均勻分散后首先采用木瓜蛋白酶提取3 h，加酶量2%，提取溫度60°C，pH 7，接著采用胰蛋白酶水解3 h，提取溫度60°C，pH 10，加酶量
0.5%。提取完后調(diào)pH至中性后100°C水浴加熱15 min滅酶。最后調(diào)節(jié)pH至弱酸性，靜置使黑色素沉淀后6000 rpm離心15 min,取上清調(diào)節(jié)pH至中性后濃縮至原體積的1/20,使用終濃度為80%的乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀烘干后重新溶解后使用截留分子量為3500的透析袋對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析兩天脫鹽和除去小分子物質(zhì)。最終對(duì)袋內(nèi)溶液進(jìn)行濃縮后冷凍干燥得到烏賊墨多糖粗品。烏賊墨多糖為淡黃色粉末狀，得率為3.0%。
[0015](2)烏賊墨類糖胺聚糖的提取分離純化:
色譜條件:色譜柱:Q Sepharose 4 Fast Flow離子交換層析柱；不同濃度NaCl溶液梯度洗脫；流速:1.0 mL/min，自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。
[0016]用硫酸-苯酚法在490 nm處進(jìn)行糖的跟蹤檢測(cè)，收集含糖組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500的透析袋進(jìn)行透析脫鹽，凍干。其中0.5 mol/L NaCl洗脫組分SE-3既為目標(biāo)組分。
[0017](3)烏賊墨類糖胺聚糖的理化性質(zhì)分析:
3.1單糖組成分析
單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別精確稱取等摩爾干燥至恒重的甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc) 12種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水充分溶解，配制成1.0 mL.mirT1。
[0018]樣品的全水解:取適量樣品，用2 mo I.L-1 TFA(三氟乙酸)在110 °C進(jìn)行全水解6 h，反復(fù)加甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA至無酸味，用適量蒸餾水洗出。
[0019]衍生條件:取100 UL上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液置1.5 mL的EP管中，加入100 μ L 0.3mo 1.L-1 NaOH 溶液，120 μ L 0.5 mo 1.L-1 PMP 溶液，70 °C 衍生 I h，反應(yīng)完加入 100 μ L 0.3mo I.L-1 HCl溶液中和，加500 μ L氯仿反復(fù)萃取離心，上清用0.22 μ m微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜分析。
[0020]色譜條件:Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)/CH3CN(82:18, V/V);流速:1.0 mL.min-1 ;柱溫:30 V ;進(jìn)樣量:20 μ L ;檢測(cè)器:DAD (245 nm)。
[0021]全水解完的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下衍生，進(jìn)樣20 μ L，高效液相色譜分析，記錄色譜圖。與各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間對(duì)照，確定樣品單糖組成。
[0022]和單糖組成標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)可知，SE-3主要含有乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)和巖藻糖(Fuc)，還含有甘露糖(Man)、葡萄糖胺(GlcN)和葡萄糖醛酸(GlcUA)。Man:GlcN =GlcUA =GalNAc:Gal:Fuc=l.0:1.5:0.92:3.0:1.8:2.0.由單糖組成可知烏賊墨多糖SE-3為一種具有多種單糖組成的類糖胺聚糖。其最大的特征在于同時(shí)含有兩種堿性單糖(GlcN和GalNAc)并以GalNAc為主要含量，含有一種糖醛酸(GlcUA)，含有在很多海洋糖胺聚糖中都存在的巖藻糖(Fuc)，同時(shí)還含有甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)，由該單糖組成的類糖胺聚糖還未見報(bào)道。
[0023]3.2相對(duì)分子量分析 采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定。
[0024]色譜條件:ShodexOhpak SB-804HQ 凝膠色譜柱(300 mm X 7.8 mm);柱溫:
35 °C ;流動(dòng)相:0.1 mo 1.L—1 的 Na2SO4 ;流速:0.5 mL.mirT1 ;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器(RID)。
[0025]標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
以系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，分別取6個(gè)不同分子量的標(biāo)樣，加流動(dòng)相溶解制成5 mg.mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20 μ L，記錄色譜圖及保留時(shí)間Τκ，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026]樣品分子量測(cè)定:稱取適量樣品，加流動(dòng)相溶解成5 mg.mL—1的溶液，用0.22 μπι微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μ L，高效液相色譜分析，記錄色譜圖。將樣品的保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖組分的分子量。
[0027]由SE-3的高效凝膠色譜圖可知，SE-3呈單一對(duì)稱狹窄的峰，表明其純度高，保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到其分子量為14kDa。
[0028]3.3硫酸基含量測(cè)定
采用明膠-比濁法測(cè)定各多糖的硫酸根含量。
[0029]溶液配制
0.5%明膠溶液:1.25 g明膠在60~70°C溶解于10 mL水中，定容至250 mL, 4°C冰箱
靜置過夜。
[0030]氯化鋇-明膠溶液:0.5 g BaCl2溶解于100 mL 0.5%明膠溶液中，4°C冰箱靜置過夜。
[0031]K2SO4溶液:稱105°C干燥恒重的K2SO4 108.75 mg,以水定容至100 mL,即得硫酸基標(biāo)準(zhǔn)液(硫酸根質(zhì)量濃度)600 μ g.mL'
[0032]稀鹽酸配制:I mL濃鹽酸加水稀釋至30 mL。
[0033]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別取上述標(biāo)準(zhǔn)硫酸鹽溶液0、0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL，補(bǔ)水至1.0 mL。加入稀鹽酸1.0 mL,再加入氯化鋇-明膠溶液0.5 mL,混勻，25 °C放置20 min,在500 nm處測(cè)定其吸光值。以硫酸基標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034]樣品的測(cè)定:準(zhǔn)確稱取5 mg樣品溶于4 mL , I mo I.L-1 HCl中，封管,于105°C的烘箱中反應(yīng)12 h，使硫酸根游離。準(zhǔn)確移取上述溶液適量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法平行三次，測(cè)定其吸光值，代入線性回歸方程計(jì)算各多糖樣品的硫酸基含量的平均值。最后，換算成百分含量。最后計(jì)算得到SE-3硫酸基團(tuán)的含量為12%。
[0035]通過對(duì)SE-3理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定，最終確定SE-3為分子量為14 kDa的硫酸酯化的類糖胺聚糖。和很多海洋動(dòng)物來源的糖胺聚糖類似，SE-3含有硫酸取代，并含有氨基糖、糖醛酸和巖藻糖。但是SE-3新穎性體現(xiàn)在以乙酰氨基半乳糖為主，還含有氨基葡萄糖，并且還含有大量的半乳糖和甘露糖。該單糖組成的類糖胺聚糖在頭足動(dòng)物乃至整個(gè)海洋動(dòng)物中均為首次發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明詳細(xì)介紹金烏賊墨來源的硫酸酯化的新型類糖胺聚糖的制備工藝，描述了其理化性 質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其特征在于該海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3單糖組分含有甘露糖:葡萄糖胺:葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:半乳糖:巖藻糖的質(zhì)量比例為.1:1.5:0.92:3:1.8:2 ;該海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量為IOkDa至16kDa，硫酸基團(tuán)的含量為10%至14%之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)烏賊墨多糖的提取:取新鮮烏賊墨囊中烏賊墨濃縮后凍干后，采用酶解法處理后，沉淀烘干，再重新溶解后使用截留分子量為3500的透析袋對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析脫鹽和除去小分子物質(zhì)，得到烏賊墨多糖； 2)分離純化:采用離子交換層析柱依次采用0.05mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液三個(gè)梯度濃度的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集0.01至0.1 mol/L,0.1至0.5 mol/L、.0.2至1 mol/L的NaCl溶液洗脫，并收集所述的0.2至I mol/L的NaCl溶液洗脫產(chǎn)物；所述的洗脫產(chǎn)物分子量為IOkDa至16kDa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制備方法，其特征在于所述的梯度洗脫的截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500，流速為0.5至3 mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制備方法，其特征在于所述的酶解法為兩步酶解法，具體為按料液質(zhì)量體積比1:10至1:30加入蒸餾水，40°C下磁力攪拌，使墨汁均勻分散后先采用木瓜蛋白酶提取Ih~3h，加酶量1%~2%，提取溫度55~.65 °C，pH為6.5~7.5 ;接著 采用胰蛋白酶水解Ih~3h，提取溫度55~65°C，pH8~10，加酶量0.1~0.5% ;提取完后調(diào)pH至中性后加熱滅酶；后調(diào)節(jié)pH至5~6.8，靜置使黑色素沉淀后3000~10000 rpm離心10~20min,取上清調(diào)節(jié)pH至中性后濃縮至原體積的1/10~.1/20，使用終濃度為70~80%的乙醇進(jìn)行沉淀。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104004109SQ201410251864
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】陳蔭, 李佩佩, 王斌, 牛慶鳳, 李濤 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院