一種高純度井岡霉素a的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種尚品質(zhì)井閃霉素A的新制備工藝。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 井閃霉素是我國(guó)自主開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)的氨基糖苷類(lèi)農(nóng)用抗生素，由吸水鏈霉菌井岡變 種（Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensisyen)代謝產(chǎn)生，能有效抑制水稻紋 枯病菌，現(xiàn)已成為我國(guó)產(chǎn)量最大、發(fā)酵單位最高的抗生素之一，是生物農(nóng)藥的最主要品種之 O
[0003] 井岡霉素是種多元混合物，主要由井岡霉素A、B、C、D、E、F、G和H(如表1所示） 等組分組成，其中A組分對(duì)水稻紋枯病的活性最強(qiáng)、含量最高，C和D組分幾乎無(wú)效，還有井 岡羥胺A、B和G，它們是不含葡萄基的二環(huán)環(huán)醇類(lèi)物質(zhì)。
[0004] 目前，井閃霉素的產(chǎn)品有水劑和粉劑兩種劑型。水劑的生產(chǎn)工藝為發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處 理再過(guò)濾，通過(guò)濃縮而得，含有較多的糖分、蛋白質(zhì)等培養(yǎng)基殘留成分。粉劑的生產(chǎn)工藝依 據(jù)井閃霉素是弱堿性抗生素，其分子結(jié)構(gòu)中亞胺部分帶弱性正電荷的特點(diǎn)，利用離子交換 法與膜分離法相結(jié)合提取工藝路線，可以制備含井閃霉素A60萬(wàn)（60%)以上粉劑。該工 藝路線已應(yīng)用于生產(chǎn)，大部分產(chǎn)品出口，已獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0005] 井岡羥胺或井岡霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下，井岡霉素不同組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1 :
[0006]
[0007] 但是隨著產(chǎn)品出口數(shù)量的增加，國(guó)外用戶(hù)對(duì)井岡霉素的質(zhì)量要求也越來(lái)越高，已 不滿(mǎn)足于現(xiàn)有的井閃霉素A60萬(wàn)含量，且因發(fā)酵原因，有的發(fā)酵批次最終產(chǎn)品中井閃霉素 A還達(dá)不到60%，從而影響出口。另一方面，在井閃霉素粉劑中含有大量的井閃羥胺A，有的 批次高達(dá)30%。如果能把井閃羥胺A生物轉(zhuǎn)化成井閃霉素A，制備高井閃霉素A產(chǎn)品，對(duì)井 岡霉素產(chǎn)品出口創(chuàng)匯和企業(yè)發(fā)展都具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。
[0008] 表1 :井閃霉素不同組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)
[0009]
(三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供一種尚品質(zhì)井閃霉素A的新制備工藝。
[0011] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0012] -種井閃霉素A的制備方法，其特征在于，所述方法為先將井閃羥胺A吸附在陽(yáng) 離子樹(shù)脂上，以大腸桿菌濕菌體作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化劑，在水中加入纖維二糖，使其在水 中終濃度為0.05~1.5%g/ml，在反應(yīng)溫度為25~35°C，pH為5.0~7.0的條件下反應(yīng) 12~48h;反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾取濾餅用0. 2~I. 2mol/L氨水溶液洗脫，經(jīng)HPLC跟蹤檢測(cè)收 集井閃霉素A組分，濃縮后進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥，制備獲得井閃霉素A，所述的井岡羥 胺A與纖維二糖的質(zhì)量比為I:1. 5~2. 5。反應(yīng)式如下：
[0013]
[0014] 糖基轉(zhuǎn)移酶催化制備井閃霉素A
[0015] 本發(fā)明推薦所述的將井閃羥胺A以井閃羥胺水溶液的形式吸附在陽(yáng)離子樹(shù)脂上， 并按如下步驟操作：在陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂中加入含井閃羥胺A的水溶液，充分?jǐn)嚢?，使?岡羥胺A吸附完全，所述的陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂與井閃羥胺A水溶液的體積比為1 :0. 8~ 1. 5所述的井岡羥胺A水溶液的濃度為0. 3~0. 8 %g/mL。
[0016] 進(jìn)一步，所述的大腸桿菌濕菌體的用量以井岡羥胺A質(zhì)量計(jì)為0. 5~2.Og/g。
[0017] 再進(jìn)一步，所述的濃縮是在<50°C下真空濃縮，再干燥獲得產(chǎn)品。更優(yōu)選所述的濃 縮通常在5~50°C溫度-0. 95~-1個(gè)大氣壓的真空條件下進(jìn)行。
[0018] 優(yōu)選的，陽(yáng)離子樹(shù)脂可選擇強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂、弱酸型陽(yáng)離子交換凝膠 樹(shù)脂、強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換大孔樹(shù)脂、弱酸型陽(yáng)離子交換大孔樹(shù)脂。更優(yōu)選選擇強(qiáng)酸型陽(yáng) 離子交換凝膠樹(shù)脂，具體的，所述陽(yáng)離子樹(shù)脂為下列之一 ：001X7、001X4、D001、D113或 001X8。
[0019] 本發(fā)明的主要效果體現(xiàn)在：采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附井閃羥胺A和，反應(yīng)過(guò)程中， 生成的部分井閃霉素A吸附在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上，這樣可促進(jìn)井閃羥胺A進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為井 岡霉素A，既可避免底物對(duì)酶抑制，也可避免產(chǎn)物對(duì)酶的抑制，所制備的井閃霉素A產(chǎn)品產(chǎn) 率和純度提高。 (四）【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
[0021] 實(shí)施例1 :
[0022] 在100mL001X7強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂（杭州爭(zhēng)光樹(shù)脂有限公司）中加入 200mL含0. 5 %g/mL井岡羥胺A溶液，充分?jǐn)嚢?，使井岡羥胺A吸附完全，過(guò)濾，用IOOmL去 離子水洗滌，備用。將已吸附井閃羥胺A的樹(shù)脂加入到350mL水中，纖維二糖加量為I. 5g， 大腸桿菌濕菌體加量I. 8g，控制pH= 6. 0,在30°C、150rpm搖床上反應(yīng)24h，用沙布過(guò)濾樹(shù) 月旨，用去離子水洗去菌體，將樹(shù)脂裝柱，用0. 5mol/L氨水溶液洗脫，經(jīng)HPLC跟蹤檢測(cè)，收集 井岡霉素A組分，在40°C下-0. 95~-0. 98大氣壓條件下濃縮，冷凍干燥獲得產(chǎn)品0. 85g， 經(jīng)HPLC檢測(cè)，（用日本島津20A高效液相色譜儀檢測(cè)，檢測(cè)條件：流動(dòng)相為含2. 5%甲醇 和0. 18%Na2HPO4 ? 12H20的水溶液，pH7. 0,流速I(mǎi).OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm)純度為 95. 5%〇
[0023] 實(shí)施例2 :
[0024] 在100LDOOl強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換大孔樹(shù)脂（杭州爭(zhēng)光樹(shù)脂有限公司）中加入200L 含0. 8 %井閃羥胺A(W/V)溶液，充分?jǐn)嚢?，使井閃羥胺A吸附完全，過(guò)濾，用100L去離子水 洗滌，備用。用已吸附井閃羥胺A的樹(shù)脂加入到400L水中，纖維二糖加量為2.Okg，大腸桿 菌濕菌體加量2. 0kg，控制pH= 6. 0,在35°C下攪拌反應(yīng)24h，用沙布在三腳式離心機(jī)離心 過(guò)濾樹(shù)脂，用100L去離子水洗去菌體，將樹(shù)脂裝柱，用0. 8mol/L氨水溶液洗脫，經(jīng)HPLC跟 蹤檢測(cè)，收集井閃霉素A組分，在35°C下真空度-0. 98大氣壓條件下濃縮，噴霧干燥（進(jìn)口 溫度為180°C，出口溫度70°C)獲得產(chǎn)品I. 8kg，經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為96. 3%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種井閃霉素A的制備方法，其特征在于，所述方法為先將井閃羥胺A吸附在陽(yáng)離 子樹(shù)脂上，以大腸桿菌濕菌體作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化劑，在水中加入纖維二糖，使其在水中終 濃度為〇. 05~1. 5% g/mL，在反應(yīng)溫度為25~35°C，pH為5. O~7. O的條件下進(jìn)行反應(yīng) 12~48h ;反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾取濾餅用0. 2~I. 2mol/L氨水溶液洗脫，經(jīng)HPLC跟蹤檢測(cè)收 集井岡霉素A組分，濃縮后噴霧干燥或冷凍干燥，制備獲得井岡霉素A，所述的井岡羥胺A與 纖維二糖的質(zhì)量比為I :1. 5-2. 5。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的將井閃羥胺A以井閃羥胺水溶液的形 式吸附在陽(yáng)離子樹(shù)脂上，并按如下步驟操作：在陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂中加入含井閃羥胺A 的水溶液，充分?jǐn)嚢?，使井閃羥胺A吸附完全，所述的陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂與井閃羥胺A水 溶液的體積比為1 :〇. 8~1. 5所述的井岡羥胺A水溶液的濃度為0. 3-0. 8% g/mL。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的大腸桿菌濕菌體的用量以井閃羥胺A 質(zhì)量計(jì)為〇. 5~2. Og/g。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的濃縮是在< 50°C下真空濃縮，再干燥 獲得廣品。5. 如權(quán)利要求1~4之一所述的方法，其特征在于所述陽(yáng)離子樹(shù)脂為下列之一：強(qiáng)酸 型陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂、弱酸型陽(yáng)離子交換凝膠樹(shù)脂、強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換大孔樹(shù)脂或弱酸 型陽(yáng)離子交換大孔樹(shù)脂。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述陽(yáng)離子樹(shù)脂為下列之一 ：001X7、 001X4、D001、D113 或 001X8。
【專(zhuān)利摘要】一種井岡霉素A的制備方法，所述方法為先將井岡羥胺A吸附在陽(yáng)離子樹(shù)脂上，以大腸桿菌濕菌體作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化劑，在水中加入纖維二糖，使其在水中終濃度為0.05～1.5％g/mL，在反應(yīng)溫度為25～35℃，pH為5.0～7.0的條件下進(jìn)行反應(yīng)12～48h；反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾取濾餅用0.2～1.2mol/L氨水溶液洗脫，經(jīng)HPLC跟蹤檢測(cè)收集井岡霉素A組分，濃縮后噴霧干燥或冷凍干燥，制備獲得井岡霉素A，所述的井岡羥胺A與纖維二糖的質(zhì)量比為1：1.5‐2.5。本發(fā)明采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附井岡羥胺A和井岡霉素A，既可避免底物對(duì)酶抑制，也可避免產(chǎn)物對(duì)酶的抑制，所制備的井岡霉素A產(chǎn)品純度高。
【IPC分類(lèi)】C12P19/46, C12R1/19
【公開(kāi)號(hào)】CN105002236
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510253870
【發(fā)明人】陳小龍, 范永仙, 陸躍樂(lè), 沈寅初
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年5月18日