r/min離心5min，棄上清加入無菌去離子水、5 ml 5%纖維素酶液混勻，49 °C保溫I h，12000 r/min離心5min，棄上清加入無菌去離子水混勻，重復(fù)此步驟一次。
[0013]細(xì)胞破壁、除蛋白:富集菌體后的離心管中加入2 ml緩沖液，50 μ I 50 mg/ml溶菌酶和 60 μ I 20 mg/ml 溶壁酶 25 °C 水浴 30 min, 37 °C 水浴 30 min;加入 200 μ I 10%SDS(十二烷基硫酸鈉)(或100 μ I 20%SDS)和100 μ I 20 mg/ml蛋白酶K ；49 °C水浴1-1.5h，加0.1g玻璃珠，劇烈震蕩2 min ;凍融3次，每次5 min ；
DNA提取:加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，49°C水浴20 min ;加入等體積的苯酸/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勾；12000 r/min離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾濁，需重復(fù)此步驟；加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勻；再次離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾濁，需重復(fù)此步驟；
DNA沉降:加0.6倍體積異戊醇，-70 0C —20 °C過夜；13000 r/min離心15 min，盡量倒干凈液體；用500 ul預(yù)冷的70%乙醇洗滌，13000 r/min離心15 min;棄上清液，65 °(:烘干30 min,到烘干為止，加TE緩沖液(或無菌去離子水)溶解保存。即可得酒醅DNA。
[0014]實施例2:
酒醅預(yù)處理:取10 g發(fā)酵至第5 d酒醅置入含90 ml無菌水三角瓶中，振蕩10 min，取上層液體10 ml置于滅菌離心管中，11000 r/min離心5min，棄上清，重復(fù)此步驟以無菌去離子水洗滌一次，沉淀加入5 ml 5%中溫淀粉酶液混勻，49 °C保溫I h后再加入I ml液化酶混勾，49 °C保溫I h。之后11000 r/min離心5min，棄上清加入無菌去離子水、5 ml 5%纖維素酶液混勻，49 °C保溫I h，11000 r/min離心5min，棄上清加入無菌去離子水混勻，重復(fù)此步驟一次。
[0015]細(xì)胞破壁、除蛋白:富集菌體后的離心管中加入2 ml緩沖液，50 μ I 50 mg/ml溶菌酶和 60 μ I 20 mg/ml 溶壁酶 24 °C 水浴 30 min, 37 °C 水浴 30 min;加入 200 μ I 10%SDS(十二烷基硫酸鈉)(或100 μ I 20%SDS)和100 μ I 20 mg/ml蛋白酶K ;49 °C水浴I h，加0.1g玻璃珠，劇烈震蕩2 min ;凍融3次，每次5 min ;
DNA提取步驟同實施例1 ;
DNA沉降步驟同實施例1。
【主權(quán)項】
1.通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，其特征在于:采用中溫淀粉酶、液化酶對大曲高粱酒醅預(yù)處理，降解大部分淀粉；再利用纖維素酶降解酒醅中的纖維素；通過富集菌體、細(xì)胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗滌制備酒醅總DNA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，其特征在于:所述的酒醅預(yù)處理:10 g~20 g酒醅置入含90 ml無菌水瓶中，振蕩10 min -15min，取上層液體5 ml ~10 ml，置于滅菌離心管中，11000 r/min~13000 r/min離心5min，棄上清，重復(fù)此步驟以無菌去離子水洗滌一次，沉淀加入3 ml ~5 ml 5%中溫淀粉酶液混勻，45 0C-50 °C保溫I h后再加入I ml液化酶混勻，45 °C-50 °C保溫I h;保溫結(jié)束后11000r/min~13000 r/min離心5min，棄上清液后加入無菌去離子水混勾；加入3 ml ~5 ml 5%纖維素酶液混勻，45 0C-50 °C保溫I h，11000 r/min~13000 r/min離心5min，棄上清液后加入無菌去離子水混勻，重復(fù)此步驟以徹底去除干擾物質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，其特征在于:所述的細(xì)胞破壁、降解蛋白:富集菌體后的離心管中加入2 ml緩沖液，50 μ I 50mg/ml 溶菌酶和 60 μ I 20 mg/ml 溶壁酶 24 °C -26 °C水浴 30 min, 35 °C -39 °C水浴 30min ;加入 200 μ I 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)或 100 μ I 20%SDS 和 100 μ I 20 mg/ml 蛋白酶K;45 °C-50 °C水浴1-1.5 h，加0.1g玻璃珠，劇烈震蕩2 min;凍融3次，每次5 min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，其特征在于:所述的抽提:加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，45 0C -50 °C水浴20 min ;加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻；11000r/min~13000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾池，需重復(fù)此步驟；加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勾;11000 r/min~13000 r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾濁，需重復(fù)此步驟。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，其特征在于:所述的DNA沉降、洗滌:加0.6倍體積異戊醇，-70 0C —20 °C過夜；11000 r/min~13000 r/min離心15 min，盡量倒干凈液體；用500 ul預(yù)冷的70%乙醇洗滌，11000 r/min~13000 r/min離心15 min;棄上清液，65 °C烘干30 min，到烘干為止，加TE緩沖液或無菌去離子水溶解保存；即可得酒醅DNA。
【專利摘要】本發(fā)明涉及酒醅DNA的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體的將公開了一種通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法。技術(shù)方案為：采用中溫淀粉酶、液化酶對大曲高粱酒醅進(jìn)行預(yù)處理，降解大部分淀粉；再利用纖維素酶降解酒醅中的纖維素；通過富集菌體、細(xì)胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗滌制備酒醅總DNA的方法。本發(fā)明的方法不僅除去了酒醅中干擾DNA提取的淀粉、纖維素及腐植酸等雜質(zhì)，且試劑易于獲取、降低了實驗成本；通過破壁條件的改變，利用酶、物理、化學(xué)相結(jié)合的方法可將真菌及細(xì)菌的基因組DNA完整地提取出來。該方法有助于提高大曲高粱酒醅總DNA的提取質(zhì)量，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105002165
【申請?zhí)枴緾N201510503464
【發(fā)明人】朱會霞, 程宗志, 郭亞偉, 李澤霞, 佟蘭欣, 張福艷
【申請人】河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月17日