褐斑大蠊分子標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明設(shè)及褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法和應(yīng)用，屬于媒介生物檢疫技術(shù) 研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[000引國(guó)內(nèi)外關(guān)于媒介生物分子DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究則尚處于起步的階段，很多問(wèn)題亟 待解決。由于受生物發(fā)育階段的限制W及近緣種生物形態(tài)的相似性、實(shí)際工作中樣品的不 完整性等原因，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)手段進(jìn)行物種鑒定遇到很多實(shí)際困難。現(xiàn)有分子DNA技術(shù)被 證明是一個(gè)行之有效的生物鑒定手段。目前，我國(guó)還沒(méi)有經(jīng)過(guò)國(guó)家認(rèn)可的、統(tǒng)一的、規(guī)范化 的分子DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，在國(guó)際上也沒(méi)有該類標(biāo)準(zhǔn)樣品。分子生物學(xué)鑒定技術(shù)是媒介生物分 類鑒定新的技術(shù)手段。
[0004] 分子生物學(xué)技術(shù)可W從分子水平上闡明物種間的差別，如可利用DNA探針技術(shù)、 DNA測(cè)序技術(shù)、PCR技術(shù)等對(duì)媒介生物樣品在分子水平上進(jìn)行分類鑒定。媒介生物分子標(biāo)準(zhǔn) 樣品可作為實(shí)驗(yàn)室對(duì)媒介生物進(jìn)行分子鑒定等技術(shù)的參照物，保證測(cè)試結(jié)果的可溯源性。 因此，本項(xiàng)目研制的褐斑大賺標(biāo)準(zhǔn)樣品將為褐斑大賺分子鑒定工作提供參照和依據(jù)，為我 國(guó)分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究工作起到一定得推動(dòng)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻性與穩(wěn)定性良好，本發(fā)明的另 一目的是提供褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，方法操作簡(jiǎn)單，易于制備。
[0006] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在 于：采集褐斑大賺成蟲通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)后，提取高純度DNA，進(jìn)行分裝、凍干，得到褐 斑大賺的分子標(biāo)準(zhǔn)品，其具有下述的理化性質(zhì)：（0形狀：純白色粉末狀；（2)每管的含量 1嗦±0. 1嗦；（3) DNA 純度：00260/280=1. 8-2. 0 ; (4)易溶于水或 Tris-邸TA (TE)緩沖液 中。
[0007]進(jìn)一步地，所述 DNA 純度：00260/280=1. 85。
[0008] 本發(fā)明褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： 第一步為褐斑大賺DNA提取： 野外采集褐斑大賺成蟲，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，提取褐斑大賺DNA ; 第二步為核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備： 將測(cè)定濃度后的DNA按1嗦±0. 1嗦/管進(jìn)行分裝，每種核酸分子標(biāo)樣分裝100管，然 后凍干，即為目的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0009] 進(jìn)一步地，所述第一步中褐斑大賺DNA提取的具體步驟為： (1)動(dòng)物組織裂解： 取2-25mg的動(dòng)物組織置于2血離屯、管中，用剪刀剪成碎塊； 加入180化的Buffer GL、20化的蛋白酶K (Proteinase K)和10化的濃度為lOmg/ 血的RNase A，于56°C水浴中溫浴2-3小時(shí)，至動(dòng)物組織完全裂解，后12, 000巧m離屯、2分 鐘，去除雜質(zhì)； (2) 向裂解液中加入200化Buffer GB和200化100%乙醇，充分混勻； (3) 將試劑盒中的離屯、柱安置于收集管上，將上述操作（2)混合溶液移至離屯、柱中， 12, 000 :rpm 離 屯、2分鐘，棄濾液； (4) 將500化的Buffer WA加入至離屯、柱中，12, 000巧m離屯、1分鐘，棄濾液； (5) 在Buffer WB中加入指定體積的100%乙醇，混勻后，將700化的Buffer WB加入至 離屯、柱中，12, 000rpm離屯、1分鐘，棄濾液； (6) 重復(fù)操作步驟（5); (7) 將離屯、柱安置于收集管上，12, 000 rpm離屯、2分鐘； (8) 將離屯、柱安置于新的1. 5mL的離屯、管上，在離屯、柱膜的中央處加入50-200化的滅 菌水或洗脫緩沖液，室溫靜置5分鐘； (9) 12, 000巧m離屯、2分鐘洗脫DNA。
[0010] 進(jìn)一步地，所述操作步驟（5)中沿離屯、柱的管壁四周加入Buffer WB。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟（8)中滅菌水或洗脫緩沖液加熱至65°C。
[0012] 進(jìn)一步地，對(duì)制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性鑒定，通過(guò)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增或測(cè) 序進(jìn)行定性分析，來(lái)確認(rèn)所制備的核酸為目的DNA : 取制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入50化的TE，溶解后作為模板使用，經(jīng)采用特異性引物 C0I-1和C0I-2進(jìn)行PCR并測(cè)序，進(jìn)行定性分析，確認(rèn)所制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為目的核酸樣 品；
[0013] 進(jìn)一步地，對(duì)制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行DM完整性、濃度及純度檢測(cè)： (1) DNA完整性檢測(cè)：用提取的DNA直接進(jìn)行120V，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條 帶的完整性； (2) DNA濃度及純度檢測(cè)：吸取1 y L DNA用分光光度計(jì)測(cè)定260皿和280皿的吸收值， 然后根據(jù)0D260/0D280值判斷DNA純度，并根據(jù)0D260計(jì)算其濃度，按W下公式計(jì)算： DNA 濃度（ng/ y 1) =00260 X 50 進(jìn)一步地，對(duì)制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性分析： (1)標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性分析：采用PicoGreen DNA分子巧光定量方法及紫外分光光度法， 取隨機(jī)抽取的15管標(biāo)準(zhǔn)樣品，每管標(biāo)準(zhǔn)樣品分成2份子樣進(jìn)行測(cè)試，后進(jìn)行F檢驗(yàn)確認(rèn)樣 品均勻性； (2) 標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性分析：對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品分階段每次取二份樣品，按照不同保存 條件進(jìn)行定性測(cè)定，每份樣品W測(cè)定3次值為其定值結(jié)果，且在全部穩(wěn)定性測(cè)試中，所用人 員、儀器、測(cè)試方法和實(shí)驗(yàn)室均與均勻性測(cè)試相同。
[0014] 進(jìn)一步地，對(duì)制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)：將制得的分子標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至 Wng/rt，作為母液，然后按10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋并進(jìn)行PCR檢測(cè)，由條帶不可見時(shí)對(duì)應(yīng) 的標(biāo)準(zhǔn)品濃度判定該標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度。
[0015] 本發(fā)明采集褐斑大賺成蟲通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)后，提取高純度DNA，進(jìn)行分裝、凍 干，得到褐斑大賺的分子標(biāo)準(zhǔn)品，其理化性質(zhì)好，可采用特異性引物通過(guò)PCR方法檢測(cè)，靈 敏度可達(dá)到10 3倍，適用于出入境衛(wèi)生檢疫部口及其他行業(yè)對(duì)褐斑大賺的鑒定檢測(cè)，W該 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性參考對(duì)照物，在分類鑒定分子檢測(cè)中形成對(duì)比，提高鑒定結(jié)果的靈敏性和 準(zhǔn)確性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為褐斑大賺總DNA電泳圖。
[0017]圖2為褐斑大賺特異性引物擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，圖中：M為Marker 75化P，1-4為目 的DNA。
[0018] 圖3為靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖中由左至右，每一格為一個(gè)濃度，依次是101， 10 2, 10 3, 10 4, 10 5。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施 例。
[0020] 實(shí)施例1 褐斑大賺分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括如下步驟： 第一步為褐斑大賺DNA提?。?野外采集褐斑大賺成蟲，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，采用試劑盒提取褐斑大賺DNA : (1)動(dòng)物組織裂解： 取lOmg的動(dòng)物組織置于2mL離屯、管中，用剪刀盡可能地剪成碎塊； 加入180化的Buffer GL2〇PL的ProteinaseK和10化的濃度為lOmg/血的RNase A,于56°C水浴 中溫浴2小時(shí)，至動(dòng)物組織完全裂解，后12, OOOrpm離屯、2分鐘，去除雜質(zhì)；對(duì)于難裂解 的材料可W適當(dāng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間甚至過(guò)夜裂解； (2) 向裂解液中加入200化Buffer GB和200化100%乙醇，充分混勻； (3) 將試劑盒中的離屯、柱安置于收集管上，將上述操作（2)混合溶液移至離屯、柱中， 12,000 巧m離 屯、2分鐘，棄濾液； (4) 將500化的Buffer WA加入至離屯、柱中，12, 000巧m離屯、1分鐘，棄濾液； (5) 在Buffer WB中加入指定體積的100%乙醇，混勻后，沿離屯、柱的管壁四周加入 700化的Buffer WB，運(yùn)樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份，12, 000巧m離屯、1分鐘，棄 濾液； (6) 重復(fù)操作步驟（5); (7) 將離屯、柱安置于收集管上，12, 000 rpm離屯、2分鐘； (8) 將離屯、柱安置于新的1. 5血的離屯、管上，將滅菌蒸饋水或洗脫緩沖液加熱至65°C， 在離屯、柱膜的中央處加入100化的滅菌水或洗脫緩沖液，室溫靜置5分鐘，將滅菌蒸饋水或 洗脫緩沖液加熱至65°C的目的是在使用時(shí)有利于提高洗脫效率； (9) 12, 000巧m離屯、2分鐘洗脫DNA。
[0021] 第二步為核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備： 將測(cè)定濃度后的DNA按1嗦±0. 1嗦/管進(jìn)行分裝，每種核酸分子標(biāo)樣分裝100管，然 后采用真空冷凍干燥機(jī)F05508凍干，凍干溫度為-50°C，壓強(qiáng)為2. 66化，凍干所得為目的標(biāo) 準(zhǔn)品，其具有下述的理化性質(zhì)：（1)形狀：純白色粉末狀；（2)每管的含量1嗦±0. 1嗦；（3) DNA純度：00260/280=1. 8-2. 0 ; (4)易溶于水或TE緩沖液中； 第S步為對(duì)制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性鑒定，通過(guò)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增或測(cè)序進(jìn)行 定性分析，來(lái)確認(rèn)所制備的核酸為目的DNA : 取制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入50化的TE，溶解后作為模板使用，經(jīng)采用人工合成的特 異性引物C0I-1和C0I-2進(jìn)行PCR并測(cè)序，進(jìn)行定性分析，確認(rèn)所制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為目 的核酸樣品； 上游引物 C0I-1: 5' - GGTCA ACAAATCATA AAGATATTGG -3， 下游引物 C0I-2: 5' - TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3， 反應(yīng)體系： 模板 1.0化 上游引物C0I-1 1.0化 下游引物C0I-2 1.0化 Taq 酶 0. 5 U dNTP 2.0 化 10X Buffer 2. 5 化 Total 25. 0 化 反應(yīng)條件：94它 3min ;95它 30s，5(TC 45s，72r Imin，循環(huán) 35 次