通過預處理提高大曲高粱酒醅總dna提取質(zhì)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及酒醅DNA的制備方法，具體涉及通過預處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取量的方法，特別涉及采用中溫淀粉酶、液化酶對大曲高粱酒醅進行預處理，降解大部分淀粉，再利用纖維素酶降解酒醅中的纖維素，通過富集菌體、細胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗滌制備酒醅總DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]常規(guī)環(huán)境樣品中總DNA的提取經(jīng)常采用無菌去離子水渦旋振蕩洗滌、離心的方法富集菌體，目的是在微生物細胞裂解釋放DNA之前，先將微生物細胞從它們的環(huán)境基質(zhì)中分離出來。但這一方法對酒醅并不適用。大曲高粱酒醅樣品微生物大多富集在酒醅中的谷物上，對酒醅樣品先用無菌去離子水渦旋振蕩洗滌，很多雜質(zhì)也與菌體混雜，導致洗滌液中不僅有微生物細胞，還有大量淀粉、纖維素及腐植酸。這些物質(zhì)分子較大，易隨菌體沉降。且在細胞破壁處理階段由于溫度、金屬離子的影響，淀粉鏈打開，易與DNA鏈纏繞且具有吸附性，將導致抽提步驟不能將酒醅樣品中的微生物DNA盡量完整地提取出來，分析結(jié)果反映的樣品微生物群落具有片面性。這無疑為酒醅樣品中微生物群落多樣性的分析帶來影響。
[0003]由于酒醅本身所具有的特殊性，即不同發(fā)酵階段的酒醅樣品中各種微生物的數(shù)量與比例有所不同，利用酶、物理、化學相結(jié)合的方法可將真菌及細菌的基因組DNA完整地提取出來。
[0004]中國白酒各香型、品種的酒醅成分(糧食種類)、微生物組成千差萬別，酒醅總DNA的提取方法也應(yīng)有所不同。但在目前酒醅DNA提取方法較為單一。2012年12月12日國家知識產(chǎn)權(quán)局公布了“通過預處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法”，專利申請?zhí)?CN201210344426.X ;公開號:CN102816757A。但這種方法并不適用于大曲高粱酒醅。在多次實驗的基礎(chǔ)上，我們提供一種采用中溫淀粉酶、液化酶及纖維素酶對大曲高粱酒醅進行預處理，降解大部分淀粉和纖維素，再通過富集菌體、細胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗滌操作制備酒醅總DNA的方法，不僅試劑易于獲取、降低了實驗成本，并且可通過破壁條件的改變，利用酶、物理、化學相結(jié)合的方法可將真菌及細菌的基因組DNA完整地提取出來。該方法有助于提高大曲高粱酒醅總DNA的提取質(zhì)量，具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對酒醅DNA提取困難的現(xiàn)狀，提供一種通過淀粉酶、液化酶、纖維素酶預處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法，為分析酒醅樣品中微生物群落多樣性奠定基礎(chǔ)。
[0006]實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
通過預處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法是采用中溫淀粉酶、液化酶對大曲高粱酒醅進行預處理，降解大部分淀粉；再利用纖維素酶降解酒醅中的纖維素；通過富集菌體、細胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗滌制備酒醅總DNA。
[0007]上述通過預處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法的附加技術(shù)特征還包括:
——所述酒醅預處理:10 g~20 g酒醅置入含90 ml無菌水三角瓶中，振蕩10 min -15min，取上層液體5 ml ~10 ml，置于滅菌離心管中，11000 r/min~13000 r/min離心5min，棄上清，重復此步驟以無菌去離子水洗滌一次，沉淀加入3 ml ~5 ml 5%中溫淀粉酶液混勻，45 0C-50 °C保溫I h后再加入I ml液化酶混勻，45 °C-50 °C保溫I h;保溫結(jié)束后11000r/min~13000 r/min離心5min，棄上清液后加入無菌去離子水混勾；加入3 ml ~5 ml 5%纖維素酶液混勻，45 0C-50 °C保溫I h，11000 r/min~13000 r/min離心5min，棄上清液后加入無菌去離子水混勻，重復此步驟以徹底去除干擾物質(zhì)。
[0008]一一所述細胞破壁、降解蛋白:富集菌體后的離心管中加入2 ml緩沖液，50 μ I50 mg/ml 溶菌酶和 60 μ I 20 mg/ml 溶壁酶 24 °C -26 °C水浴 30 min, 35 °C -39 °C水浴30 min ;加入 200 μ I 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)(或 100 μ I 20%SDS)和 100 μ I 20 mg/ml蛋白酶K ;45 °C -50 °C水浴1_1.5 h，加0.1g玻璃珠，劇烈震蕩2 min ;凍融3次，每次5 min ；
——所述DNA的抽提:加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，45 0C-50 °C水浴20 min;加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勾；11000 r/min~13000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾池，需重復此步驟；加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勾；11000 r/min~13000 r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，若上層水相很渾濁，需重復此步驟；
——所述DNA沉淀和洗滌:加0.6倍體積異戊醇，-70 0C —20 °C過夜；11000 r/min~13000 r/min離心15 min，盡量倒干凈液體；用500 ul預冷的70%乙醇洗滌，11000 r/min~13000 r/min離心15 min;棄上清液，65 °C烘干30 min，到烘干為止，加TE緩沖液(或無菌去離子水)溶解保存。即可得酒醅DNA。
[0009]需要說明的是:
由于預處理步驟加入了淀粉酶、液化酶和纖維素酶，這些酶部分隨菌體沉降被帶入后續(xù)操作步驟，可用蛋白酶K降解除去。因此細胞破壁、除蛋白步驟中蛋白酶K的加入量高于其他提取方法。
[0010]本發(fā)明所提供的通過預處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取量的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:其一，由于在酒醅預處理中采用中溫淀粉酶、液化酶對大曲高粱酒醅進行預處理，降解酒醅處理液中大部分淀粉，減少其對后續(xù)DNA提取步驟的影響；其二，采用纖維素酶對大曲高粱酒醅進行預處理，降解酒醅處理液中大部分纖維素，減少其對后續(xù)DNA提取步驟的影響；其三，本發(fā)明的方法不僅除去了酒醅中干擾DNA提取的淀粉、纖維素及腐植酸等雜質(zhì)，且試劑易于獲取、降低了實驗成本；通過破壁條件的改變，利用酶、物理、化學相結(jié)合的方法可將真菌及細菌的基因組DNA完整地提取出來。該方法有助于提高大曲高粱酒醅總DNA的提取質(zhì)量，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細闡述。
[0012]實施例1: 酒醅預處理:取20 g發(fā)酵至第2 d酒醅置入含90 ml無菌水三角瓶中，振蕩15 min，取上層液體10 ml置于滅菌離心管中，12000 r/min離心5min，棄上清，重復此步驟以無菌去離子水洗滌一次，沉淀加入5 ml 5%中溫淀粉酶液混勻，49 °C保溫I h后再加入I ml液化酶混勾，49 °C保溫I h。之后12000