；72它 7min〇
[00過實施例2 對實施例1中制得的褐斑大賺分子標準樣品進行完整性、濃度及純度檢測： (1) DNA完整性檢測：直接法-用提取的DNA直接電泳檢查，120V，1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳，觀察條帶的完整性，檢測結果見圖1，條帶完整，無彌散狀，說明DNA條帶完整性較好； (2) DNA濃度及純度檢測：紫外分光光度計法-吸取1 y L DNA用分光光度計測定260nm 和280nm的吸收值，然后根據(jù)0D260/0D280值判斷DM純度，并根據(jù)0D260計算其濃度，按 W下公式計算： DNA 濃度（ng/ y 1) =00260 X 50 當0D260/0D280 < 1.8,表示蛋白質含量較高；0D260/0D280 >2. 0,表示RNA含量較高； 當 0D260/0D280=1. 8 ~2. 0,表示 DNA 較純。
[0023] 對實施例1中制得的褐斑大賺分子標準樣品進行均勻性、穩(wěn)定性分析： (1)標準樣品均勻性分析：為檢查制備的目的核酸標準樣品的均勻性，采用PicoGreen DM分子巧光定量方法及紫外分光光度法，取隨機抽取15管樣品，每管樣品分成2份子樣進 行測試，結果見(表1 )數(shù)據(jù)進行F檢驗(表2)確認樣品均勻性。
[0024] (2)標準樣品穩(wěn)定性分析： 本有證標準樣品參考國外同等帶證有證標準樣品的穩(wěn)定性期限規(guī)定說明 (在真空、避光、-2 (TC下膽存，穩(wěn)定有效期為兩年）為依據(jù)，其生物特性，W 2年為期， 對制備的標準樣品分階段每次取二份樣品，按照不同保存條件進行定性測定，每份樣品W 測定3次值為其定值結果。在全部穩(wěn)定性測試中，所用人員、儀器、測試方法和實驗室均與 均勻性測試相同。
[0025] 依據(jù)上述測定方法分別計算結果，本褐斑大賺分子標準樣品在真空、避 光、-2 (TC下膽存，穩(wěn)定有效期為2年，測定結果見表3。
[0026] 斜率可用下式計算：
7 = 2.9812 X = 11.6 式中： 截距由下式計算： 占0 = F-占1 玄=2.9819 直線上的點的標準偏差可由下式計算：
取其平方根8=0.00251 %，與斜率相關的不確定度用下式計算：
自由度為n-2=5和p=0. 95 (95%置信水平）的學生分布t-因子等于2. 57。由于 ，故斜率是不顯著的。因而穩(wěn)定性實驗中未觀測到不穩(wěn)定性。
[0027] 對實施例1中制得的褐斑大賺分子標準樣品進行靈敏度檢驗： 將該病菌的分子標準品稀釋至lOng/W，作為母液，然后按10倍濃度梯度進行稀釋，按 說明書方法進行PCR檢測。檢測結果表明當該樣品稀釋至1000 (即103X)倍，條帶不可 見，因此判定該標準品的靈敏度為10 3。
[0028] 表1褐斑大賺分子標準品均勻性檢測結果
結論：在95%置信概率下，與其他因素對測試結果的影響相比，樣品的不均勻性是可 接受的。
[0029] 表3褐斑大賺分子標準品穩(wěn)定性檢測結果（-2(TC )
w上內容是結合優(yōu)選技術方案對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定發(fā)明的具體 實施僅限于運些說明。對本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明的構 思的前提下，還可W做出簡單的推演及替換，都應當視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 褐斑大蠊分子標準樣品，其特征在于：采集褐斑大蠊成蟲通過實驗室條件飼養(yǎng)后， 提取高純度DNA，進行分裝、凍干，得到褐斑大蠊的分子標準品，其具有下述的理化性質： (1)形狀：純白色粉末狀；（2)每管的含量1噸±0.1噸 ；（3)0嫩純度：00260/280=1.8-2.0; (4)易溶于水或Tris-EDTA緩沖液中。2. 根據(jù)權利要求1所述的褐斑大蠊分子標準樣品，其特征在于：所述DNA純度： 0D260/280=1. 85。3. 褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： 第一步為褐斑大蠊DNA提取： 野外采集褐斑大蠊成蟲，通過實驗室條件飼養(yǎng)，提取褐斑大蠊DNA ; 第二步為核酸標準樣品的制備： 將測定濃度后的DNA按1呢±0. 1呢/管進行分裝，每種核酸分子標樣分裝100管，然 后凍干，凍干溫度為_5〇°C，壓強為2. 66Pa，凍干所得即為目的標準品。4. 根據(jù)權利要求3所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：所述第一 步中褐斑大爐DNA提取的具體步驟為： (1) 動物組織裂解： 取2-25mg的動物組織置于2mL離心管中，用剪刀剪成碎塊； 加入180ML的Buffer GL、2〇ML的蛋白酶K和IOML的濃度為lOmg/mL的RNase A，于 56°C水浴 中溫浴2-3小時，至動物組織完全裂解，后12, OOOrpm離心2分鐘，去除雜質； (2) 向裂解液中加入200ML Buffer GB和200ML無水乙醇，充分混勻； (3) 將試劑盒中的離心柱安置于收集管上，將上述操作（2)混合溶液移至離心柱中， 12,000 rpm 離 心2分鐘，棄濾液； (4) 將500ML的Buffer WA加入至離心柱中，12, 000 rpm離心1分鐘，棄濾液； (5) 在Buffer WB中加入56mL無水乙醇，混勻后，將700ML的Buffer WB加入至離心柱 中，12, 000 rpm離心1分鐘，棄濾液； (6) 重復操作步驟（5); (7) 將離心柱安置于原來的收集管上，12, 000 rpm離心2分鐘； (8) 將離心柱安置于新的I. 5mL的離心管上，在離心柱膜的中央處加入50-200ML的滅 菌水或洗脫緩沖液，室溫靜置5分鐘； (9) 12, 000 rpm離心2分鐘洗脫DNA。5. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：所述 操作步驟（5)中沿離心柱的管壁四周加入Buffer WB。6. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：所述 步驟（8)中滅菌水或洗脫緩沖液加熱至65°C。7. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：對制 得的標準樣品進行定性鑒定，通過特異性引物進行PCR擴增或測序進行定性分析，來確認 所制備的核酸為目的DNA : 取制備的核酸標準樣品，加入50PL的Tris-EDTA，溶解后作為模板使用，經(jīng)采用特異性 引物COI-I和C0I-2進行PCR并測序，進行定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為目的核 酸樣品； 上游引物 C0I-1: 5' - GGTCA ACAAATCATA AAGATAITGG -3' 下游引物 C0I-2: 5' - TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3' 反應體系： 模板 1. 〇 ML 上游引物C0I-1 1.0 ML 下游引物C0I-2 1.0 ML Taq 酶 0? 5 U dNTP 2.0 m IOXBuffer 2. 5 ML Total 25. 0 M-L 反應條件： 94 °C 3min 95 °C 30s 50 °C 45 s 72 °C Imin 循環(huán) 35 次 72 °C 7min〇8. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：對制 得的標準樣品進行DNA完整性、濃度及純度檢測： (1) DNA完整性檢測：用提取的DNA直接進行120V，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條 帶的完整性； (2) DNA濃度及純度檢測：吸取I y L DNA用分光光度計測定260nm和280nm的吸收值， 然后根據(jù)0D260/0D280值判斷DNA純度，并根據(jù)0D260計算其濃度，按以下公式計算： DNA 濃度（ng/ y I) =0D260 X 50。9. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：對制 得的標準樣品進行均勻性、穩(wěn)定性分析： (1) 標準樣品均勻性分析：采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法及紫外分光光度法， 取隨機抽取的15管標準樣品，每管標準樣品分成2份子樣進行測試，后進行F檢驗確認樣 品均勻性； (2) 標準樣品穩(wěn)定性分析：對制備的標準樣品分階段每次取二份樣品，按照不同保存 條件進行定性測定，每份樣品以測定3次值為其定值結果，且在全部穩(wěn)定性測試中，所用人 員、儀器、測試方法和實驗室均與均勻性測試相同。10. 根據(jù)權利要求3或4所述的褐斑大蠊分子標準樣品的制備方法，其特征在于：對制 得的標準樣品進行靈敏度檢驗：將制得的分子標準品稀釋至l〇ng/W，作為母液，然后按10 倍濃度梯度進行稀釋并進行PCR檢測，由條帶不可見時對應的標準品濃度判定該標準品的 靈敏度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及褐斑大蠊分子標準樣品及其制備方法和應用，屬于媒介生物檢疫技術研究領域。褐斑大蠊分子標準樣品，以采集褐斑大蠊成蟲通過實驗室條件飼養(yǎng)后，提取高純度DNA，進行分裝、凍干，得到褐斑大蠊的分子標準品，其具有下述的理化性質：（1）形狀：純白色粉末狀；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA純度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或Tris-EDTA緩沖液中。本發(fā)明得到的褐斑大蠊的分子標準品，理化性質好，可采用特異性引物通過PCR方法檢測，靈敏度可達到10-3倍，該標準品作為陽性參照物，適用于出入境衛(wèi)生檢疫部門及其他行業(yè)對褐斑大蠊的鑒定檢測，可提高鑒定結果的準確性。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/11
【公開號】CN105002166
【申請?zhí)枴緾N201510504086
【發(fā)明人】姜陸, 宋鋒林, 程曉蘭, 高玉峰
【申請人】姜陸, 宋鋒林
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月17日