1)準確稱取KH2PO4標準品0.0220g于IOOmL容量瓶中，用少量CldH 2O溶解，然后用 ddH20定容至lOOmL，搖勾，配成50 μ g/ml磷標準溶液。
[0173] 2)標準曲線的制作：分別準確吸取50 μ g/ml的磷標準溶液0、2、4、6、8、10ml加入 到50ml的容量瓶中，加 CldH2O至約30ml，再加空白試驗定容后的消煮液5ml，調(diào)節(jié)溶液pH值 至3,然后加鉬鋪抗試劑5ml，最后用ddH20定容至50ml，搖勾，靜置30分鐘后于820nm波長 進行比色。以ΚΗ2Ρ04&度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制磷標準曲線。
[0174] 1.2、測定磷吸收量
[0175] 1)稱取烘干剪碎的植物樣品約0. 5g，置于消煮管中，加入8ml濃硫酸輕輕搖勾。2) 消煮管口放一小漏斗，放在300°C電爐上消煮30min。
[0176] 3)當溶液至微沸并全部呈棕黑色時取下降溫，小心滴加幾滴H2O2，再放入消煮爐 中繼續(xù)消煮，如此反復，直至溶液呈無色或清亮時，取下，冷卻。
[0177] 4)用少量CldH2O沖洗漏斗，洗液流入消煮管中，將消煮液移入50ml容量瓶中，搖 勻，冷卻至室溫。
[0178] 5)加2滴硝基酚指示劑，然后滴加6M NaOH溶液直至溶液變?yōu)辄S色。
[0179] 6)滴加2M硫酸溶液，使黃色剛好褪去。
[0180] 7)加鉬銻抗試劑5ml，加 CldH2O定容至50ml。
[0181] 8)搖勾，靜置30min后，820nm波長下比色，用空白消煮液與鉬銻抗試劑反應液調(diào) 零。
[0182] 按照下述公式計算植物磷吸收量：
[0183] 植物全磷含量（mg/g DW) = OD82tlX (V/m) X (V2A1)
[0184] OD820--換算后待測液中磷的濃度（mg/L)
[0185] 其中V為樣品制備溶液的體積；m為樣品干重（g) J1為吸取反應所用體積；V2為 反應液總體積。
[0186] 2、按照上述方法，將轉(zhuǎn)35S : !ZmPhtl ;5自交株系L-I替換為轉(zhuǎn)回交株系L-2,其 他步驟均不變，分別得到轉(zhuǎn)35S : :ZmPhtl ;5回交株系L-2的玉米植株的總干重、根干重、莖 干重、總根長、根的磷吸收量、莖的磷吸收量及整株的磷吸收量的統(tǒng)計結(jié)果。
[0187] 3、按照上述方法，將轉(zhuǎn)35S : :ZmPhtl ;5自交株系L-I替換為轉(zhuǎn)基因陰性植株，其 他步驟均不變，分別得到陰性對照的玉米植株的總干重、根干重、莖干重、總根長、根的磷吸 收量、莖的磷吸收量及整株的磷吸收量的統(tǒng)計結(jié)果，作為對照。
[0188] 實驗結(jié)果見表1、表2和表3。
[0189] 表1.自交株系L-I磷吸收量和干物重測定結(jié)果
[0190]
[0191] 表2.回交株系L-2磷吸收量和干物重測定結(jié)果
[0192]
[0193] 表3.自交株系L-I和回交株系L-2總根長測定結(jié)果
[0194]
[0195] 實驗證明，本發(fā)明所提供的磷吸收相關(guān)蛋白ZmPhtl ;5及其編碼基因能增加植物 的磷吸收量。低磷條件下生長至20天的轉(zhuǎn)35S: :ZmPhtl;5的玉米自交株系L-I及回 交株系L-2的根的磷吸收量相比于對照分別增加了 15. 2%和26. 9% ;生長至20天的轉(zhuǎn) 35S : :ZmPhtl ;5的玉米自交株系L-I及回交株系L-2莖的磷吸收量相比于對照分別增加 了 19. 7%和29. 9% ;生長至20天的轉(zhuǎn)35S : !ZmPhtl ;5的玉米自交株系L-I及回交株系 L-2的植株總磷吸收量相比于對照分別增加了 19. 6%和27. 0% ;低磷條件下生長至20天 的轉(zhuǎn)35S : :ZmPhtl ;5自交株系L-I和回交株系L-2中的根干重相比于對照分別增加了 45. 0%和58. 5% ;生長至20天的轉(zhuǎn)35S : !ZmPhtl ;5_自交株系L-I和回交株系L-2中的 莖干重相比于對照分別增加了 13. 7%和28. 7% ;生長至20天的轉(zhuǎn)35S : !ZmPhtl ;5_自交 株系L-I和回交株系L-2中的總干重相比于對照分別增加了 16. 4%和27. 7% ;生長至20 天的轉(zhuǎn)35S : :ZmPhtl ;5自交株系L-I和回交株系L-2中的總根長相比于對照分別增加了 94. 0%和 39. 5%。
【主權(quán)項】
1. ZmPhtl ;5或所述ZmPhtl ;5相關(guān)的生物材料在XI)、X2)和/或X3)中的應用： XI)調(diào)控植物磷吸收量； X2)調(diào)控植物生物量； X3)促進植物在低磷條件下對磷的吸收； 所述ZmPhtl ;5為a)或b)或c): a) 氣基酸序列是SEQ ID No. 2所不的蛋白質(zhì)； b) 在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)； c) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的與磷吸收相關(guān)的蛋白質(zhì)； 所述ZmPhtl ;5相關(guān)的生物材料，為下述Al)至A20)中的任一種： Al)編碼所述ZmPhtl ;5的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表達盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體； A4)含有A2)所述表達盒的重組載體； A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物； A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物； A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物； A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織； A14)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織； A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A17)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官； A18)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官； A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官； A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于：A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3) 所示的基因： 1) 其編碼序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述生物 量相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述生物量相 關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子。3. 權(quán)利要求1或2所述ZmPhtl ;5相關(guān)的生物材料或ZmPhtl ;5在培育磷吸收量增加、 生物量增加和/或耐低磷的植物中的應用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應用，其特征在于：所述磷吸收量為根的磷吸收量、莖 的磷吸收量和/或植株總磷吸收量；所述生物量為根干重、莖干重、總干重和/或總根長。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應用，其特征在于：所述植物為陸生植物；所述陸生植 物為雙子葉植物和/或單子葉植物。6. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將權(quán)利要求1所述ZmPhtl ;5的編碼基因?qū)胧?體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的磷吸收量、生物量和/或耐低磷性高于所述 受體植物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述ZmPhtl ;5的編碼基因為如下1)或 2)或3)所示的基因： 1) 其編碼序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述磷吸 收量相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述磷吸收量 相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述磷吸收量為根的磷吸收量、莖的 磷吸收量和/或植株總磷吸收量；所述生物量為根干重、莖干重、總干重和/或總根長。9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述受體植物為陸生植物。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述陸生植物為雙子葉植物或單 子葉植物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了磷吸收相關(guān)蛋白ZmPht1；5在調(diào)控植物磷吸收中的應用。本發(fā)明所提供的磷吸收量相關(guān)蛋白ZmPht1；5為a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與磷吸收量相關(guān)的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明提供的磷吸收量相關(guān)蛋白ZmPht1；5及其編碼基因能增加植物的磷吸收量和生物量，提高了植物對低磷的耐受性。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00, C12N5/10
【公開號】CN104974235
【申請?zhí)枴緾N201510434571
【發(fā)明人】田秀紅, 王昆, 徐媛媛, 趙海銘, 賴錦盛
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年7月22日