人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0053] 可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述ZmPhtl ;5基因表達(dá)盒的重組載體。所述植 物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的Y端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷 酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)粒基因（如 胭脂堿合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基 因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工， 如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、螢光 素酶基因等）、抗生素的標(biāo)記基因（如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦 予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等（如 抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0054] 上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0055] 上述生物材料中，所述的微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。
[0056] 上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0057] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，ZmPhtl ;5的編碼基因（即SEQ ID No. 1所示的DNA 分子）通過(guò)含有ZmPhtl ;5的編碼基因的表達(dá)盒構(gòu)建重組載體。所述重組載體為用SEQ ID No. 1所示的DNA分子替換pCAMBIA3301的Bgl II和EcoR V識(shí)別序列間的DNA片段得 到的重組載體 pCAMBIA3301-ZmPhtl ;5, pCAMBIA3301-ZmPhtl ;5 表達(dá) SEQ ID No. 2 所示的 ZmPhtl ;5 蛋白。所述pCAMBIA3301-ZmPhtl ;5 與 pCAMBIA3301 的差別僅在于將pCAMBIA3301 的Bgl II和EcoR V識(shí)別序列間的DNA替換為SEQ ID No. 1所示的DNA分子。
[0058] 上文中，所述磷吸收量增加的植物可為轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅 包含將所述ZmPhtl ;5基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn) 基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種 的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0059] 上文中，所述植物可為陸生植物，所述陸生植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所 述單子葉植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為玉米。
[0060] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0061] 本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將所述磷吸收量相關(guān)蛋白的編 碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的磷吸收量、生物量和/ 或耐低磷性高于所述受體植物。
[0062] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述磷吸收量相關(guān)蛋白的編碼基因的編碼序列是 如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0063] al)其編碼序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0064] a2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述ZmPhtl ;5 的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0065] a3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述ZmPhtl ;5的 cDNA分子或基因組DNA分子。
[0066] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0067] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述植物可為陸生植物，所述陸生植物可為單子 葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為玉米。
[0068] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述ZmPhtl ;5的編碼基因（即SEQ ID No. 1所示的DNA分 子）通過(guò)含有ZmPhtl ;5基因表達(dá)盒的ZmPhtl ;5基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中。
[0069] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，其中所述ZmPhtl ;5基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo) 入受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：
[0070] 1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所 偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述ZmPhtl ;5基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符 合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地 實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約 60% ；
[0071] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0072] 3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的 選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多 啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于 雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0073] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于 CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā) 明基因進(jìn)行連接；
[0074] 5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列（例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列（例如來(lái)源于TMV，MCMV和AMV)。
[0075] 所述ZmPhtl ;5基因重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA 轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIIIj Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition). )〇
[0076] 上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述ZmPhtl ;5基因轉(zhuǎn)化目的植 物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基 因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所 述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0077] 上述方法中，所述植物可為陸生植物，所述陸生植物可為單子葉植物或雙子葉植 物。所述單子葉植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為玉米。
[0078] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了擴(kuò)增編碼所述ZmPhtl ;5蛋白的核酸分子 全長(zhǎng)或其片段的引物對(duì)。
[0079] 本發(fā)明中，所述磷吸收量具體可為根的磷吸收量、莖的磷吸收量和/或植株總磷 吸收量；所述生物量具體可為根干重、莖干重、總干重和/或總根長(zhǎng)。
[0080] 在本發(fā)明中，所述植物磷吸收量增加具體可為苗期磷吸收量增加。所述苗期磷吸 收量增加具體可體現(xiàn)為與受體植物相比，a)根的磷吸收量大于所述受體植物；b)莖的磷吸 收量大于所述受體植物；c)植株總磷吸收量大于所述受體植物；
[0081] 在本發(fā)明中，所述植物生物量增加具體可為苗期生物量增加。所述苗期生物量增 加具體可體現(xiàn)為與受體植物相比，d)根干重大于所述受體植物；e)莖干重大于所述受體植 物；f)植物總干重大于所述受體植物；g)植物總根長(zhǎng)大于所述受體植物。
[0082] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的磷吸收相關(guān)蛋白ZmPhtl ;5及其編碼基因能增加植 物的磷吸收量和生物量，并提高植物的耐低磷性。低磷（10 μΜ)條件下生長(zhǎng)至20天的轉(zhuǎn) 35S : =ZmPhtl ;