3] 通過乙醇注入法制備脂質(zhì)體，包裹熒光素鈉作為模式藥物。具體方法如下：配制 2 μ g/ml的熒光素鈉水溶液80ml作為水相；將脂質(zhì)體各組分按照表1精確稱量，溶于6ml 無水乙醇中作為有機相。水相和有機相水浴加熱至46°C，然后將水相旋轉(zhuǎn)攪拌，將有機 相快速注射；持續(xù)攪拌30分鐘后，通過超濾離心的方法去除游離的熒光素鈉，最終得到的 HBVpreS/13-32myl:修飾的靶向熒光素鈉脂質(zhì)體HBVpreS/13-32myl:-FS-LCL (長效循環(huán)脂質(zhì)體， Long circulating liposome, LCL)和無祀向肽的普通脂質(zhì)體FS-LCL。制備的脂質(zhì)體通過 激光粒度分析儀檢測脂質(zhì)體顆粒粒徑大小，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，多功能酶標儀和 HPLC檢測各組熒光素鈉的相對熒光強度，并計算熒光素鈉的含量和包封率。
[0074] 表1脂質(zhì)體配方
[0075]
[0076] I. 5靶向性檢測
[0077] 將H印G2-NTCP及H印G2-pCMV對照細胞接種于24孔板，接種濃度5 X IO4/孔，培 養(yǎng)至細胞濃度75%~85%時，分別加入含靶向序列和不含的脂質(zhì)體，設(shè)單純的DMEM培養(yǎng)基 為空白對照組。避光孵育培養(yǎng)1小時后，進行流式細胞分析和激光共聚焦顯微鏡檢測。
[0078] 2·結(jié)果
[0079] 2. l!fepG2-NTCP 細胞成功構(gòu)建
[0080] 將NTCP表達質(zhì)粒pCMV-NTCP轉(zhuǎn)染H印G2細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，對其NTCP的 表達進行鑒定。首先，通過RT-PCR方法在mRNA水平上分析NTCP表達，結(jié)果如圖2 (a) 所示，在1050bp處有一特異性條帶，與NTCP編碼序列大小相符。其次，以熒光標記多肽 HBVpreS/13-59myl:-FITC檢測NTCP在細胞表面的表達情況：流式細胞技術(shù)檢測（圖2，b)和共 聚焦顯微鏡觀察（圖2, c)結(jié)果一致，均表明HBVpreS/13-59myl:-FITC特異性地與H印G2-NTCP 細胞相結(jié)合，提示了 NTCP在細胞膜表面的表達。因此，mRNA水平和蛋白水平均顯示NTCP在 轉(zhuǎn)染后細胞中的表達，提示ifepG2-NTCP細胞株構(gòu)建成功。
[0081] 2. 2HBVpreS/13-32,特異性結(jié)合 NTCP
[0082] 為了驗證多肽HBVpreS/13-32myl:與NTCP的結(jié)合，將
[0083] HBVpreS/13-32胃"-FITC與H印G2-NTCP細胞以及對照細胞H印G2-pCMV共孵育，共 聚焦顯微鏡觀察多肽與細胞結(jié)合情況。結(jié)果表明（圖3):
[0084] HBVpreS/13-32胃r-FITC可以與!fepG2-NTCP細胞特異性結(jié)合（圖3，a)，而無關(guān)對照 多肽P印47-FITC沒有明顯的結(jié)合作用（圖3, b)，與對照細胞
[0085] !fepG2-pCMV也沒有明顯的結(jié)合（圖3, d)，證實了 HBVpreS/13-32myl:與肝細胞表面 NTCP受體結(jié)合，可作為肝細胞靶向的介質(zhì)。
[0086] 2. 3HBVpreS/l3-32Diyr-PEG2〇0〇-DSPE 合成成功
[0087] 肝細胞靶向磷脂復(fù)合物材料HBVpreS/13-32myl:-PEG_-DSPE的合成在4°C條件下 緩慢經(jīng)行，反應(yīng)中加入過量HBVpreS/13-32m'利用HPLC檢測其含量，全程監(jiān)控反應(yīng)進程。 反應(yīng)前后HPLC檢測結(jié)果（圖4, a、b)顯示，反應(yīng)前體系中HBVpreS/13-32myl:檢測的峰高為 123. 045,反應(yīng)后為9. 387,降低了 92. 5%，證明共價加成反應(yīng)的發(fā)生且進行得較完全。反應(yīng) 物 Mal-PEG2ticici-DSPE 和反應(yīng)產(chǎn)物 HBVpreS/13-32胃"-PEG2cicici-DSPE 的 MALDI-T0F-MS 質(zhì)譜結(jié)果 (圖 4, c、d)所示：反應(yīng)物 HBVpreS/lS-SZ1^ 與 Mal-PEG2ticici-DSPE 的平均分子質(zhì)量為 2478. 9 和3028. 4,反應(yīng)產(chǎn)物平均分子質(zhì)量為5278. 7,與HBvpreszlS-SZn1ylr-PEG2c1c1c1-DSPE的分子量相 符，提示 HBvpreszlS-SZn1ylr-PEG2c1c1c1-DSPE 合成成功。
[0088] 2. 4脂質(zhì)體形態(tài)及粒徑分析
[0089] 以HBVpreS/13-32myl:-PEG2(l(l(l-DSPE和表1中的各成分制備脂質(zhì)體，然后對其理化性 狀進行分析。透射電鏡下可見脂質(zhì)體呈球狀，表面光整，大小分布均勻，直徑多在IOOnm以 下（圖5, a、b);激光粒度儀進行粒徑分析，可見有無 HBVpreS/13-32m!T靶向修飾的脂質(zhì)體大 小相當，粒徑大小分別為：（94. 09 ± 10. 5) nm和（117. 08 ± 11) nm，正態(tài)分布（圖5，c、d);經(jīng)多 功能酶標儀和HPLC檢測，HBVpreS/13-32myl:修飾的脂質(zhì)體組的包封率和普通脂質(zhì)體組的包 封率分別為：（89. 32 ± L 02)% 和（85. 78 ±2. 23)%。
[0090] 2. 5HBVpreS/13-32胃"-FS-LCL 具有肝細胞靶向性
[0091] 為 了分析 HBVpreS/13-32胃"修飾脂質(zhì)體 HBVpreS/13-32胃"-FS-LCL 與無修 飾脂質(zhì)體FS-LCL相比，能否更有效地靶向肝細胞、并將其包容物遞送至細胞內(nèi)部，將 HBVpreS/13-32胃1^FS-LCL和FS-LCL分別與H印G2-NTCP細胞孵育，進行流式細胞術(shù)和激光 共聚焦檢測。流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示：相對于普通脂質(zhì)體組FS-LCL和熒光素鈉水溶液 組FS，HBVpreS/13-32 myl:修飾的脂質(zhì)體組HBVpreS/13-32myl:-FS-LCL可以遞送更多的熒光素 鈉進入細胞（圖6, a);而對照組細胞H印G2-pCMV細胞，脂質(zhì)體HBVpreS/13-32myl:-FS-LCL遞 送熒光素鈉效率顯著降低，提示在該過程是NTCP依賴的。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果與流 式結(jié)果相符，相對于熒光素鈉的水溶液FS和單純的普通脂質(zhì)體，HBVpreS/13-32 myl:修飾的 HBVpreS/13-32myl:-FS-LCL靶向脂質(zhì)體組有更強的熒光強度（圖6，bl-b4);而在無 NTCP表達 的H印G2-pCMV細胞中，熒光強度則顯著降低（圖6, b5-b8)?？傊魇胶图す夤簿劢癸@微鏡 結(jié)果均提示脂質(zhì)體可以借助于HBVpreS/13-32 miT的靶向作用，特異性地與肝細胞表面NTCP 結(jié)合，更加高效地將其包容物遞送至細胞內(nèi)部。
【主權(quán)項】
1. 一種靶向肝細胞的化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)如下式1所示： X-B(式 1) 式1中， X為與鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP)特異性結(jié)合的源于乙型肝炎病毒外膜蛋白PreSl區(qū)的多肽；和 B為下式2所示的馬來酰亞胺-聚乙二醇-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚合物 (Mal-PEG-DSPE)：(式2) 式2中，n為2 - 100的整數(shù)，DSPE為硬脂酰基磷脂酰乙醇胺； 其中，X通過式2的馬來酰亞胺部分與B相連。2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，X為乙型肝炎病毒外膜蛋白PreSl區(qū)第 2-119位氨基酸的多肽片段。3. 如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，X為乙型肝炎病毒外膜蛋白PreSl區(qū)第 13-59位氨基酸或第13 - 32位氨基酸的多肽片段。4. 如權(quán)利要求1 一 3中任一項所述的化合物，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如 SEQIDNO: 1、2和3中任一項所示。5. 如權(quán)利要求1 一 4中任一項所述的化合物，其特征在于，式2中，n為2 - 80的整 數(shù)，優(yōu)選5 - 50的整數(shù)，優(yōu)選10 - 40的整數(shù)；或式2中，聚乙二醇的分子量在600 - 2500 的范圍之內(nèi)，優(yōu)選為1000 - 2500,更優(yōu)選為1500 - 2000。6. 如權(quán)利要求1 一 5中任一項所述的化合物，其特征在于，X所示多肽在其C末端還含 有半胱氨酸殘基，通過該半胱氨酸殘基與B的馬來酰亞胺部分相連。7. 如權(quán)利要求1 - 6中任一項所述的化合物，其特征在于，在一個具體實施例中，X所 示多肽在其N末端被脂肪酸修飾，例如被豆蘧酸修飾。8. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物如下式4所示：式中的聚乙二醇的分子量為2000,X的N端被豆蘧酸修飾。9. 一種用于遞送藥物的組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求1 一 8中任一項所 述的化合物，以及磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-DSPE中的一種、任意兩種、或全部三種。10. -種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有權(quán)利要求9所述的用于遞送藥物 的組合物和藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向脂質(zhì)體的制備及其應(yīng)用，具體涉及下式1的靶向肝細胞的化合物、含有該化合物的用于遞送藥物的組合物以及藥物組合物，式1中，X為與鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽(NTCP)特異性結(jié)合的源于乙型肝炎病毒外膜蛋白PreS1區(qū)的多肽；B為下式2所示的馬來酰亞胺.聚乙二醇.硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚合物；式2中，n為2-100的整數(shù)，DSPE為硬脂?；字Ｒ掖及?；其中，X通過式2的馬來酰亞胺部分與B相連。
【IPC分類】A61K47/42, A61P1/16, A61P31/20, C08G65/00, A61K9/127
【公開號】CN104910365
【申請?zhí)枴緾N201410092481
【發(fā)明人】劉宏利, 韓超
【申請人】上海吉貝醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2014年3月13日
【公告號】WO2015135432A1