本發(fā)明屬于細(xì)胞治療和脂質(zhì)體藥物精準(zhǔn)輸送技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體，還涉及一種上述細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的制備方法，還涉及一種上述細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的應(yīng)用，可用于精確靶向NK細(xì)胞。

背景技術(shù)：

當(dāng)前藥物的靶向給藥系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、乳劑、微球、納米粒等，其中脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)是將藥物裝載在由脂類(lèi)分子包裹(脂質(zhì)體)的超微球狀囊泡中，內(nèi)部為水性空間，可以裝載親水性藥物，外層脂質(zhì)分子為親脂性藥物裝載的空間，大小一般在幾個(gè)nm到幾個(gè)μm，分為被動(dòng)和主動(dòng)靶向脂質(zhì)體兩種。目前人們已經(jīng)發(fā)明的各類(lèi)脂質(zhì)體對(duì)靶細(xì)胞的融合隨機(jī)性比較大，特異性相對(duì)較低，限于脂質(zhì)體膜上的有限蛋白的介導(dǎo)，脂質(zhì)體的融合概率相對(duì)較低，由于脂質(zhì)體脂質(zhì)種類(lèi)和修飾以及缺乏蛋白因子的介導(dǎo)，造成其表面成分與靶細(xì)胞表面成分之間存在較大的差異，造成了這種人工脂質(zhì)體與靶細(xì)胞間的融合概率相對(duì)較低，與非靶細(xì)胞的非特異性融合增大，另外，傳統(tǒng)脂質(zhì)體易被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬而被清理，導(dǎo)致藥物的半衰期和有效性大大降低。設(shè)計(jì)針對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型的脂質(zhì)體是該領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展目標(biāo)。

細(xì)胞的膜融合存在同型融合和異型融合方式，均需要細(xì)胞膜上的特殊蛋白介導(dǎo)，其中同型細(xì)胞膜間的融合較容易發(fā)生，如果這些細(xì)胞膜蛋白用于制作脂質(zhì)體，在理論上將會(huì)模擬同類(lèi)型細(xì)胞間的融合，而具有特定細(xì)胞的靶向作用，而且可以降低被視為外援物質(zhì)而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的可能性。而傳統(tǒng)脂質(zhì)體的制作并未對(duì)細(xì)胞膜蛋白仿生脂質(zhì)體作充分的重視，首先，不同類(lèi)型的細(xì)胞表面存在的膜受體及膜融合相關(guān)的蛋白種類(lèi)有差異，通用化運(yùn)用較難，尤其是一些細(xì)胞特異的膜融合蛋白；再者，參與細(xì)胞膜融合的蛋白種類(lèi)較多，不易做相關(guān)蛋白的分離和脂質(zhì)體膜的整合操作；由于大部分膜蛋白是經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的糖基化修飾，重組蛋白一般缺失這些糖基化修飾，酵母表達(dá)的蛋白存在過(guò)度糖基化，使用酵母源的重組蛋白存在產(chǎn)生抗體的風(fēng)險(xiǎn)，而且多種細(xì)胞膜蛋白的重組表達(dá)也將是一個(gè)較大的工作量，上述種種困難，阻礙了人們開(kāi)發(fā)仿細(xì)胞膜脂質(zhì)體的開(kāi)發(fā)。

NK細(xì)胞的過(guò)繼療法對(duì)于腫瘤的治療在過(guò)去很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)獲得了一定的臨床認(rèn)可，NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用為抗原非依賴性的，更加廣譜和高效，在體內(nèi)承擔(dān)腫瘤細(xì)胞殺滅的一線任務(wù)，而且隨著年齡的增加人體NK細(xì)胞的總體功能會(huì)逐漸下降，而腫瘤病人到晚期，NK系統(tǒng)的功能受到嚴(yán)重的損害和抑制，提高這些人群的NK細(xì)胞的功能是延長(zhǎng)病患者生命的一個(gè)重要方面。傳統(tǒng)的過(guò)激免疫療法需要分離病人的血液或者健康人的血液中的NK細(xì)胞，體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)使之具有更強(qiáng)的免疫能力，然后回輸給病人，這個(gè)方法較為昂貴和繁瑣，而且NK細(xì)胞在血液中的比例低，僅占周?chē)馨图?xì)胞總數(shù)的3％～20％，而且體外增殖能力遠(yuǎn)遜于T淋巴細(xì)胞，這些缺點(diǎn)嚴(yán)重妨礙了NK細(xì)胞療法的可操作性和效果的持久性。由于NK細(xì)胞現(xiàn)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種NK細(xì)胞的細(xì)胞系，而且NK細(xì)胞由于免疫原性很低，不存在MHC限制性，避免了移植物抗宿主反應(yīng)，因而同種異體的NK細(xì)胞可用于輸注和治療腫瘤；NK細(xì)胞的永生化可以采用EB病毒誘導(dǎo)，目前已經(jīng)建立了NK-92、HANK1、KHYG-1、NKL、NK-Y、PLT-2、MOTN、IMC-1、SNK-6、SNT-8-1、YT和NK3.3等NK細(xì)胞系。但是上述細(xì)胞系均為腫瘤化的細(xì)胞，直接用于臨床治療的時(shí)候存在安全性等問(wèn)題，但是用這些細(xì)胞的膜制作NK細(xì)胞的仿生脂質(zhì)體，用于體內(nèi)NK細(xì)胞的靶向性治療，從NK細(xì)胞的來(lái)源上來(lái)說(shuō)將是應(yīng)用的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)，也大大減少了用活NK細(xì)胞系治療的安全性問(wèn)題；相比CAR-T細(xì)胞等療法，NK間接體內(nèi)療法存在效應(yīng)期較短的缺陷，NK仿生脂質(zhì)體的便捷注射用藥，可以定期的給病人注射，不斷增強(qiáng)體內(nèi)NK細(xì)胞的免疫活性或者抑制其免疫活性。

腫瘤微環(huán)境具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，NK細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤后常發(fā)生免疫抑制而失去細(xì)胞毒性，包括下調(diào)激活受體DNAM1，NKG2D and NKp30的表達(dá)，降低穿孔素和顆粒酶B(granzyme B)的表達(dá)，而TGF-β信號(hào)是促成NK細(xì)胞免疫活性下調(diào)的關(guān)鍵，因此抑制TGF-β信號(hào)，是提高NK細(xì)胞免疫活性，抑制腫瘤微環(huán)境的免疫耐受的一個(gè)重要環(huán)節(jié)；TGF-β的抑制劑(Ki26894、TEW-7197、LY580276、LY364947,LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、Pirfenidone和PepSox)多數(shù)存在心臟毒性，表現(xiàn)為心臟瓣膜出血、退化和炎癥，該類(lèi)抑制劑通過(guò)抑制TGF-βRI或者ALK5)和/或type II(TGF-βRII)的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性而抑制SMAD2的磷酸化水平。但其細(xì)胞毒性大大限制了該類(lèi)藥物的進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)，增大了病人長(zhǎng)期服藥的危險(xiǎn)性。細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體包裹的TGF-β藥物將大大降低藥物與心臟接觸的概率和濃度，降低或者消除TGF-β抑制劑對(duì)心臟的毒副作用；另外嵌合受體抗原CAR在T細(xì)胞中顯示了較強(qiáng)效果，而在NK細(xì)胞中的應(yīng)用逐漸引起了人們的關(guān)注和興趣，限于NK細(xì)胞的增殖能力有限和體內(nèi)的半衰期較短，CAR-NK的制作目前也遇到了一定的技術(shù)障礙；開(kāi)發(fā)一種新的質(zhì)粒DNA的NK細(xì)胞的靶向方法，提高體內(nèi)NK細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性作用，將可以部分克服當(dāng)前ex-vivo方法制作的CAR-NK的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的解決上述技術(shù)問(wèn)題，基于同型細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)體藥物載體的設(shè)計(jì)，提供一種靶向性的、個(gè)性化的NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體及其制備方法和應(yīng)用，用于藥物或者抗原的體內(nèi)靶向NK細(xì)胞。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體，其特征在于，(1)該脂質(zhì)體藥物載體具有細(xì)胞膜蛋白組分；(2)該脂質(zhì)體藥物載體能夠體外裝載藥物，用于細(xì)胞靶向融合釋放；(3)該脂質(zhì)體所具有的細(xì)胞膜蛋白組分來(lái)自于永生化的自體NK細(xì)胞系。

進(jìn)一步地，裝載的藥物可以為普通化學(xué)藥物、siRNA藥物、mRNA藥物、DNA藥物、蛋白藥物、多肽類(lèi)藥物、免疫增強(qiáng)劑、免疫抑制劑、免疫佐劑中的一種或多種的混合，其中的普通化學(xué)藥物可以為親水、疏水性藥物或雙親性化學(xué)藥物；也可以裝載磁納米顆粒。

一種上述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的制備方法，包括以下步驟：(1)NK細(xì)胞系的培養(yǎng)；(2)NK細(xì)胞系經(jīng)過(guò)免疫激活或免疫抑制，提取免疫激活型細(xì)胞膜或免疫抑制型細(xì)胞膜；(3)NK細(xì)胞仿生脂質(zhì)體的制作和藥物裝載。

所述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體可包封多種單一藥物或多種藥物的組合。

進(jìn)一步地，所述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體是免疫抑制性藥物載體，如裝載免疫抑制劑環(huán)孢素A等免疫抑制劑的仿生脂質(zhì)體。

進(jìn)一步地，所述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體是免疫增強(qiáng)性的藥物載體，如裝載TGF-β抑制劑的仿生脂質(zhì)體，裝載黃芪多糖的仿生脂質(zhì)體。

進(jìn)一步地，所述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體是包封特異性靶向DNA的嵌合抗原受體(CAR)，用于增強(qiáng)NK細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性。進(jìn)一步地，所制得的CAR含有靶向腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原的抗體序列或scFV序列，如抗非糖基化的MUC1鼠源抗體的人源化scFV序列。該CAR還含有CD244的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列和TYROBP的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列。該CAR還含有TYROBP的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列和CD247的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列。該CAR還含有TYROBP的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列、KLRK1和HCST的編碼序列。該CAR所用的質(zhì)粒，除含有TYROBP的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列外，還含有S/MAR等基因組非整合性DNA元件。該CAR所用的質(zhì)粒，除含有CD244的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列外，還含有S/MAR等基因組非整合性DNA元件。該CAR除含有TYROBP的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列和CD247的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列外，還含有S/MAR等基因組非整合性DNA元件。

進(jìn)一步地，所述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體是包封CAR元件的質(zhì)粒和TGF-β抑制劑等免疫調(diào)節(jié)劑。

使用NK仿生脂質(zhì)體包封編碼CAR-NK的質(zhì)粒(非病毒載體)，定期給病人注射這種類(lèi)型的脂質(zhì)體，大大節(jié)省了成本和費(fèi)用，而且更加靈活多樣，定期的加強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫能力，體內(nèi)吞噬質(zhì)粒的NK細(xì)胞將時(shí)刻處于較高的CAR表達(dá)水平。

一種上述NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體在治療癌癥、炎癥、器官移植引起的免疫排斥等自身免疫性疾病的應(yīng)用。

NK細(xì)胞系的培養(yǎng)、細(xì)胞膜提取和NK細(xì)胞仿生脂質(zhì)體的制作如下：

IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、TNF-α和白細(xì)胞調(diào)節(jié)素(leukoregulin,LR)對(duì)NK細(xì)胞的活化和分化有正調(diào)節(jié)作用，體外培養(yǎng)時(shí)加入上述細(xì)胞因子可明顯提高NK細(xì)胞的殺傷活性。前列腺素(PG)E1、E2、D2和腎上腺皮質(zhì)激素等對(duì)NK細(xì)胞的活性有抑制作用。激活型NK細(xì)胞的表面標(biāo)志和抑制型NK細(xì)胞的表面標(biāo)志有一定的差異。在制作NK細(xì)胞的仿生脂質(zhì)體的時(shí)候，針對(duì)使用目標(biāo)可以選擇抑制型和激活型的NK細(xì)胞作為供膜來(lái)源。

對(duì)于治療免疫功能低下的NK仿生脂質(zhì)體藥物載體，可以使用抑制型的NK細(xì)胞膜制作脂質(zhì)體，包封的藥物多用于提高和激活NK細(xì)胞的增殖、病灶內(nèi)的歸巢(homing)、細(xì)胞毒性效應(yīng)和抑制腫瘤耐受等藥物，藥物可以是小分子免疫激活劑、蛋白或多肽免疫激活劑、編碼免疫激活功能的基因質(zhì)粒、抑制免疫耐受相關(guān)基因的siRNA等分子。而對(duì)于免疫耐受有關(guān)的分子，主要是TGF-β、KIR2DL4、IL-2、IL-10、indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)、前列腺素E2等。其中對(duì)TGF-β的抑制是提高NK細(xì)胞活性的一個(gè)重要舉措，比如包封其抑制劑，還可以同時(shí)包封其他起協(xié)同作用的免疫激活或者調(diào)節(jié)劑，如芍藥苷、熊果酸、山奈酚、丹皮素、丹皮酚、淫羊藿苷、人參皂苷、黃芪多糖、茯苓多糖、靈芝多糖等成分。所用NK細(xì)胞膜為激活型NK細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞膜；另外激活NK細(xì)胞的分子主要來(lái)自于NCR(natural cytotoxicity receptor)家族的成員，如NCR1、NCR2,、NCR3等，來(lái)自NKG2家族的個(gè)別成員，如KLRK1(NKG2D)；來(lái)自2B4家族的成員，如CD244；以及TYROBP、HCST、CD3zeta等分子。這些分子可用于過(guò)表達(dá)或者用于構(gòu)建嵌合抗原受體CAR，將NK的廣譜殺傷性作用變?yōu)樘禺悮怨δ?，提高針?duì)腫瘤的特異性細(xì)胞毒性作用。

主要用于癌癥病人的抗腫瘤的治療、HIV病人的免疫力低下引起的病原微生物的感染以及其他免疫力低下的治療，臨床上該類(lèi)型脂質(zhì)體藥物可與免疫球蛋白合用或者替代免疫球蛋白治療。

對(duì)于治療免疫排異等免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的NK仿生脂質(zhì)體，可以使用激活型的NK細(xì)胞膜作為膜供體。包封的藥物多用于免疫抑制類(lèi)的小分子、蛋白、多肽、編碼抑制型分子的質(zhì)粒、免疫激活或者免疫效應(yīng)分子的siRNA分子等藥物。主要用于器官移植后的排斥反應(yīng)、骨髓移植后的排斥的預(yù)防和治療，由于具有較好的靶向性，可以減少因長(zhǎng)期使用抗免疫排斥類(lèi)化學(xué)小分子藥物而引起的毒副作用。免疫抑制型NK細(xì)胞膜脂質(zhì)體藥物：TGF-β抑制劑的NK仿生脂質(zhì)體的制作，需要添加TGF-β的抑制劑Ki26894、TEW-7197、LY580276、LY364947,LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、Pirfenidone和PepSox，進(jìn)一步優(yōu)選LY2109761，濃度400nM-10μM。還可以同時(shí)包封其他起協(xié)同作用的免疫激活或者調(diào)節(jié)劑，如芍藥苷、丹皮素、丹皮酚、淫羊藿苷、人參皂苷、黃芪多糖、茯苓多糖、靈芝多糖等成分。也可以使用免疫抑制劑環(huán)孢素A、嗎替麥考酚酯、他克莫司、西羅莫司和硫唑嘌呤，以及這幾種免疫抑制藥物的混合物。

NK細(xì)胞系可以使用NK-92、HANK1、KHYG-1、NKL、NK-Y、PLT-2、MOTN、IMC-1、SNK-6、SNT-8-1、YT和NK3.3等，進(jìn)一步優(yōu)選地，使用NK-92(ATCC)細(xì)胞系。細(xì)胞膜的提取可使用植物凝集素磁珠法提取。NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體的制作可以采用逆向蒸發(fā)法、薄膜法、梯度反向裝載法、超聲法和雙乳化法等，本專(zhuān)利優(yōu)先采用薄膜法進(jìn)行制備細(xì)胞膜脂質(zhì)體，由于該法具有相對(duì)較小的脂質(zhì)體粒徑和較高的藥物包封率。另外為了除去較大粒徑的脂質(zhì)體，制作的脂質(zhì)體還要經(jīng)過(guò)高分子膜過(guò)濾、擠壓等方法，獲得粒徑更小的脂質(zhì)體。

附圖說(shuō)明

圖1為NK仿生脂質(zhì)體包封質(zhì)粒的讀碼框模式圖；

圖2為NK仿生脂質(zhì)體藥物的包封率測(cè)定；

圖3為包封CAR-Muc質(zhì)粒的NK仿生脂質(zhì)體孵育的NK-92細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PANC1的細(xì)胞毒性分析(IFN-γ的分泌測(cè)定)；

圖4為包封CAR-Muc質(zhì)粒的NK仿生脂質(zhì)體孵育的NK-92細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PANC1的細(xì)胞毒性分析(上清TNF-α的濃度測(cè)定)；

圖5為含S/MAR元件的CAR-Muc激活NK5天后對(duì)PANC1細(xì)胞毒性的分析(上清IFN-γ的濃度)；

圖6為含S/MAR元件的CAR-Muc激活NK5天后對(duì)PANC1細(xì)胞毒性的分析(上清TNF-α的濃度)。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

(1)NK細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞膜的提取

NK-92細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，含10％胎牛血清和/或10％馬血清、0.2mM的肌醇，0.1mM的β巰基乙醇、0.02mM的葉酸、100-200u/ml的重組IL-2、2mM L-谷氨酰胺和1.5g/L碳酸氫鈉和青霉素、鏈霉素雙抗。

NK-92細(xì)胞培養(yǎng)3天后，開(kāi)始用前列腺素E21-10μM、1-100nM地塞米松、40U/ML IL-2和/或重組TGF-β1(10ng/ml)處理2-3天，獲得抑制型的NK-92細(xì)胞。

NK-92細(xì)胞培養(yǎng)3天后，開(kāi)始用10ng/ml IL-12、200-800U/ml IL-2處理2天，獲得激活型的NK-92細(xì)胞。

(2)CAR質(zhì)粒制作：

PUC系列載體，均可以用于NK細(xì)胞的非病毒型CAR質(zhì)粒的構(gòu)建，編碼框帶有一個(gè)強(qiáng)的真核啟動(dòng)子，如EF-1、α-actin、β-actin、UBC、PGK、CMV、SV40等啟動(dòng)子，優(yōu)選EF-1和CMV啟動(dòng)子，進(jìn)一步優(yōu)選CMV啟動(dòng)子，該序列在多種常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中存在。該CAR序列包含一個(gè)信號(hào)肽，優(yōu)先選用TYROBP(GenBank：NM_003332；Uniprot：O43914-1)的信號(hào)肽(aa1-21)、CD244(GenBank：NM_016382；Uniprot：Q9BZW8-1)的信號(hào)肽(aa1-21)和CD247的信號(hào)肽；緊鄰信號(hào)肽之后是scFV序列，任何抗腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異性抗原的抗體及其他抗免疫分子靶標(biāo)抗體的scFV片段均可使用，進(jìn)一步優(yōu)選地，使用抗Mucin非糖基化鼠源單抗的人源化改造的scFV分子，該分子對(duì)鼠源可變區(qū)的框架區(qū)作了部分人源化修飾，重鏈和輕鏈間用(G4S)₃柔性肽連接。ScFV分子之后是跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，使用TYROBP(GenBank：NM_003332)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(aa37-113)；或者CD244(GenBank：NM_016382)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(aa227-370)，或者使用CD247(GenBank：NM_198053)的跨膜區(qū)(aa27-51)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(aa52-164)。因此，在構(gòu)建TYROBP的時(shí)候，只需用scFV序列替代編碼aa22-36的序列，如P7，構(gòu)建CD244的CAR的時(shí)候，只需將scFV序列替代編碼aa22-226的序列，如P8，在構(gòu)建CD247來(lái)源的CAR的時(shí)候，只需用CAR替代其aa22-26，如P9。另外使用真核哺乳動(dòng)物polyA信號(hào)序列，優(yōu)選牛生長(zhǎng)素polyA信號(hào)序列BGH-PA，該序列在多種常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中均存在，可直接將編碼序列直接克隆進(jìn)入其多克隆位點(diǎn)。進(jìn)一步優(yōu)選地，含TYROBP跨膜區(qū)和胞內(nèi)效應(yīng)區(qū)的CAR，還可以添加P2A自切肽，共同表達(dá)KLRK1(GenBank：NM_007360)和HCST基因(GenBank：NM_014266)，增加NK細(xì)胞毒性殺傷信號(hào)，如質(zhì)粒P10,本序列優(yōu)選P2A自切肽編碼序列Seq ID No.1。

來(lái)源CD244的CAR分子C末端可以連接TYROBP的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(aa38-113)，如P11。

含TYROBP跨膜區(qū)和胞內(nèi)效應(yīng)區(qū)的CAR的C末端可以連接CD247的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(aa52-164)，如P12。

為了增強(qiáng)轉(zhuǎn)入NK細(xì)胞內(nèi)的TYROBP或CD244CAR的表達(dá)持久性，減少脂質(zhì)體注射頻率，可以在質(zhì)粒中增加S/MAR序列元件，該序列元件能夠幫助質(zhì)粒非整合性地存在于細(xì)胞核的核質(zhì)中，而且能夠較穩(wěn)定的隨細(xì)胞有絲分裂而傳代，如質(zhì)粒P13、P14和P15。

上所述質(zhì)粒圖見(jiàn)圖1。

(3)NK細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體的制作和藥物包封

薄膜法：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、1,2-二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、膽固醇(Avanti Polar Lipids)，按一定比例(6:1:2:3)溶于氯仿：甲醇(3:1或者2:1或者1:1，V/V)，脂溶性的藥物可在此步驟中加入，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)溶劑，形成薄層。然后脂質(zhì)薄層復(fù)水，從細(xì)胞中提取的膜蛋白(溶于PBS)以1:100-1:800比例(蛋白：膜脂)加入到薄層中，復(fù)水過(guò)程中加入親水性的小分子藥物、mRNA、siRNA、質(zhì)粒等。40-65℃加熱渦旋處理2-6分鐘，重復(fù)2-5次。蛋白在40-65℃下擠過(guò)200nm孔徑的醋酸纖維素濾膜或者聚碳酸酯膜，反復(fù)進(jìn)行10-20次，以降低脂質(zhì)體的孔徑和提高脂質(zhì)體的粒徑均勻度，所獲的單層脂質(zhì)體膜泡經(jīng)過(guò)半透膜透析過(guò)夜純化，或者經(jīng)過(guò)SephadexG-50柱或者類(lèi)似凝膠柱純化，以除去游離的未整合蛋白和雜質(zhì)。對(duì)照脂質(zhì)體的制作，除不添加細(xì)胞膜提取物外，其他步驟、工藝和內(nèi)容物均相同。

免疫抑制型NK細(xì)胞膜脂質(zhì)體藥物：TGF-β抑制劑的NK仿生脂質(zhì)體的制作，需要添加TGF-β的抑制劑Ki26894、TEW-7197、LY580276、LY364947,LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、Pirfenidone和PepSox，進(jìn)一步優(yōu)選LY2109761，濃度400nM-10μM。還可以同時(shí)包封其他起協(xié)同作用的免疫激活或者調(diào)節(jié)劑，如芍藥苷、丹皮素、丹皮酚、淫羊藿苷、人參皂苷、黃芪多糖、茯苓多糖、靈芝多糖等成分，也可以使用免疫抑制劑環(huán)孢素A、嗎替麥考酚酯、他克莫司、西羅莫司和硫唑嘌呤，以及這幾種藥物的混合物。所用細(xì)胞膜為免疫激活型NK細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞膜。

CAR質(zhì)粒藥物的NK仿生脂質(zhì)體的制作，分別制作含有質(zhì)粒P7、P8、P9、P10、P11、P12以及對(duì)照為空載的NK仿生脂質(zhì)體，質(zhì)粒裝載抗MUC1抗體的scFV分子，質(zhì)粒濃度為0.3μg/μl-3μg/μl，優(yōu)選1μg/μl質(zhì)粒。所用NK細(xì)胞膜為抑制型或者激活型NK細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞膜。

上述藥物可以進(jìn)行組合包封，質(zhì)粒和TGF-β抑制劑混合包裝，或者質(zhì)粒/TGF-β抑制劑/免疫激活-調(diào)節(jié)劑混合包裝，也可以將包封好的單體藥物脂質(zhì)體進(jìn)行組合搭配使用。

(4)NK細(xì)胞仿生脂質(zhì)體的粒徑、電位和包封率

激光粒度分析儀檢測(cè)未包封藥物的NK細(xì)胞膜脂質(zhì)體、包封TGF-β抑制劑LY2109761、包封質(zhì)粒和包封質(zhì)粒/LY2109761很合物的脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位，結(jié)果見(jiàn)表1。包封率的檢測(cè)，脂質(zhì)體和藥物混合物進(jìn)過(guò)18000g離心20-30分鐘，收集非脂質(zhì)體部分，TGF-β的抑制劑和環(huán)孢素A的測(cè)定，則進(jìn)行HPLC測(cè)定非脂質(zhì)體部分上清的藥物含量，黃芪多糖可以采用HPLC或蒽酮法測(cè)定上清的濃度，總藥物減去非包封部分的量除以總量的百分率即為包封率，結(jié)果見(jiàn)圖2，顯示了NK仿生脂質(zhì)體的較好的包封能力。

表1NK仿生脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位

(5)包封CAR-Muc的NK仿生脂質(zhì)體孵育的NK-92對(duì)靶細(xì)胞PANC1的細(xì)胞毒性分析

1×10⁵個(gè)NK-92細(xì)胞接種96孔板中，轉(zhuǎn)染對(duì)照空載仿生脂質(zhì)體、P7、P8、P9、P10、P11、P12的包封的NK細(xì)胞仿生脂質(zhì)體1-10μl，脂質(zhì)體事先用無(wú)血清、無(wú)抗生素RPMI-1640或Hanks也稀釋至20-50μl，靜置10-20分鐘，然后滴加每孔NK-92細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)20-28小時(shí)，然后進(jìn)行細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)。Muscin脫糖基化的PanC1細(xì)胞，用作靶細(xì)胞，1×10⁴細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)前4小時(shí)接種96孔板，收獲事先轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的NK-92效應(yīng)細(xì)胞，加入到PanC1細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)6-24小時(shí)，本實(shí)施例選用12小時(shí)，效應(yīng)：靶細(xì)胞(E:T)為10:1。收集上清液，ELISA法測(cè)定IFN-γ(PeproTech試劑盒)、TNF-αELISA(PeproTech試劑盒)，結(jié)果見(jiàn)圖3-圖4，結(jié)果顯示，幾種CAR均具有較好的細(xì)胞毒性激活能力，細(xì)胞質(zhì)信號(hào)嵌合型的質(zhì)粒顯示了一定的增效作用，而過(guò)表達(dá)KLRK1和HCST的CAR具有一定的增效作用。

(6)用S/MAR元件質(zhì)粒包封的仿生脂質(zhì)體的細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)

P7、P8、P13、P14、P15質(zhì)粒和對(duì)照空載仿生脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，更換培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)5天，然后測(cè)定細(xì)胞因子釋放。1×10⁴PanC1靶細(xì)胞與上述處理的NK-92細(xì)胞(1:10)共孵育12小時(shí)，然后ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液上清中的IFN-γ和TNF-α含量，結(jié)果見(jiàn)圖5-圖6。結(jié)果顯示S/MAR序列對(duì)細(xì)胞傳代后依然具有較好的NK細(xì)胞激活作用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。