一種20(R)-人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物制 備方法和應(yīng)用，屬于藥品保健品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參阜苷Rg3(ginsenosides Rg3)是原人參二醇型四環(huán)三砲阜苷，分子式為 C42H72O13，相對(duì)分子質(zhì)量為784.30，化學(xué)名為20 (R)-達(dá)瑪烷烯二醇-3-0-?Η)_葡萄吡喃糖基 (l-2)-0-D-葡萄吡喃糖。人參皂苷Rg3主要有2種常見構(gòu)型，20(R)-Propanaxadiol和20(S)_ Propanaxadiol，其中 20(R)-Propanaxadiol為優(yōu)勢構(gòu)型。20(R)-人參皂苷Rg3(20(R)-ginsenosides Rg3)是中國第一個(gè)中藥單體抗癌新藥，是人參阜苷中起抗腫瘤作用的有效 成分之一，可以有效抑制腫瘤新生血管增長，進(jìn)而抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移等，對(duì)前列腺癌、肺 癌、胃癌、肝癌等癌癥具有較好的治療效果。單獨(dú)使用Rg3的缺點(diǎn)是其水溶性和脂溶性都很 低，因此，生物利用度較低。
[0003] 脂質(zhì)體作為藥物載體已有30多年的歷史，大豆卵磷脂作為一種天然的可食用材料 無毒性、適合體內(nèi)吸收和降解，與一定比例的膽固醇制備成天然脂質(zhì)體，用于包封20(R)_人 參皂苷Rg3藥物，能提高藥物生物利用度、延長藥物作用時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 目前，抗腫瘤藥物的靶向細(xì)胞遞送受到廣泛關(guān)注，大量研究結(jié)果表明，多數(shù)腫瘤細(xì) 胞表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞，并且葉酸(folic acid，F(xiàn)A)對(duì)葉 酸受體具有高度親和性。因此可將脂質(zhì)體藥物與FA偶聯(lián)，經(jīng)葉酸受體介導(dǎo)靶向遞送到這些 腫瘤細(xì)胞中，而且FA作為靶向分子具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如相對(duì)分子質(zhì)量小、無免疫原性、 價(jià)廉易得、穩(wěn)定性好、靶向應(yīng)用范圍廣泛等。FA偶聯(lián)脂質(zhì)體作為給藥載體可以有效的實(shí)現(xiàn)藥 物的靶向遞送，提高藥物的局部保存濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒 副作用等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵 磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)體藥物，輔料成分安全 無毒性，具有靶向性，能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝入率，有效提高20(R)_人參皂苷Rg3的生 物利用度。
[0006] 發(fā)明構(gòu)思是:本發(fā)明以20(R)_人參皂苷Rg3、天然大豆卵磷脂為主要材料輔以膽固 醇制備脂質(zhì)體，采用薄膜分散超聲方法實(shí)現(xiàn)20 (R)-人參皂苷Rg3的有效包封，再用葉酸包封 修飾制備成革El向脂質(zhì)體藥物。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷 月旨/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將大豆卵磷脂溶于氯仿中，加入膽固醇，震蕩使其充分混合均勻，用氮?dú)饬鞔?干形成均勻薄膜，放置真空干燥箱中過夜，制備脂質(zhì)體；
[0009] (2)將20(R)_人參皂苷Rg3預(yù)先溶解在無水乙醇中配制成20(R)_人參皂苷Rg3溶 液，向脂質(zhì)體中加入20(R)_人參皂苷Rg3溶液和雙蒸水浸泡，反復(fù)超聲振蕩使薄膜溶解至澄 清，制得包封20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體；
[0010] (3)加入葉酸溶液復(fù)合20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體，在常溫下超聲振蕩至澄清，制 得葉酸靶向性修飾的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物。
[0011 ] 進(jìn)一步的，步驟(1)所述的大豆卵磷脂與膽固醇摩爾比為1:1~6:1，優(yōu)選3:1。
[0012] 進(jìn)一步的，步驟(2)中空白脂質(zhì)體與20(R)_人參皂苷Rg3的質(zhì)量比為5:1~15:1，優(yōu) 選 10:1〇
[0013] 進(jìn)一步的，步驟⑵中20(R)-人參皂苷Rg3溶液濃度為2mg/mL。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟(2)中20(R)_人參皂苷Rg3溶液和雙蒸水體積比為2:8。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的步驟(3)葉酸的終濃度為10~40yg/mL，優(yōu)選20yg/mL。
[0016]進(jìn)一步的，步驟(2)中在45~55°C下反復(fù)超聲振蕩使薄膜溶解至澄清。
[0017]本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)由上述方法制得20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉 酸脂質(zhì)體藥物。
[0018] 本發(fā)明第三個(gè)目的是請(qǐng)求保護(hù)上述20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉 酸脂質(zhì)體藥物在抗癌、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明提供一種新的同時(shí)裝載藥物和復(fù)合葉酸的復(fù)合靶向脂質(zhì)體藥物，本發(fā)明的 復(fù)合脂質(zhì)體組分中采用的天然大豆卵磷脂極好的構(gòu)建了仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的天然脂質(zhì)體。本發(fā) 明通過優(yōu)化大豆卵磷脂和膽固醇及包封藥物的配比得到20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體，減小 了 20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體的粒徑，同時(shí)增強(qiáng)了脂質(zhì)體藥物的穩(wěn)定性;再經(jīng)過葉酸對(duì)包 封20(R)_人參皂苷Rg3藥物脂質(zhì)體的靶向修飾后，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的靶向藥物遞送。
[0020] 本發(fā)明的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體對(duì)藥物具有高包 封率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體包封率可以達(dá)到90%以上，本發(fā)明 20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備方法簡單、高效，輔料成 分安全無毒性，能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝入率，有效提高20(R)_人參皂苷Rg3的生物利用 度；制備的復(fù)合脂質(zhì)體細(xì)胞毒性低、具有緩釋性，延長藥物的療效，在物理學(xué)表征和體外生 物學(xué)研究中均已得到了良好的評(píng)價(jià)效果，所得藥物能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，安全高效、靶向性 強(qiáng)、為抗癌藥物的研究開發(fā)提供了新的途徑。
【附圖說明】
[0021] 圖1為20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體方法專屬性試驗(yàn)色譜 圖；其中1為20(R)_人參皂苷Rg3脂質(zhì)體，2為20(R)_人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品，3為空白脂質(zhì)體； [0022]圖2為脂質(zhì)體粒徑分布圖；
[0023]圖3為脂質(zhì)體電荷分布圖；
[0024]圖4為透射電鏡(TEM)檢測結(jié)果圖；其中A為空白脂質(zhì)體TEM檢測分析圖；B為20(R)_ 人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/脂質(zhì)體TEM檢測分析圖；C為FA10-20(R)_人參皂苷Rg3/ 大豆卵磷脂/膽固醇/脂質(zhì)體TEM檢測分析圖；
[0025]圖5為203nm波長的包封率測定結(jié)果；
[0026] 圖6為不同脂藥比的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體作用于 葉酸受體(FR)陽性表達(dá)率較高的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(H460)細(xì)胞毒性的測定結(jié)果；其 中，1為空白脂質(zhì)體;2為脂藥比5:1的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì) 體;3為脂藥比10:1的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體;4為脂藥比15: 1的20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，如無特 殊說明，本發(fā)明所涉及化學(xué)試劑及藥品均市售可得，如無特殊說明，所涉及的方法均為常 規(guī)方法。
[0028] 實(shí)施例1
[0029]稱取大豆卵磷脂溶于氯仿中（lmg/lmL)，加入膽固醇(大豆卵磷脂與膽固醇摩爾比 為1:1 )，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧?，放置真空干燥箱中過夜，制 備脂質(zhì)體。
[0030] 將20(R)_人參皂苷Rg3藥物預(yù)先溶解在無水乙醇中，配制成2mg/mL的溶液，再按照 比例加入對(duì)應(yīng)體積量。按脂藥比5 :1的比例分別加入人參皂苷Rg3無水乙醇和雙蒸水（比例 為2:8)浸泡約2h，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體20(R)_人參皂 苷Rg3脂質(zhì)體。
[0031] 加入葉酸溶液終濃度為1(^/1^、2(^/11^、3(^/1^、4(^/1^分別復(fù)合20(1〇-人參 皂苷Rg3脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸靶向性修飾的藥物脂質(zhì)體。
[0032] 實(shí)施例2
[0033]稱取大豆卵磷脂溶于氯仿中（lmg/lmL)，加入膽固醇(大豆卵磷脂與膽固醇摩爾比 為3:1 )，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧ぃ胖谜婵崭稍锵渲羞^夜，制 備脂質(zhì)體。
[0034] 將20(R)_人參皂苷Rg3藥物預(yù)先溶解在無水乙醇中，配制成2mg/mL的溶液，再按照 比例加入對(duì)應(yīng)體積量。按脂藥比10:1的比例分別加入20(R)_人參皂苷Rg3無水乙醇和雙蒸 水(比例為2:8)浸泡約2h，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體。
[0035] 加入葉酸溶液終濃度為1(^/11^、2(^/1]^、3(^/1]^、4(^/1]^分別復(fù)合20(1〇-人參 皂苷Rg3脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸靶向性修飾的藥物脂質(zhì)體?六10-PC-ChoI-Rg3、FA20-PC-ChoI-Rg3、FA30-PC-ChoI-Rg3、FA40-PC-ChoI-Rg3。
[0036] 實(shí)施例3
[0037] 稱取大豆卵磷脂溶于氯仿中（lmg/lmL)，加入膽固醇(大豆卵磷脂與膽固醇摩爾比 為6:1 )，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧?，放置真空干燥箱中過夜，制 備脂質(zhì)體。
[0038] 將20(R)_人參皂苷Rg3藥物預(yù)先溶解在無水乙醇中，配制成2mg/mL的溶液，再按 照比例加入對(duì)應(yīng)體積量。按脂藥比15:1的比例分別加入20 (R)-人參皂苷Rg3無水乙醇和雙 蒸水(比例為2:8)浸泡約2h，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體。
[0039] 加入葉酸溶液終濃度為1(^/11^、2(^/1]^、3(^/1]^、4(^/1]^分別復(fù)合20(1〇-人參 皂苷Rg3脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸靶向性修飾的藥物脂質(zhì)體。
[0040] 實(shí)施例4 20(R)_人參皂苷Rg3/大豆卵磷脂/膽固醇脂質(zhì)體包封率測定
[0041] ⑴確定檢測波長:采用高效液相色譜法
[0042] 精密稱取20(R)_人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品20yL進(jìn)樣分析，記錄峰面積。
[0043]⑵色譜條件
[0044] 色譜柱:Agilent?0DS &8柱(4.6\25〇!11111，5以111);流動(dòng)相：乙腈 :水(￥:￥ = 45:55); 檢測波長:203nm;流速:0.7mL/min;進(jìn)樣量:20yL;柱溫:室溫。
[0045] ⑶方法專屬性試驗(yàn)
[0046]分別精密移取20(R)_人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品、大豆卵磷脂/膽固醇空白脂質(zhì)體、20 (R)-人參皂苷Rg3脂質(zhì)體適量20yL進(jìn)樣檢測，記錄峰面積。如圖1所示，20(R)_人參皂苷Rg3 標(biāo)準(zhǔn)品在203nm處有特征的吸收峰，保留值為24min。
[0047]⑷包封率測定方法
[0048]采用超濾離心法分離游離藥物來測定2