酶。
[0042] 所述在NADPH熒光探針的N端和/或C端融合的多肽包括定位到不同亞細胞器的 信號肽，所述亞細胞器為核排阻、細胞核、線粒體基質(zhì)、細胞內(nèi)膜、細胞外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基 體、線粒體膜間質(zhì)等，其氨基酸序列如SEQ ID NO :23-30所示。
[0043] 所述在NADPH熒光探針的N端和/或C端融合的多肽包括用于純化或者免疫印跡 的標簽，所述標簽為6個組氨酸（6*His)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)、 SUm〇、myc、Flag等。
[0044] 所述在NADPH熒光探針的N端和/或C端融合的多肽包括熒光蛋白，所述熒光蛋 白來自維多利亞水母的GFP (Seq ID N013)及其突變體BFP (Seq ID N014)等、或者來源 于珊瑚的紅色熒光蛋白mcherry (SEQ ID N0:15)，mKate (SEQ ID N0:16)及其突變體。
[0045] 所述在NADPH熒光探針的N端和/或C端融合的多肽包括以NADP (H)為輔酶的 酶，所述酶為葡萄糖-6磷酸脫氫酶（SEQ ID NO :17)，異檸檬酸脫氫酶1型或2型（SEQ ID N0:18-19)，蘋果酸脫氫酶1型（SEQIDN0:20)，煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（SEQIDN0 :21)，谷 氧還蛋白（SEQ ID NO :22)等。
[0046] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
[0047] 本發(fā)明還提供一種表達載體，所述的表達載體由載體質(zhì)粒與所述的核酸序列操作 性連接得到的。
[0048] 本發(fā)明所述表達載體選自原核表達載體、真核表達載體和病毒載體。
[0049] 本發(fā)明所述原核表達載體，優(yōu)選的是，由載體質(zhì)粒pRSETb與所述的核酸序列操作 性連接得到的。
[0050] 本發(fā)明還提供一種包含所述的表達載體的宿主細胞。
[0051] 本發(fā)明還提供所述的熒光探針在檢測NADPH或藥物篩選中的應(yīng)用。
[0052] 本發(fā)明還提供一種用于檢測NADPH、篩選藥物的試劑盒，所述的試劑盒包含說明書 和所述的熒光探針。
[0053] 本發(fā)明所述融合蛋白，其包含所述基因編碼的NADPH熒光探針；優(yōu)選的是，所述融 合蛋白是由所述熒光探針與特異性亞細胞定位信號融合形成的，所述定位信號可將目標蛋 白定位于指定的亞細胞器內(nèi)。
[0054] 本發(fā)明所用的用于對NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋白序列可以來自于維多利亞多管 發(fā)光水母（Aequorea victoria)的突光蛋白及其衍生物，包括但不局限于這些突變體：環(huán) 狀重排藍色熒光蛋白（cpBFP),環(huán)狀重排綠色熒光蛋白（cpGFP),環(huán)狀重排黃色熒光蛋白 (cpYFP)，環(huán)狀重排綠色熒光蛋白（cpTFP)等的序列，其中環(huán)狀排列的黃色熒光蛋白cpYFP 的序列；和/或來自于海洋珊瑚的紅色熒光蛋白（RFP)及其衍生物，包括但不局限于這些突 變體：環(huán)狀重排橘黃色熒光蛋白（cpmOrange):環(huán)狀重排蘋果紅熒光蛋白（cpmApple)，環(huán)狀 重排紅色突光蛋白（cpmKate)等。
[0055] 本發(fā)明技術(shù)中用于對NADPH敏感的多肽來源于嗜熱水生菌的T-Rex蛋白，它由 ydih基因編碼。Rex蛋白是一種廣泛存在于革蘭氏陽性菌中并對細菌氧化還原勢敏感的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，分子量約為23kDa，它能調(diào)控發(fā)酵和厭氧呼吸。不同種屬的Rex蛋白結(jié)構(gòu)非 常類似，它們都是由NAD(P)H結(jié)合域和DNA結(jié)合域組成的同源二聚體，其中NADH結(jié)合域是 典型的Rossmann結(jié)構(gòu)域，它可以結(jié)合輔因子NAD (H)，NADP(H)及其類似物ATP等，但是對 NAD (H)的親和力強于NADP (H)，因此天然的Rex蛋白在細胞內(nèi)主要感應(yīng)胞質(zhì)NADH/NAD+比率 的變化，在NADH/NAD+比率動態(tài)變化的過程中Rex蛋白的空間構(gòu)象也會發(fā)生很大改變。因 此，Rex蛋白是一個很好的細胞內(nèi)NADH及其類似物檢測探針的候選者，而我們可以對Rex蛋 白進行改造，產(chǎn)生一個對于NADPH響應(yīng)的多肽用于探針構(gòu)建。
[0056] 目前蛋白質(zhì)活性位點結(jié)構(gòu)比對（Comparison of Protein Active Site Structures)在蛋白質(zhì)改造中應(yīng)用非常普遍。我們通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫（Protein database)中NAD(H)結(jié)合蛋白和NADP(H)結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進行比對，由CPASS打分就 可以獲知Rex蛋白對于NADH和NADPH結(jié)合口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基。對這些氨基酸進行理 性設(shè)計，就可能會獲得一種對于NADPH特異性結(jié)合而對于NADH不結(jié)合的人工多肽，這個多 肽可以用于NADPH的探針構(gòu)建。
[0057] 本發(fā)明中構(gòu)建的是基于單生色團熒光蛋白的基因編碼熒光探針，它是由環(huán)狀重排 的熒光蛋白（cpFP)和對配體敏感的蛋白融合產(chǎn)生。這種構(gòu)建方式是將熒光蛋白插入到后 者的柔性松散區(qū)域，這個柔性松散區(qū)域可以根據(jù)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)推測，通常是兩個結(jié)構(gòu)域 之間的一段環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)特別適合構(gòu)象變化后力的傳遞。熒光蛋白有兩百多個氨基 酸，它的插入可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的折疊能力變差、熒光探針失去熒光等，因此熒光蛋白的插 入位點的選擇很重要。另外，合理的熒光蛋白插入位點一般和支架蛋白的配體結(jié)合關(guān)鍵位 點之間不存在直接聯(lián)系，因此對支架蛋白的配體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸的改造，產(chǎn)生的新的配體 結(jié)合性質(zhì)就可以衍生出相似性質(zhì)的熒光探針。除此之外，熒光蛋白和對配體特異性結(jié)合的 支架蛋白融合的連接區(qū)氨基酸數(shù)目和性質(zhì)也非常關(guān)鍵，它們直接決定支架蛋白結(jié)合配體后 構(gòu)象變化產(chǎn)生的力傳遞到熒光蛋白的效率，因此探針構(gòu)建必須對連接區(qū)氨基酸進行篩選。
[0058] 本發(fā)明中將理性突變獲得的對NADPH特異性結(jié)合而對NADH不敏感的Rex蛋白突 變體和環(huán)狀重排的熒光蛋白（cpFP)進行融合并改造，希望可以篩選獲得新型的基因編碼 的NADPH熒光探針。理論上，對NADPH特異性結(jié)合的T-Rex蛋白突變體可以感受環(huán)境內(nèi) NADPH的濃度變化，并將這一構(gòu)象變化傳遞至臨近的環(huán)狀重排的熒光蛋白，通過對熒光變化 的測量，就可以對環(huán)境中NADPH的濃度改變進行實時且直觀地描述。
[0059] 本發(fā)明中，可以將NADPH熒光探針和其他蛋白多肽在氨基酸或羧基端融合，這種 融合一般不會改變熒光探針的性質(zhì)，同時可以擴大探針的應(yīng)用。例如將NADPH熒光探針 和信號肽相連，可以將熒光探針定位到特定的亞細胞器中進行表達，檢測該亞細胞器內(nèi)的 NADPH濃度；將NADPH熒光探針和多種融合標簽相連，可以使該探針在多種宿主細胞內(nèi)表達 純化或者免疫印跡進行相關(guān)的生化研究；將NADPH熒光探針和沒有光譜交叉的熒光蛋白融 合，可以將該探針改造為對pH不敏感的熒光探針；將NADPH熒光探針和以NADP(H)為輔酶 的酶融合表達，可以通過檢測NADPH的濃度變化，實時檢測酶底物和產(chǎn)生之間的比例差異。
[0060] 本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，其內(nèi)含有對環(huán)境內(nèi)NADPH敏感的多肽， 和通過光譜性質(zhì)的改變對環(huán)境內(nèi)NADPH進行表現(xiàn)的部分。在一個實施方式中，所述通過光 譜性質(zhì)的改變對環(huán)境內(nèi)NADPH進行表現(xiàn)的部分是熒光蛋白或其衍生物。
[0061] 在一個實施方式中，本發(fā)明還提供一種熒光探針，其包含熒光團以及嗜熱水生菌 T-Rex蛋白的突變體或和T-Rex蛋白序列同源性90%以上的其他嗜熱菌Rex蛋白的類似物。 在另一實施方式中，本發(fā)明還提供一種熒光探針，其包含熒光團以及嗜熱水生菌T-Rex蛋 白的突變體。本發(fā)明還提供一種熒光探針，其包含熒光團以及嗜熱水生菌T-Rex蛋白突變 體的可溶性片段。
[0062] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種熒光探針，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:67-69。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供一種熒光探針，在至少85個氨基酸殘基內(nèi)任何 與氨基酸序列SEQ ID N0:90-109具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的同源或非同 源序列。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種突光探針，包含在至少85個氨基酸殘基內(nèi)任 何與氨基酸序列SEQ ID N0:67-69實質(zhì)上相似或相同的同源或非同源序列。在優(yōu)選實施方 式中，本發(fā)明提供一種熒光探針，包含氨基酸序列SEQ ID N0:90-109的變異體或衍生物。
[0063] 本發(fā)明提供一種核酸序列，包含核苷酸序列SEQ ID N0:64_66。在優(yōu)選實施方 式中，本發(fā)明提供一種核酸序列，包含在至少85個堿基長度內(nèi)任何與核苷酸序列SEQ ID NO: 70-89具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的同源或非同源序列。在另一實施方式 中，本發(fā)明提供一種核酸序列，包含在至少85個堿基與核苷酸序列SEQ ID NO:64-66實質(zhì) 上相似或相同的核苷酸序列；在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供一種核酸序列，包含核苷酸序 列SEQ ID NO:70-89的變異體或衍生物。
[0064] 本發(fā)明還涉及上述核酸序列的互補序列和變異體，其可包含編碼本發(fā)明熒光探針 或融合蛋白的片段、類似物、衍生物、可溶性片段和變異體的核酸序列或其互補序列。
[0065] 本發(fā)明提供的表達載體，其包含與表達控制序列操作性連接的本發(fā)明核酸序列。 所述表達控制序列可以是復(fù)制起點、啟動子、增強子、操縱子、終止子、核糖體結(jié)合位點等。 [0066] 本發(fā)明提供的制備本發(fā)明熒光探針或融合蛋白的方法，包括以下步驟：
[0067] a.將本發(fā)明表達載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，
[0068] b.在適合所述宿主細胞表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞，和 [0069] c.由所述宿主細胞分離所述熒光探針或融合蛋白。
[0070] 本發(fā)明還提供所述熒光探針或融合蛋白在檢測NADPH中的應(yīng)用。在一個實施方式 中，本發(fā)明提供所述熒光探針或融合蛋白在體外或體內(nèi)檢測NADPH中的應(yīng)用。在一個實施 方式中，本發(fā)明提供所述熒光探針或融合蛋白在亞細胞水平檢測NADPH中的應(yīng)用。在一個 實施方式中，本發(fā)明提供所述熒光探針或融合蛋白在原位檢測NADPH中的應(yīng)用。在另一個 實施方式中，本發(fā)明提供所述熒光探針或融合蛋白在篩選藥物中的應(yīng)用，所述藥物可用于 調(diào)節(jié)對象的NADPH水平。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供所述熒光探針或融合蛋白在診 斷疾病中的應(yīng)用，所述疾病與NADPH水平有關(guān)。
[0071] 本發(fā)明還提供了一種檢測NADPH的試劑盒，其中包含本發(fā)明熒光探針或融合蛋 白。所述檢測可以在體內(nèi)、體外、亞細胞或原位水平進行。本發(fā)明還提供一種篩選藥物的試 劑盒，所述藥物可用于調(diào)節(jié)對象的NADPH水平，所述試劑盒包含有效量的本發(fā)明熒光探針 或融合蛋白。本發(fā)明還提供了一種用于檢測與NADPH水平有關(guān)的疾病的試劑盒，所述試劑 盒包含有效量的本發(fā)明融合蛋白。在使用時，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)所述融合蛋白的活 性方便地確定所述的有效量。
[0072] 本發(fā)明中的蛋白質(zhì)和核酸序列優(yōu)選以分離形式提供，更優(yōu)選地被純化至均質(zhì)。
[0073] 發(fā)明詳述
[0074] I.定義：
[0075] 在給出數(shù)值或范圍時，本文所用術(shù)語"約"指該數(shù)值或范圍在給定數(shù)值或范圍的 20%以內(nèi)、10%以內(nèi)和5%以內(nèi)。
[0076] 本文所用術(shù)語"包含"、"包括"和其等同形式包括"含有"以及"由……組成"的含 義，例如"包含" X的組合物可僅由X組成或可含有其它物質(zhì)，例如X+Y。
[0077] 在本發(fā)明中，術(shù)語"Rex蛋白"指的是一種廣泛存在于革蘭氏陽性菌中并對細菌 氧化還原勢敏感的調(diào)控蛋白（由ydih基因編碼)，分子量為23kDa，它能調(diào)控發(fā)酵和厭氧呼 吸。本技術(shù)中的"T-Rex蛋白"來源于嗜熱水生菌（Thermus aquaticus)，它們含有典型的 Rossmann結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合輔因子NAD(H)及其類似物。Rex蛋白可以感應(yīng)胞質(zhì)NADH/NAD+ 比率的變化，在NADH/NAD+比率動態(tài)變化的過程中Rex蛋白的空間構(gòu)象也會發(fā)生很大改變。 本發(fā)明中所涉及的"T-Rex蛋白"可以包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1編碼的氨基酸序列。本 發(fā)明中所涉及的"柔性區(qū)域"是指蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)中存在的一些特定的如環(huán)狀結(jié)構(gòu)域等結(jié) 構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)域相比于蛋白質(zhì)的其他高級結(jié)構(gòu)具有更高的移動性和柔性，并且該區(qū)域可以 在該蛋白質(zhì)和配體結(jié)合后，空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生動態(tài)變化。本發(fā)明所涉及的柔性區(qū)域主要指 T-Rex蛋白中的插入位點所在區(qū)域，如D112-G119區(qū)域，以及D188-G192等區(qū)域。
[0078] 本文所用術(shù)語"CPASS" 或"Comparison of Protein Active Site Structures" 或"蛋白質(zhì)活性位點結(jié)構(gòu)比對"，它是一種基于蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基位點的 晶體結(jié)構(gòu)比對方法，在蛋白質(zhì)改造中應(yīng)用非常普遍。本文使用的技術(shù)通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫 (Protein database)中NAD(H)結(jié)合蛋白和NADP (H)結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進行比對，由程序 自動打分就可以獲知T-Rex蛋白對于NADH和NADPH結(jié)合口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基。對這些 氨基酸進行理性設(shè)計，就可能會獲得一種對于NADPH特異性結(jié)合而對于NADH不結(jié)合的人工 多肽，這個多肽可以用于NADPH的探針構(gòu)建。因此，"CPASS "是一種對氨基酸配體親和力進 行改造的優(yōu)良的方法。
[0079] 本文所用術(shù)語"T-Rex蛋白突變體"或"T-Rex突變體"或"理性設(shè)計的T-Rex突變 體"是指應(yīng)用蛋白質(zhì)活性位點結(jié)構(gòu)比對（CPASS)程序之后，將獲得的預(yù)測結(jié)果在天然的嗜熱 水生菌T-Rex蛋白上NADH結(jié)合口袋上的關(guān)鍵氨基酸90-91位，112-116位，130位，148位 發(fā)生了突變，這些突變可以改變T-Rex蛋白結(jié)合NADH和NADPH的性質(zhì)，提高突變體對NADPH 的結(jié)合能力，降低或消除對于NADH的結(jié)合能力。本發(fā)明中所涉及的"T-Rex蛋白突變體"可 以包含氨基酸序列SEQ ID NO :30-54以及與SEQ ID N030有90%以上同源的多肽如SEQ ID N03-5。
[0080] 本文所用術(shù)語"NAD (P) H"是對NADH和NADPH的統(tǒng)稱，"NAD (H) "分別是對NAD+和 NADH的統(tǒng)稱，"NADP(H) "是對NADP+和NADPH的統(tǒng)稱。NAD(P)H的兩種分子在光學(xué)上不可分 辨，因此在很多文獻上將其合稱為NAD (P)H。而NAD(H)和NADP(H)是一種分子的氧化形式 和還原形式，而且它們的功能相關(guān)，因此很多研究者也將它們并稱。
[0081] 本文所用術(shù)語"融合蛋白"與"熒光融合蛋白"和"重組熒光融合蛋白"同義，指包 含第一種多肽或蛋白質(zhì)或者其片段、類似物或衍生物的氨基酸序列，以及異源多肽或蛋白 質(zhì)（即，不同于第一種多肽或蛋白質(zhì)或者其片段、類似物或衍生物的第二種多肽或蛋白質(zhì) 或者其片段、類似物或衍生物）的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。在一個實施方式中，融合蛋 白包含與異源蛋白質(zhì)、多肽或肽融合的熒光蛋白。按照這個實施方式，異源蛋白質(zhì)、多肽或 肽可能是或不是不同類型熒光蛋白。在一個實施方式中，與融合于異源蛋白質(zhì)、多肽或肽之 前的原始多肽或蛋白質(zhì)的活性相比，融合蛋白保持或提高了活性。在一個【具體實施方式】中， 融合蛋白包含與異源蛋白質(zhì)、多肽或肽融合的熒光探針，所述異源蛋白質(zhì)、多肽或肽可以是 特異性亞細胞定位信號。而本文所用術(shù)語中的"NADPH熒光探針"或"NADPH熒光探針蛋白" 特指與熒光蛋白融合的對環(huán)境中NADPH敏感的多肽，所述對環(huán)境內(nèi)NADPH敏感的多肽具體 可以是T-Rex蛋白突變體或來源于其他嗜熱菌和T-Rex蛋白有90%以上同源性的Rex蛋白 突變體，其利用T-Rex蛋白突變體中專一性的NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)Rossman結(jié)構(gòu)域與NADPH結(jié) 合后產(chǎn)生的構(gòu)象變化引起的熒光蛋白的構(gòu)象變化，進而導(dǎo)致熒光蛋白的熒光發(fā)生改變，并 借助不同NADPH濃度下測定的熒光蛋白的熒光繪制標準曲線，進而檢測并分析NADPH的存 在和/或水平。
[0082] 本文中所用術(shù)語"支架蛋白"是指具有配體親和能力的蛋白，該蛋白可以和熒光蛋 白融合形成該配體特異性的熒光探針。支架蛋白和配體結(jié)合后，通常有較大的構(gòu)象變化，通 過將熒光蛋白插入到構(gòu)象變化較大的區(qū)域后，這種動態(tài)變化就可能傳遞到與之臨近的熒光 蛋白上，并導(dǎo)致熒光性質(zhì)的變化。例如本發(fā)明中的"T-Rex蛋白突變體"就是一種支架蛋白， 它可以和NADPH結(jié)合，并產(chǎn)生較大的構(gòu)象變化。
[0083] 在本發(fā)明中，與熒光團融合的Rex蛋白突變體可以是嗜熱水生菌屬T-Rex蛋白突 變體的全長或其片段（SEQ ID N030-54)，優(yōu)選是嗜熱水生菌T-Rex蛋白突變體的DNA結(jié)構(gòu) 域截短體，即T-Rex蛋白突變體的氨基酸85-211 (SEQ ID N045-54)。
[0084] 本文所用術(shù)語"生色團"，"熒光團"與"熒光蛋白"同義，指在激發(fā)光照射下發(fā)出 熒光的蛋白質(zhì)。熒光蛋白作為生物科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)檢測手段，例如生物技術(shù)領(lǐng)域常用的 綠色熒光蛋白GFP及由該蛋白突變衍生出的環(huán)狀重排的藍色熒光蛋白（cpBFP)、環(huán)狀重排 的綠色熒光蛋白（cpGFP)、環(huán)狀重排的綠色熒光蛋白（cpTFP)、環(huán)狀重排的黃色熒光蛋白 (cpYFP)等；還有本技術(shù)領(lǐng)域常用的紅色熒光蛋白RFP，及由該蛋白衍生出來的環(huán)狀重排的 蛋白，如 cpmApple, cpmOrange, cpmKate 等。
[0085] 本文所用術(shù)語"GFP"指綠色熒光蛋白，最初是從維多利亞發(fā)光水母（Aequorea victoria)中提取出來的，由238個氨基酸構(gòu)成，分子量約為26kDa。GFP是由12條β -折 疊鏈形成了獨特的桶狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包裹著生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)。當(dāng)在氧氣存在 下，它會自發(fā)形成對-羥基苯亞甲基咪唑啉酮的生色團結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生熒光。GFP產(chǎn)生熒光不需 要輔因子，而且熒光非常穩(wěn)定，是一種良好的成像工具。GFP有兩個激發(fā)峰，395nm的主峰可 產(chǎn)生508nm的發(fā)射光，而肩峰475nm的激發(fā)光照射則會產(chǎn)生的503nm的發(fā)射光。
[0086] 本文所用術(shù)語"RFP"指紅色熒光蛋白，最初是從海洋中的珊瑚中提取的，野生的 RFP是寡聚體蛋白不利于生物體的融合表達，隨后在RFP的基礎(chǔ)上進一步衍生出了不同顏 色波段的紅色突光蛋白，其中最常用的是mcherry和mKate等。
[0087] 本文所用術(shù)語"cpFP"指環(huán)狀重排的熒光蛋白，該蛋白最早衍生自綠色熒光蛋白 GFP，其氨基酸序列與GFP同源性高達90%以上。它是將GFP的原始N端和C端通過一段柔 性的短肽鏈連接，而在野生型GFP近生色團位置（如Y144和N145位氨基酸）制造一個新的 N端和C端，將原第145-238位氨基酸部分作為新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作為新 蛋白的C端，兩片段間通過5~9個具有柔性的短肽鏈，如VDGGSGGTG或GGSGG等連接，形 成一個對空間變化敏感的環(huán)狀排列黃色熒光蛋白cpGFP(SEQ ID N07)。目前已經(jīng)創(chuàng)造了多 種環(huán)狀重排的熒光蛋白（cpFP)用于熒光探針的構(gòu)建，其中應(yīng)用最廣泛一種是cpYFP，其氨 基酸序列為SEQ ID NO:6。
[0088] "接頭"或"連接區(qū)"指在本發(fā)明多肽、蛋白質(zhì)或核酸中連接兩個部分的氨基酸或核 苷酸序列。在本發(fā)明NADPH熒光探針內(nèi)部的多肽或蛋白質(zhì)中進行連接時，接頭的長度不大 于5個氨基酸，優(yōu)選不大于4個氨基酸，更優(yōu)選是1-3個氨基酸。而當(dāng)重組熒光蛋白探針作 為基本單元和功能蛋白連接時，可以融合在重組熒光蛋白探針的氨基酸或羧基端