基因編碼的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸熒光探針及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因編碼熒光探針及其制備方法 和應用。一方面本發(fā)明涉及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的檢測探針，具體涉及還原 型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的重組熒光融合蛋白檢測探針。在又一方面，本發(fā)明也涉及 上述檢測探針的制備方法及其在檢測NADPH中的應用。
【背景技術】
[0002] 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)是體內(nèi)重要的輔酶之一，它不僅參與 了細胞內(nèi)的脂類、脂肪酸和核苷酸等物質(zhì)的合成代謝反應并為該反應過程提供還原力；還 通過重生還原型谷胱甘肽，硫氧還蛋白等抗氧化物質(zhì)維持著細胞內(nèi)的氧化還原勢；另外它 也可以通過細胞色素 P450蛋白等參與細胞的去毒反應，降解細胞內(nèi)的毒性物質(zhì)；除此之 外，它還可以通過NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧類（R0S)，調(diào)芐基因表達、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和免 疫反應等（Agledal，L.等，Redox R印.2010, V. 15(1)，PP. 2-10)。因此，NADPH 和細胞代謝、 氧化還原代謝和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導等生命過程有緊密的關系，而與NADPH代謝相關的眾多酶 類也成為了藥物設計的靶標（R〇hle，D.等，Science. 2013, V. 340(6132) :，PP. 626-630)。
[0003] 但是，大多數(shù)細胞內(nèi)游離的NADPH含量非常低，Ig濕重的小鼠肝臟大約含 有0.1 ymol的NADP(H)，其中絕大部分都是以結合形式存在的（Reiss，P.D.等，Anal Biochem. 1984, V. 140(1)，pp. 162-171)。在不同細胞類型和亞細胞器中，游離的NADPH和 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)的比例略有變化，例如線粒體中的游離NADPH和NADP 的比例通常高于10:1，而在細胞胞漿中還原狀態(tài)的NADPH甚至占到了游離NADP(H)部分的 99% 左右（Veech，R.L.等，Biochem J. 1969, V. 115 (4)，pp. 609-619)。早期的紫外分光光度 法是利用NADPH的光吸收性質(zhì)，但是該方法的靈敏度很差且不能有效地區(qū)分還原型煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸（NADH)與NADPH。隨后發(fā)展的酶學方法是依據(jù)NADP +和NADPH可以在酶作 用下互相轉(zhuǎn)化的性質(zhì)，但是這種檢測方法受到外界環(huán)境，酶的活性以及分析儀器的靈敏度 限制。另外還有一些物理化學檢測方法，如HPLC分析、電化學法、毛細管電泳等，雖然它們 的精度較高，但是在活細胞研究中存在很大的缺陷。它們需要經(jīng)過耗時的樣品處理時間(細 胞破碎、分離提取純化等)，而NADPH在環(huán)境中非常容易氧化，因此這些方法不能應用于細 胞或活體動物的實時準確地檢測。這些檢測方法測量的是細胞群體，掩蓋了細胞之間的差 異，限制了它們在臨床疾病診斷及藥物前體研究等鄰域的應用。目前雖然存在檢測NADH和 NADH:NAD+ 比例的基因編碼熒光探針（Zhao, Y.等，Cell Metabolism. 2011，V. 14(4)，pp. 55 5-566)，但是它們依然存在熒光強度低，動態(tài)變化范圍小以及不合適于線粒體檢測等劣勢， 最為重要的是它們不能用于細胞內(nèi)NADPH的檢測。
[0004] 雖然目前可以利用自發(fā)熒光的方法在細胞或活體上進行NADPH的實時檢測，但是 這種方法存在嚴重的局限性：首先，不能有效的區(qū)分NADH與NADPH，由于它們的熒光光譜 完全相同，因而檢測的信號是NADH與NADPH總量之和；另外游離的NAD(P)H含量很低，所 以測量的NAD(P)H的自發(fā)熒光信號，反映的其實是蛋白質(zhì)結合的NAD(P)H的熒光（Zhang. Q. Η·等，Science. 2002, V. 295 (5561)，ρρ· 1895-1897);其次，NADPH 的激發(fā)波長位于近紫外 區(qū)（340nm)，它的穿透力很弱且長時間照射會造成嚴重的細胞損傷，用于自發(fā)熒光檢測的儀 器價格也非常昂貴，這些局限性都制約了該方法在活細胞中的應用。因此，本研究領域亟需 發(fā)展一種特異性檢測NADPH的技術，特別是適合于生理水平的時空特異性檢測NADPH的技 術。
[0005] 相對于傳統(tǒng)的小分子化學染料以及迅速發(fā)展的量子點檢測技術，基因編碼的熒光 蛋白探針在活細胞成像方面具有很大優(yōu)勢?；蚓幋a的熒光蛋白探針存在光毒性小、可以 基因編碼，并能夠通過基因操作的方法在細胞、組織乃至整個器官中進行表達，因此熒光探 針是優(yōu)異的單細胞代謝小分子的實時指示器?；蚓幋a的熒光蛋白探針是由熒光蛋白和對 配體特異性結合的支架蛋白組成的。
[0006] 最早發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白是綠色熒光蛋白GFP(SEQ ID N013)，它是從維多利亞發(fā)光水 母（Aequorea victoria)中提取出來的，由238個氨基酸構成，分子量約為26kDa。GFP是由 11條β -折疊鏈形成了獨特的桶狀結構，其內(nèi)包裹著生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)。當在 氧氣存在下，它會自發(fā)形成對-羥基苯亞甲基咪唑啉酮的生色團結構而產(chǎn)生熒光。GFP產(chǎn)生 熒光不需要輔因子，而且熒光非常穩(wěn)定，是一種良好的成像工具。GFP有兩個激發(fā)峰，395nm 的主峰可產(chǎn)生508nm的發(fā)射光，而肩峰475nm的激發(fā)光照射則會產(chǎn)生的503nm的發(fā)射光 (Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, V. 91 (26)，PP. 12501-12504)。隨著對 GFP 蛋白突變的研究不斷深入，目前產(chǎn)生了很多不同顏色的突變體例如熒光增強型綠色熒光蛋 白（eGFP)、黃色熒光蛋白（YFP)、青色熒光蛋白（CFP)、藍色熒光蛋白（BFPSeq ID N014)， 綠色熒光蛋白（TFP)等。除此之外，科學家還在海洋珊瑚中發(fā)現(xiàn)了第一種紅色熒光蛋白 (RFP)，經(jīng)過不斷的改造產(chǎn)生了多種商業(yè)化的紅色熒光蛋白突變體，其中最常用的紅色熒光 蛋白，一種是搜桃紅突光蛋白mcherry(Seq ID N015)，它的激發(fā)峰在587nm，發(fā)射峰在621nm (Tsien，R.Y.等，Nat Methods. 2008, V. 5(6)，ρρ· 545-551);另一種是mKate(Seq ID N016)， 它的光譜和 mcherry 類似（Shcherbo，D.等，Nature Methods. 2007, V. 4(9)，ρρ· 741-746) 等。
[0007] 基因編碼的熒光探針的主要構建方式是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)和基于單生色 團的熒光蛋白，其中后者的主要形式是天然熒光蛋白質(zhì)的環(huán)狀重排。例如將GFP的原始N 端和C端通過一段柔性的短肽鏈連接，而在野生型GFP近生色團位置(如Y144和N145位氨 基酸)制造一個新的N端和C端，就可以形成一個對空間構象變化非常敏感的環(huán)狀排列熒光 蛋白（circularly permuted fluorescent protein)。目前已經(jīng)創(chuàng)造了多種環(huán)狀重排的突 光蛋白（cpFP)用于熒光探針的構建，如環(huán)狀重排藍色熒光蛋白（cpBFPSeq ID N08)，環(huán)狀重 排綠色熒光蛋白（cpEGFPSeq ID N07)，環(huán)狀重排黃色熒光蛋白（cpYFPSeq ID N06)，環(huán)狀重 排綠色熒光蛋白（cpTFPSeq ID N09)，環(huán)狀重排橙色熒光蛋白（cpmOrange Seq ID N010)， 環(huán)狀重排蘋果紅突光蛋白（cpmAppleSeq ID N011)，環(huán)狀重排紅色突光蛋白（cpmKateSeq ID N012)等（Zhao, Υ·等，Science, 2011，V333 (6051)，ρρ· 1888-1891)，其中 cpYFP 在熒光 探針的構建和應用中非常普遍（Nagai，Τ·等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，V. 98 (6)， ρρ· 3197-3202)。
[0008] 本技術中用于對NADPH進行表現(xiàn)的多肽來源于嗜熱水生菌（Thermus Aquaticus) 的Rex蛋白（T-Rex)，它是由ydih基因編碼（Seq ID N01)。Rex蛋白是一種廣泛存在于革 蘭氏陽性菌中并對細菌氧化還原勢敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，分子量約為23kDa，它能調(diào)控發(fā)酵 和厭氧呼吸（Sickmier，E.A.等，Structure, 2005, V13(l), PP. 43-54)。不同種屬的 Rex 蛋 白結構非常類似，它們都是由NAD (P) H結合域和DNA結合域組成的同源二聚體，其中NAD⑵ H結合域是典型的Rossmann結構域，它可以結合輔因子NAD (H)，NADP (H)及其類似物ATP 等，但是它對NAD (H)的親和力強于NADP (H)，因此天然的Rex蛋白在細胞內(nèi)主要感應胞質(zhì) NADH和NAD+比率的變化，在NADH和NAD+比率動態(tài)變化的過程中Rex蛋白的空間構象也會 發(fā)生很大改變（Brekasis，D.等，EMBO J. 2003, V. 22(18)，PP. 4856-4865)，因此，Rex 蛋白 是一個很好的細胞內(nèi)NADH及其類似物檢測探針的候選者，而我們可以通過對Rex蛋白進行 理性突變改造，產(chǎn)生一個對于NADPH響應的多肽用于探針構建。
[0009] 將理性突變獲得的對NADPH特異性結合而對NADH不敏感的Rex蛋白突變體和環(huán) 狀重排的熒光蛋白（cpFP)進行融合并改造，可能會篩選獲得新型的基因編碼的NADPH熒光 探針。理論上，對NADPH特異性結合的Rex蛋白突變體可以感受環(huán)境內(nèi)NADPH的濃度變化， 并將這一構象變化傳遞至臨近的環(huán)狀重排的熒光蛋白，通過對熒光變化的測量，就可以對 環(huán)境中NADPH的濃度改變進行實時且直觀地描述。
[0010] 綜上所述，我們認為利用包含理性突變的Rex蛋白的重組熒光融合蛋白能夠滿足 在生理水平和亞細胞水平上檢測NADPH的迫切需要。
[0011] 不應認為對本文所述參考文獻的引用或討論意味著承認這些參考文獻是本發(fā)明 的現(xiàn)有技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為了解決上述問題，本發(fā)明的第一個目的是提供基因編碼的NADPH熒光探針。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供編碼基因編碼的NADPH熒光探針的核苷酸序列。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供基因編碼的NADPH熒光探針的制備方法。
[0015] 本發(fā)明的第四個目的是提供包含基因編碼的NADPH熒光探針的融合蛋白。
[0016] 本發(fā)明的第五個目的是提供編碼含有NADPH熒光探針的融合蛋白的核苷酸序列。
[0017] 本發(fā)明的第六個目的是提供包含編碼NADPH熒光探針核苷酸序列的表達載體。
[0018] 本發(fā)明的第七個目的是提供包含本發(fā)明所述表達載體的宿主細胞。
[0019] 本發(fā)明的第八個目的是提供基因編碼的NADPH熒光探針在檢測NADPH或篩選藥物 中的應用。
[0020] 本發(fā)明的第九個目的是提供一種試劑盒，其包含本發(fā)明所述的基因編碼的NADPH 熒光探針和說明書。
[0021] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0022] 本發(fā)明提供基因編碼的NADPH熒光探針，包括：對NADPH敏感的多肽B和對NADPH 進行表現(xiàn)的熒光蛋白A ;所述對NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用導致熒光蛋白A熒 光強度的變化。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明所述的基因編碼的NADPH熒光探針，優(yōu)選的是，來源于對NADH敏感的 嗜熱水生菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-Rex蛋白的突變體，所述T-Rex蛋白如SEQ ID NO :2所示，所 述突變體是通過對T-Rex蛋白的NADH結合口袋的關鍵氨基酸90-91位，112-116位，130 位，148位進行突變而改造為對NADPH敏感的多肽B，優(yōu)選如SEQ ID NO :30-44所示；或
[0024] 與來源于對NADH敏感的嗜熱水生菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-Rex蛋白同源性高達90% 以上的氨基酸序列，所述T-Rex蛋白如SEQ ID N02所示，如來源于Thermus oshimai JL-2 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :3 所不，來源于 Marinithermushydrothermalis DSM14884 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :4 所不，來源于 Deinococcusproteolyticus MRP 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :5所示等，所述突變是在NADH結合口袋的關鍵氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位進行突變。
[0025] 本發(fā)明所述對NADH敏感的嗜熱水生菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-Rex蛋白的突變體，突變 體是通過對T-Rex蛋白的NADH結合口袋的關鍵氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位進行突變而改造為對NADPH敏感的多肽B，其中112-116位氨基酸組成了 NAD)H結合口 袋，其112-114位的突變可以為T/S112, R113, T/S/K114,而115-116位的突變可以為P/ A115&Q116或G/A/P115&E116 ;而90-91位，130位，148位為結合口袋三維結構上臨近的氨 基酸，可以調(diào)節(jié)多肽B結合NAD⑵H的親和力，其突變可以為D90, K/R91，V/T/Y130或V/A/ T148。
[0026] 本發(fā)明對NADPH敏感的多肽B可以來源于和嗜熱水生菌T-Rex蛋白同源性在90% 以上的其他嗜熱菌Rex蛋白突變體，它們的關鍵氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位氨基酸于T-Rex蛋白相同或者性質(zhì)相似，如來源于Thermus oshimai JL-2的Rex蛋白如 SEQ ID NO :3 所不，來源于 Marinithermushydrothermalis DSM14884 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :4 所不，來源于 Deinococcusproteolyticus MRP 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :5 所不等。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所述的基因編碼的NADPH熒光探針，進一步優(yōu)選的是，所述的對NADPH 敏感的多肽B來源于對NADH敏感的嗜熱水生菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-Rex蛋白突變體，所述 T-Rex蛋白如SEQ ID NO: 2所示，所述突變體是通過對T-Rex蛋白的NADH結合口袋的關鍵 氨基酸90-91位，112-116位，130位，148位進行突變而改造為對NADPH敏感的多肽B的 DNA結構域的截短體(如SEQ ID NO :45-54所示）。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述熒光探針的組合形式是對 NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋白A插入到對NADPH敏感的多肽B中，將B分為兩個部分，B的第 一部分Bl和B的第二部分B2,形成的探針結構式B1-A-B2 ;所述熒光蛋白A的插入位點 是對 NADPH 敏感多肽 B 的 79/80,99/100,112/113,112/114,166-167,187/188,188/189， 189/190,187/189,187/190,188/190位，或者其家族蛋白的對應氨基酸位點。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，優(yōu)選的是，所述熒光探針的組合 形式是對NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋白A插入到對NADPH敏感的T-Rex蛋白的突變體多肽B 中，將B分為兩個部分，B的第一部分Bl和B的第二部分B2,形成的探針結構式B1-A-B2 ;所 述熒光蛋白A的插入位點是對NADPH敏感的T-Rex蛋白的突變體多肽B的79/80,99/100， 112/113,112/114,166-167,187/188,188/189,189/190,187/189,187/190,188/190 位，或 者其家族蛋白的對應氨基酸位點。
[0030] 本發(fā)明所述熒光蛋白A的插入位點，進一步優(yōu)選的是對NADPH敏感的T-Rex蛋白 的突變體多肽 B 的 112/113,112/114,188/189,189/190 (如 SEQ ID NO :55-58 所示）。
[0031] 本發(fā)明所述基因編碼的NADPH熒光探針，優(yōu)選的是，所述對NADPH敏感的多肽B含 有關鍵氨基酸突變體的DNA結合域截短體78-212,如SEQ ID NO :45-54所示。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述的NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋 白A選自：維多利亞水母的環(huán)狀變換的綠色熒光蛋白的突變體cpGFP如SEQID NO :7所示及 其同源突變體藍色熒光蛋白cpBFP如SEQ ID NO :8所示、黃色熒光蛋白cpYFP如SEQ ID NO :6所示、綠色熒光蛋白cpTFP如SEQID NO :9所示，和/或來自于海洋珊瑚的紅色熒光 蛋白及其衍生物，包括但不局限于這些突變體：環(huán)狀重排橘黃色熒光蛋白如SEQ ID NO :10 所示、環(huán)狀重排蘋果紅突光蛋白cpmApple如SEQ ID NO :11所示、環(huán)狀重排紅色突光蛋白 cpmKate 如 SEQ ID NO :12 所不；等。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述的NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋 白A，優(yōu)選的是，來自于維多利亞水母的環(huán)狀變換的綠色熒光蛋白的突變體如SEQ ID NO: 6-9所示。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述的NADPH進行表現(xiàn)的熒光蛋 白A，進一步優(yōu)選的是，來自于維多利亞水母的環(huán)狀變換的黃色熒光蛋白cpYFP如SEQID NO :6所示。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，對NADPH敏感的多肽B和對NADPH 進行表現(xiàn)的熒光蛋白A之間可直接或通過柔性氨基酸操作性連接；所述柔性氨基酸是甘氨 酸，丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸；所述柔性氨基酸的數(shù)目，優(yōu)選的是不超過5個（SEQ IDN059); 所述柔性氨基酸的數(shù)目，進一步優(yōu)選的是不超過4個（SEQ IDN060);所述柔性氨基酸的數(shù) 目，更優(yōu)選的是不超過3個（SEQ IDN061-62);所述柔性氨基酸的數(shù)目，最好是氨基端的數(shù)目 為3個，羧基端的數(shù)目1個（SEQIDN063)。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述熒光探針的氨基酸序列為： SEQ ID NO :67-69。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，優(yōu)選的是，所述熒光探針的氨基 酸序列 SEQ ID NO :90-109。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，所述熒光探針由SEQ ID NO : 64-66所示的基因編碼。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明提供的優(yōu)選基因編碼的NADPH熒光探針，所述熒光探針由SEQ ID NO : 70-89所示的基因編碼：。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明提供的基因編碼的NADPH熒光探針，本發(fā)明還提供和編碼所述熒光探 針的核苷酸序列互補的核酸序列。
[0041] 本發(fā)明還提供一種融合蛋白，將所述的NADPH熒光探針作為基本單位，在其N端和 /或C端融合其他多肽；該融合蛋白不影響所述的NADPH熒光探針的性質(zhì)，用于擴大所述的 NADPH熒光探針的應用，所述在NADPH熒光探針的N端和/或C端融合的多肽包括定位到 不同亞細胞器的信號肽、用于純化或者免疫印跡的標簽、熒光蛋白或以NADP (H)為輔酶的