配制PCR反應(yīng)體系A(chǔ)、B、C、D和Ε，即取適量的反應(yīng) 液與DNA模板進(jìn)行混合，最后加入適量的純水補(bǔ)足反應(yīng)總體積。各PCR反應(yīng)體系的組分見(jiàn) 表7至表11。
[0077] 表7 PCR反應(yīng)體系A(chǔ)的組分
[0078]
[0079] 表8 PCR反應(yīng)體系B的組分
[0080]
[0082] 表9 PCR反應(yīng)體系C的組分
[0083]
[0084] 表10 PCR反應(yīng)體系D的組分
[0085]
[0086] 表11 PCR反應(yīng)體系E的組分
[0087]
[0088] 2) PCR反應(yīng)程序：
[0089] 隨后在實(shí)時(shí)焚光定量 PCR儀（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序，最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)槿绫?2所示的Touch down PCR反應(yīng)程序。
[0090] 表12 PCR反應(yīng)程序表
[0091]
[0092] 其中，在"變性-退火-延伸"的前14個(gè)PCR循環(huán)程序中，第一個(gè)循環(huán)退火溫度為 62度，第二個(gè)循環(huán)退火溫度為61. 5度，后面的循環(huán)依次每次退火溫度降低0. 5度。
[0093] 4、PCR檢測(cè)結(jié)果判定：
[0094] 根據(jù)已知的實(shí)驗(yàn)樣品（對(duì)照）制定的判讀標(biāo)準(zhǔn)為：
[0095] 第一步，采用PCR反應(yīng)體系E檢測(cè)樣本的β-actin基因，若樣本擴(kuò)增CT值在23~ 25范圍內(nèi)，判斷為樣品有效；否則判斷為樣品無(wú)效，需重新制備樣本，使樣本濃度為10~ 50ng/ μ I，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之間，再重新用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0096] 第二步，采用兩種多態(tài)性ARMS引物的PCR反應(yīng)體系A(chǔ)和B分別檢測(cè)同一個(gè)樣本的 MTHFR基因 c. 1298位點(diǎn)。
[0097] 若兩個(gè)反應(yīng)體系擴(kuò)增的CT值都在20~30范圍內(nèi)，則：
[0098] 1)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）< 2,樣本 判斷為雜合基因型；
[0099] 2)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）彡3時(shí)，樣本判斷為CT值小 的一方所對(duì)應(yīng)的等位基因純合型。
[0100] 3)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）彡2且< 3時(shí)，樣本判斷為 結(jié)果不可信，需重新制備樣本，使樣本濃度為10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之間，再重新用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0101] 若兩個(gè)反應(yīng)體系擴(kuò)增的擴(kuò)增的CT值中至少一個(gè)小于20或大于30,樣本判斷為結(jié) 果不可信，需重新制備樣本，使樣本濃度為10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之間，再重新用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0102] 第三步，采用兩種多態(tài)性ARMS引物的PCR反應(yīng)體系C和D分別檢測(cè)同一個(gè)樣本的 MTHFR基因 c. 677位點(diǎn)。
[0103] 若兩個(gè)反應(yīng)體系擴(kuò)增的CT值都在20~30范圍內(nèi)，則：
[0104] 1)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）< 2,樣本 判斷為雜合基因型；
[0105] 2)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）彡3時(shí)，樣本判斷為CT值小 的一方所對(duì)應(yīng)的等位基因純合型。
[0106] 3)當(dāng)兩種ARMS引物擴(kuò)增CT差值（Λ CT的絕對(duì)值）彡2且< 3時(shí)，樣本判斷為 結(jié)果不可信，需重新制備樣本，使樣本濃度為10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之間，再重新用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0107] 若兩個(gè)反應(yīng)體系擴(kuò)增的擴(kuò)增的CT值中至少一個(gè)小于20或大于30,樣本判斷為結(jié) 果不可信，需重新制備樣本，使樣本濃度為10~50ng/y 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之間，再重新用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0108] 三、應(yīng)用示例。
[0109] 1、應(yīng)用例。
[0110] A.檢測(cè)樣本的MTHFR基因的C. 1298位點(diǎn)。
[0111] 1)采用實(shí)施例1的試劑盒中反應(yīng)液A和B檢測(cè)樣本1的MTHFR基因的c. 1298位 點(diǎn)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖1所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR A1298A(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR AA)基因型。
[0112] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR AA基因型時(shí)，A等位基因型引物擴(kuò)增CT值小于C等位基 因型引物擴(kuò)增CT值（即A等位基因型引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的CT曲線(xiàn)靠左），且C等位基因型引 物擴(kuò)增CT值與A等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差彡3。MTHFR AA基因型樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)， 從左往右依次是A等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)、C等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0113] 2)采用實(shí)施例1的試劑盒中的反應(yīng)液A和B檢測(cè)樣本2的MTHFR基因的c. 1298 位點(diǎn)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖2所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR C1298C(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR CC)基因型。
[0114] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR CC基因型時(shí)，C等位基因型引物擴(kuò)增CT值小于A等位基 因型的引物擴(kuò)增CT值（即C等位基因型引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的CT曲線(xiàn)靠左），且A等位基因 型引物擴(kuò)增CT值與C等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型樣本的擴(kuò)增曲 線(xiàn)，從左往右依次是C等位基因型引物的擴(kuò)增曲線(xiàn)、A等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0115] 3)采用實(shí)施例1的試劑盒中的反應(yīng)液A和B檢測(cè)樣本3的MTHFR基因的c. 1298 位點(diǎn)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖3所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR A1298C(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR AC)基因型。
[0116] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR AC雜合型時(shí)，A等位基因型引物和C等位基因型引物擴(kuò)增 的CT值接近，且A等位基因型引物擴(kuò)增CT值與C等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差的絕對(duì)值 <2。雜合基因型樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)，兩條擴(kuò)增曲線(xiàn)分別對(duì)應(yīng)為A等位基因型引物和C等位基 因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0117] B.檢測(cè)樣本的MTHFR基因的c. 677位點(diǎn)。
[0118] 1)采用實(shí)施例1的試劑盒中反應(yīng)液C和D檢測(cè)樣本4的MTHFR基因的c. 677位點(diǎn) 時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖4所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR C677C(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR CC)基因型。
[0119] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR CC基因型時(shí)，C等位基因型引物擴(kuò)增CT值小于T等位基 因型引物擴(kuò)增CT值（即C等位基因型引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的CT曲線(xiàn)靠左），且T等位基因型引 物擴(kuò)增CT值與C等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)， 從左往右依次是C等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)、T等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0120] 2)采用實(shí)施例1的試劑盒中的反應(yīng)液C和D檢測(cè)樣本5的MTHFR基因的c. 677位 點(diǎn)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖5所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR T677T(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR TT)基因型。
[0121] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR TT基因型時(shí)，T等位基因型引物擴(kuò)增CT值小于C等位基 因型的引物擴(kuò)增CT值（即T等位基因型引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的CT曲線(xiàn)靠左），且C等位基因 型引物擴(kuò)增CT值與T等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差彡3。MTHFR TT基因型樣本的擴(kuò)增曲 線(xiàn)，從左往右依次是T等位基因型引物的擴(kuò)增曲線(xiàn)、C等位基因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0122] 3)采用實(shí)施例1的試劑盒中的反應(yīng)液C和D檢測(cè)樣本6的MTHFR基因的c. 677位 點(diǎn)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖6所示，檢測(cè)結(jié)果為MTHFR C677T(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTHFR CT)基因型。
[0123] 當(dāng)檢測(cè)的樣本為MTHFR CT雜合型時(shí)，C等位基因型引物和T等位基因型引物擴(kuò)增 的CT值接近，且C等位基因型引物擴(kuò)增CT值與T等位基因型引物擴(kuò)增CT值之差的絕對(duì)值 <2。雜合基因型樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)，兩條擴(kuò)增曲線(xiàn)分別對(duì)應(yīng)為C等位基因型引物和T等位基 因型引物擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0124] 2、PCR結(jié)果驗(yàn)證
[0125] 采用測(cè)序方法檢測(cè)各樣本的MTHFR基因的突變位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果與采用本試劑盒的 檢測(cè)結(jié)果完全一致。