Mthfr基因多態(tài)性檢測引物體系及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測引物和檢測體系， 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸 代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，可以使5, 10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，從而作為甲 基的間接供體參與體內(nèi)嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白質(zhì)的甲基化，同時維持體內(nèi)正常 的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因多態(tài)性可導(dǎo)致葉酸代謝關(guān)鍵酶活性降低，引起葉酸代謝障 礙，從而導(dǎo)致多種遺傳性疾病的發(fā)生，其中以高同型半胱氨酸血癥引起的腦卒中以及新生 兒缺陷如唐氏綜合癥（Down syndrome，DS)等最為嚴(yán)重。MTHFR基因檢測是葉酸利用能力 評估的關(guān)鍵項目，其檢測結(jié)果為個體化（差異化）增補葉酸、預(yù)防新生兒出生缺陷提供科學(xué) 依據(jù)。
[0003] 目前進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性檢測的方法主要有芯片技術(shù)、探針引物技術(shù)、酶切、焦 磷酸測序技術(shù)和HRM分析技術(shù)等，價格貴、繁瑣或準(zhǔn)確性不高。因此，開發(fā)一種檢測MTHFR 基因多態(tài)性的產(chǎn)品，以實現(xiàn)更高靈敏度、更低成本、更方便快捷的MTHFR基因多態(tài)性檢測是 非常有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了一種檢測快速方便，靈敏度高，準(zhǔn)確率高的MTHFR基因多態(tài)性檢測 試劑盒，以及其檢測引物和檢測體系。
[0005] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種MTHFR基因多態(tài)性檢測 引物，包括針對MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的正向引物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點 為A情況的反向引物、針對MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的正向引物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的反向引物、針對MTHFR基因 c. 677位點為C情況的正向引物、對應(yīng) MTHFR基因 c. 677位點為C情況的反向引物、針對MTHFR基因 c. 677位點為T情況的正向引 物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為T情況的反向引物、檢測β -actin基因的正向引物和檢 測β-actin基因的反向引物；所述針對MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的反向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述針對MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述針對MTHFR基因 c. 677位點為C情況的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述對應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為C情況的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述針對MTHFR基因 c. 677位點為T情況的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述對應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為T情況的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述檢測β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述檢測β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0006] 各引物應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系中的終濃度為0. 4 μ M。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的又一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測引物的 MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種MTHFR基因多態(tài)性檢測 體系包括用于檢測MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的PCR反應(yīng)體系Α，用于檢測MTHFR基 因 c. 1298位點為C情況的PCR反應(yīng)體系Β，用于檢測MTHFR基因 c. 677位點為C情況的 PCR反應(yīng)體系C，用于檢測MTHFR基因 c. 677位點為T情況的PCR反應(yīng)體系D，以及用于檢 測β -actin基因作為內(nèi)對照的PCR反應(yīng)體系E ;所述PCR反應(yīng)體系A(chǔ)包括針對MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的正向引物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反應(yīng)體系B包括針對MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的 正向引物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模 板；所述PCR反應(yīng)體系C包括針對MTHFR基因 c. 677位點為C情況的正向引物、對應(yīng)MTHFR 基因 c. 677位點為C情況的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反應(yīng)體系 D包括針對MTHFR基因 c. 677位點為T情況的正向引物、對應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為T 情況的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反應(yīng)體系E包括檢測β -actin 基因的正向引物、檢測β-actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述針 對MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述對 應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為A情況的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述針 對MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述對 應(yīng)MTHFR基因 c. 1298位點為C情況的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述針 對MTHFR基因 c. 677位點為C情況的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述對 應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為C情況的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述針 對MTHFR基因 c. 677位點為T情況的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述對 應(yīng)MTHFR基因 c. 677位點為T情況的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述檢 測β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述檢測β-actin基因 的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 各PCR反應(yīng)體系的體積為10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的體積是5 μ 1，各 引物的終濃度為0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用濃度為10~50ng/ μ 1，其余為純水。
[0010] 上述SYBR Green混合液是兩倍濃度的SYBR Green混合液。
[0011] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的又一種技術(shù)方案是：一種采用上述的檢測體系 的MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒。
[0012] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測體系的 結(jié)果判定方法，具體步驟如下：
[0013] 第一步，采用PCR反應(yīng)體系E檢測樣本的β-actin基因，
[0014] 若樣本擴增CT值小于23或大于25,判斷為樣品無效，重新制備樣本進(jìn)行檢測；
[0015] 若樣本擴增CT值范圍在23~25范圍內(nèi)，判斷為樣品有效，進(jìn)行下一步判斷；
[0016] 第二步，PCR反應(yīng)體系A(chǔ)和B分別檢測該樣本的c. 1298位點情況，
[0017] 若兩個反應(yīng)體系擴增的CT值都在20~30范圍內(nèi)，當(dāng)兩者CT差值的絕對值< 2 時，樣本判斷為雜合基因型；當(dāng)兩者CT差值的絕對值多3時，樣本判斷為CT值小的一方所 對應(yīng)的等位基因純合型；當(dāng)兩者CT差值的絕對值多2且< 3時，樣本判斷為結(jié)果不可信，重 新制備樣本進(jìn)行檢測；
[0018] 若兩個反應(yīng)體系擴增的CT值中至少一個小于20或大于30,樣本判斷為結(jié)果不可 信，重新制備樣本進(jìn)行檢測；
[0019] 第三步，PCR反應(yīng)體系C和D分別檢測該樣本的c. 677位點情況，
[0020] 若兩個反應(yīng)體系擴增的CT值都在20~30范圍內(nèi)，當(dāng)兩者CT差值的絕對值< 2 時，