過門靜脈動脈化方式和端-端吻合技巧將人工肝臟的門靜脈與受體腎動脈連接，將人工肝臟的下腔靜脈與受體腎靜脈連接，連接成功通血后(圖6中A(a-e))體內(nèi)維持4周后檢測受體肝功能。結(jié)果顯示人工肝臟治療組的肝纖維化程度(圖6中B(5))明顯輕于單純NG2+HSC靜脈注射治療組(圖6中B(4))(圖6中B(4)-(6))，同時血清肝功檢測也顯示了類似結(jié)果(圖6中C)，證明了利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的人工肝臟對硬化肝臟具有功能恢復(fù)作用。
[0074]將WDLS-NG2+HSC體外3-D培養(yǎng)3天的培養(yǎng)物以端-側(cè)吻合原位輔助肝移植方式植入30-40%肝切除急性肝衰小鼠模型，2周后發(fā)現(xiàn)植入體形成了類肝葉樣組織(圖7中B箭頭所示)，其中一葉有較均勻的血運分布，存活較佳(圖7中B圓圈中所示)，表明本發(fā)明方法無論在體外“培養(yǎng)微環(huán)境”還是體內(nèi)損傷微環(huán)境均能誘導(dǎo)NG2+HSC生成(重建)人工肝臟，故具有作為臨床肝移植供體使用的潛力。
[0075]最后說明兩點:(I)我們研制的三種條件培養(yǎng)基(CM1、CM2、CM3)的制備是根據(jù)哺乳類動物肝臟發(fā)育成熟的理論基礎(chǔ)(見圖8)，花費了大量時間進行科學(xué)研宄證明而獲得的，相關(guān)文章即將發(fā)表；⑵以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1.肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟中的應(yīng)用。2.肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，包括如下步驟:將NG2+HSC注入全肝去細胞生物支架中，然后加入能使NG2+HSC重建為人工肝臟的條件培養(yǎng)基，模擬肝組織器官發(fā)育的微環(huán)境體外3-D培養(yǎng)，誘導(dǎo)NG2+HSC生成人工肝臟。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述全肝去細胞生物支架的制備方法如下: (1)取離體全肝供體，然后從腹主動脈灌注生理鹽水洗出紅細胞； (2)從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水去除細胞成分； (3)從門靜脈和肝動脈同時灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液繼續(xù)去除細胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA 混合液中含 SDS，胰酶和 EDTA ； (4)從門靜脈和肝動脈灌注無菌雙蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液； (5)從門靜脈和肝動脈灌注無菌1XPBS，恢復(fù)生理狀態(tài)，制得全肝去細胞生物支架。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述全肝去細胞生物支架的制備方法如下: (1)取離體全肝供體，然后以速度為5mL/min體內(nèi)腹主動脈灌注生理鹽水0.5小時； (2)以5mL/min速度從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水2小時； (3)以5mL/min速度從門靜脈和肝動脈同時灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小時，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的胰酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.002% 的 EDTA ; (4)以5mL/min速度從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水6小時； (5)以5mL/min速度從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌IXPBS1.5小時，制得全肝去細胞生物支架。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于:所述條件培養(yǎng)基包括CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基和CM3培養(yǎng)基； 所述CMl培養(yǎng)基為含有內(nèi)皮細胞生長因子、細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4; 所述CM2培養(yǎng)基為含有肝細胞生長因子、堿性成纖維生長因子、牛胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、左旋甲狀腺素、亞砸酸鈉、腐胺、孕激素、細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4; 所述CM3培養(yǎng)基為含有肝細胞生長因子、堿性成纖維生長因子、抑瘤素M、地塞米松、細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4 ; 所述DMEM完全培養(yǎng)液包括如下組分:100U/mL青霉素-G，100 μ g/mL鏈霉素，5mM L-谷氨酰胺，I X非必須氨基酸，I X丙酮酸鈉和25mM HEPESo6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于: 所述CMl培養(yǎng)基中，內(nèi)皮細胞生長因子的濃度為20ng/mL ； 所述CM2培養(yǎng)基中，肝細胞生長因子的濃度為10ng/mL，堿性成纖維生長因子的濃度為5ng/mL，牛胰島素的濃度為0.5mg/mL，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為0.5mg/mL，左旋甲狀腺素的濃度為40 μ g/mL,亞砸酸鈉的濃度為34 μ g/mL,腐胺的濃度為0.5 μ g/mL,孕激素的濃度為6 μg/mL ； 所述CM3培養(yǎng)基中，肝細胞生長因子的濃度為100ng/ml，堿性成纖維生長因子的濃度為50ng/mL、抑瘤素M的濃度為20ng/mL、地塞米松的濃度為0.1 μΜ。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液由以下方法制備:取哺乳動物胚胎肝臟發(fā)育期肝樣組織，勻漿，過濾，收集濾液，然后將濾液反復(fù)凍融至少3次，每次至少30min，最后固液分離，收集液體，得細胞破碎并去除細胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述肝組織器官發(fā)育的微環(huán)境為:在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% (302條件下分階段動態(tài)培養(yǎng)，第一階段I?7天，使用CMl培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二階段8?14天，使用CM2培養(yǎng)基培養(yǎng)，第三階段15?21天，使用CM3培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天換培養(yǎng)基一次；培養(yǎng)過程中白天水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為20?40rpm/min，晚上采用縱向旋轉(zhuǎn)和水平旋轉(zhuǎn)相結(jié)合的3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速小于20rpm/min。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于:所述水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)為每天8:00am?22: OOpm ；所述3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)為每天22: OOpmm?8:00am。10.根據(jù)權(quán)利要求2所述肝源性表達神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細胞群NG2+HSC作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于:所述NG2+HSC注入全肝去細胞生物支架的方法為分別從門靜脈和下腔靜脈將NG2+HSC緩慢注入全肝去細胞生物支架中，在電腦系統(tǒng)監(jiān)控下分兩步法進行，每次至少3?5X 105，間隔時間為30min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了肝源性表達NG2的干細胞群(NG2+HSC)作為種子細胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟中的應(yīng)用及方法，具體是將NG2+HSC注入全肝去細胞天然生物支架中，然后加入能使NG2+HSC重建為人工肝臟的培養(yǎng)基，模擬體內(nèi)肝組織器官發(fā)育生成的微環(huán)境體外三維(3-D)培養(yǎng)重建肝臟器官，本發(fā)明的培養(yǎng)方法簡單，成本低，培養(yǎng)時間短，21天即能形成完成的肝臟器官樣輪廓，并且培養(yǎng)獲得的人工肝臟器官具有正常肝組織類似的肝小葉結(jié)構(gòu)，同時肝臟功能性蛋白也隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，并且對硬化肝臟和急性肝衰竭具有修復(fù)和功能恢復(fù)作用，能作為肝移植供體使用，對臨床治療終末期肝病具有重要意義。
【IPC分類】A61L27/38, C12N5/0797
【公開號】CN104894066
【申請?zhí)枴緾N201510349918
【發(fā)明人】白蓮花, 帥領(lǐng), 賴潔娟, 張玉君, 賴向東, 張宏宇, 別平
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月23日