紅細(xì)胞，灌注時間約0.5小時；
[0051](2)將肝臟以5mL/min速度門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水(ddH20)，以開始溶解細(xì)胞成分，并去除細(xì)胞成分，時間約2小時；
[0052](3)以速度為5mL/min門靜脈和肝動脈同時灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液，灌注時間約48小時，以更大強(qiáng)度去除所有細(xì)胞成分，其中SDS-Trypsin-EDTA混合液為用ddH20配制的含質(zhì)量成分為1% SDS, 0.005%胰酶和0.002% EDTA ；
[0053](4)以5mL/min速度，用ddH20同時灌注門靜脈和肝動脈6小時洗出SDS-Trypsin-EDTA 混合液；
[0054](5)采用無菌1XPBS，以5mL/min速度同時門靜脈和肝動脈灌注1.5小時，使WDLS保持在生理狀態(tài)，制得WDLS。本實(shí)施例的方法是根據(jù)學(xué)術(shù)界現(xiàn)有制備去細(xì)胞支架基礎(chǔ)上改進(jìn)得到，改進(jìn)方法獲得的WDLS具備完整肝臟宏觀及微觀管道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)成分(圖1)。
[0055]實(shí)施例2、分離培養(yǎng)種子細(xì)胞(NG2+HSC)
[0056]目前并無能夠重建具有結(jié)構(gòu)與功能肝臟器官的理想的種子細(xì)胞。盡管學(xué)術(shù)界采用成體肝細(xì)胞和最看好的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSC)，但是肝細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)已被證明存活不佳和MSC缺乏大量分化為功能性肝細(xì)胞潛能，使這些細(xì)胞應(yīng)用均受到限制。本發(fā)明選擇NG2+HSC作為種子細(xì)胞，分離方法見公開號為102899291A的中國專利。經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)將NG2+HSC在條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，不僅可快速(大約Ih)分化為大量的功能性肝細(xì)胞(圖3)，還可分化為內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)和肝臟支持細(xì)胞例如星型細(xì)胞。結(jié)果證明了NG2+HSC具有較強(qiáng)的多向分化潛能，為體外3-D培養(yǎng)重建功能性人工肝臟奠定了理論基礎(chǔ)。
[0057]實(shí)施例3、條件培養(yǎng)基(培養(yǎng)微環(huán)境)誘導(dǎo)NG2+HSC生成具有器官結(jié)構(gòu)和功能性的人工肝臟
[0058]本實(shí)施例使用的試劑盒材料如下:24孔培養(yǎng)板(Therom，cat.n0.142475)，搖床(40 ?240rmp/min)，37°C、5% (:02培養(yǎng)箱，條件培養(yǎng)基(CMl, CM2, CM3)，100U/mL 青霉素，100 μ g/mL 鏈霉素(Cellgro，cat.n0.30-001-CI)，5000U/mL 青霉素，5000 μ g/mL 鏈霉素，DMEM/F12 (Gibco-BRL，cat.n0.11330)，ECGS (Endothelial cell growth supplements)(Pepnotech, cat.n0.100-20C)，HGF(R&D, cat.n0.294-HG-005/CF)，bFGF (Pepnotech, cat.n0.100-188)，牛膜島素(Sigma, cat.n0.16634)，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, cat.n0.T1147)，左旋甲狀腺素(Sigma，cat.n0.T6397)，亞砸酸鈉(Sigma，cat.n0.S9133)，腐胺(Sigma，cat.n0.P5780)，孕激素(Sigma, cat.n0.7556), Oncostatin M，地塞米松，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺。
[0059]建立“培養(yǎng)微環(huán)境”，即制備三種條件培養(yǎng)基(Condit1ned mediums, CMs)，分別為CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基，CM3培養(yǎng)基，具體步驟如下:
[0060]I)去除胚胎期小鼠肝臟中的干細(xì)胞和祖先細(xì)胞:
[0061]a.解剖顯微鏡下分別取出7到15天胚胎期小鼠(E7-E15)肝樣組織，每期五只胚胎小鼠，混勻后用勻漿器實(shí)施緩慢研磨，過濾，收集濾液；
[0062]b.將濾液在-80°C和39°C條件下反復(fù)凍融3次，每次各30mim，然后用0.45 μ m濾膜過濾，收集濾液；
[0063]c.用免疫熒光方法檢測過濾液中0X43和0X44陽性造血干細(xì)胞、Thy-1陽性肝臟胚胎干細(xì)胞，若檢測結(jié)果呈陰性，表明胚胎期小鼠肝臟中的干細(xì)胞和祖先細(xì)胞已去除；
[0064]2)采用蛋白試劑盒檢測蛋白含量，控制總蛋白含量在50?-100mg/mL范圍內(nèi)；
[0065]3)配制CMl，CM2和CM3培養(yǎng)基
[0066]CMl培養(yǎng)基:向細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液體積比為1:4的混合溶液中加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子終濃度為20ng/mL ；
[0067]CM2培養(yǎng)基:向細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液體積比為1:4混合溶液中加入HGF、bFGF,牛胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、左旋甲狀腺素、亞砸酸鈉、腐胺、孕激素至HGF終濃度為10ng/mL，bFGF終濃度為5ng/mL，牛胰島素終濃度為0.5mg/mL，人轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度為0.5mg/mL，左旋甲狀腺素終濃度為40 μ g/mL,亞砸酸鈉終濃度為34 μ g/mL,腐胺終濃度為0.5 μ g/mL,孕激素終濃度為6 μ g/mL ；
[0068]CM3培養(yǎng)基:向細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液體積比為1:4的混合溶液中加入HGF、bFGF，抑瘤素(0ncoStatin)M、地塞米松、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺至HGF終濃度為100ng/mL，bFGF終濃度為50ng/mL，Oncostatin M終濃度為20ng/mL，地塞米松終濃度為0.1 μ M，非必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %和L-谷氨酰胺終濃度為5mM。
[0069]然后利用配制的CMl，CM2和CM3培養(yǎng)基體外3-D培養(yǎng)具有器官結(jié)構(gòu)和功能性的人工肝臟，具體方法如下:
[0070]首先在計算機(jī)系統(tǒng)監(jiān)控下，利用三步法分別從門靜脈和下腔靜脈將NG2+HSC分2-3次緩慢注入WDLS中，每次至少3?5 X 15,間隔15-30min ;然后將注入NG2+HSC的WDLS (以下稱為WDLS-NG2+HSC)放入24孔培養(yǎng)板中(圖4)，加入500 μ I CMl培養(yǎng)基，放入3-D培養(yǎng)裝置內(nèi)在37 °C、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周(第I?7天)，每天8: OOam?22: OOpm以40_42rpm/min在水平方向低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)16個小時，22: OOpm?8: OOam采用縱向旋轉(zhuǎn)和水平旋轉(zhuǎn)相結(jié)合的3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)8小時，轉(zhuǎn)速小于20rpm/min，每兩天補(bǔ)加200 μ L CMl培養(yǎng)基；培養(yǎng)進(jìn)入第二周后(第8天)，改換500 μ LCM2培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式于條件與第一周相同(第8_14天)；培養(yǎng)進(jìn)入第三周后(第15天)，改換500 μ L CM3培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式與條件與第一周相同，劑量與方式與第一周相同，持續(xù)7天(8-14天)；培養(yǎng)進(jìn)入第三周后(第15天)，改換500 ULCM3培養(yǎng)基，劑量與方式與第一周相同(第15?21天)，培養(yǎng)21天后終止培養(yǎng)，獲得具有器官結(jié)構(gòu)和功能性的人工肝臟，然后于白光和熒光顯微鏡下觀察組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并分析上清肝臟功能蛋白。結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第9天形成了肝葉樣輪廓(圖5中Α)，培養(yǎng)至第21天形成了全肝樣輪廓(圖5中B)，對21天的培養(yǎng)物進(jìn)行Η&Ε染色和培養(yǎng)物上清功能蛋白分析，顯示培養(yǎng)物具有與正常肝組織(圖5中C(a))類似結(jié)構(gòu)(圖5中C(b))如有肝小葉中央靜脈(the central vein, CV)形成(箭頭所示)，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物上清功能蛋白(Alb表示肝臟白蛋白)分泌增加(圖5中C(c))，表明NG2+HSC在特定培養(yǎng)微環(huán)境中可形成具有器官結(jié)構(gòu)和功能的人工肝臟，表現(xiàn)了很有臨床應(yīng)用潛力的種子細(xì)胞。
[0071]實(shí)施例4、人工肝臟體內(nèi)肝損傷修復(fù)、替代的可行性
[0072]本實(shí)施例主要采用兩種手術(shù)，即原位(圖7中A)和異位輔助肝移植(圖6中A)。本實(shí)施例使用的主要材料和試劑如下:I %戊巴比妥納(0.05g/kg腹腔注射)，安爾碘消毒液，注射器(lml, 5ml, 20ml)，0.9%生理鹽水，PE管(外徑:0.3mm,內(nèi)徑:0.2mm)，代針絲線(11/0，9/0，5/0)，核酸液(nuclear dye)，楽染液(pulp dye)，分色液(color liquid)，復(fù)染液(complex dye)，洗液(flushing liquid)。
[0073]將無菌麻醉小鼠，切除腎臟，然后將體外3-D培養(yǎng)獲得的人工肝臟植入DEN-誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型的切除腎臟區(qū)域，通