乳動(dòng)物胚胎期肝樣組織，反復(fù)凍融的溫度優(yōu)選為在_80°C和39°C條件下反復(fù)凍融3次；固液分離優(yōu)選為用0.45 μπι濾膜過濾。
[0031]進(jìn)一步，本發(fā)明中利用使成體肝臟NG2+HSC體外3_D培養(yǎng)重建人工肝臟的培養(yǎng)基和體外模擬體內(nèi)肝組織器官發(fā)育微環(huán)境，使成體肝臟NG2+HSC進(jìn)行營養(yǎng)和氣體交換，符合哺乳類動(dòng)物發(fā)育的自然規(guī)律，并通過不同方向輕微運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)，模擬胎兒(培養(yǎng)物)隨著母體(胎盤)的運(yùn)動(dòng)(自動(dòng)搖動(dòng)裝置)而運(yùn)動(dòng)，同時(shí)直接吸收周圍的營養(yǎng)(CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基和CM3培養(yǎng)基)(母體胎盤中的羊水)，為了能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)，工業(yè)化培養(yǎng)，將肝組織生成環(huán)境控制如下:將注入成體肝臟NG2+HSC的肝去細(xì)胞生物支架于CMl培養(yǎng)基中，在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% 0)2條件下分階段動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，第一階段I?7天，使用CMl培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二階段8?14天，使用CM2培養(yǎng)基培養(yǎng)，第三階段15?21天，使用CM3培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天換培養(yǎng)基一次；培養(yǎng)過程中白天水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為20?40rpm/min，晚上采用縱向旋轉(zhuǎn)和水平旋轉(zhuǎn)相結(jié)合的3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速小于20rpm/min。
[0032]為了使培養(yǎng)物近似人類的生物鐘，優(yōu)選的所述水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)為每天8:00am?22: OOpm,速率40?42rpm/min ;所述3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)為每天22: OOpmm?8: OOam,速率小于20rpm/mino
[0033]進(jìn)一步，所述NG2+HSC注入WDLS的方法為分別從門靜脈和下腔靜脈將NG2+HSC緩慢注入WDLS中，在電腦系統(tǒng)監(jiān)控下分兩步法進(jìn)行，每次至少3?5X 105，間隔時(shí)間為30min。
[0034]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了能夠生成功能性全肝的種子細(xì)胞(NG2+HSC)，通過模擬肝組織器官發(fā)育成熟微環(huán)境條件，通過體外3-D培養(yǎng)，誘導(dǎo)NG2+HSC生成人工肝臟，該方法符合哺乳類動(dòng)物發(fā)育的自然規(guī)律，即胎兒(培養(yǎng)物)隨著母體的運(yùn)動(dòng)(自動(dòng)搖動(dòng)裝置)而運(yùn)動(dòng)，同時(shí)直接吸收周圍的營養(yǎng)(CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基和CM3培養(yǎng)基)(母體胎盤中的羊水)，具有成本較低、經(jīng)濟(jì)適用、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、大眾化等優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中采用的生物反應(yīng)器(B1reactor，BR)的價(jià)格昂貴，體積龐大，系統(tǒng)復(fù)雜，容易污染等弊端。利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)形成的肝臟樣組織僅需3周時(shí)間，比近期報(bào)道采用BR方法體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(Meschymal stem cells, MSC)在去細(xì)胞肝臟生物支架形成的肝樣組織(需要4周時(shí)間)節(jié)省I周時(shí)間。另外，本發(fā)明方法在WDLS中的NG2+HSC在第9天時(shí)就顯示了完整的肝葉樣輪廓，21天時(shí)形成了完整的肝臟器官樣輪廓，且組織切片(H&E)染色顯示具有肝臟器官樣組織，例如具有與正常肝組織類似的肝小葉結(jié)構(gòu)。除此之外，體外3-D培養(yǎng)形成的類肝樣組織其功能性肝臟蛋白(白蛋白)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加。將體外3-D培養(yǎng)21天的人工肝類肝樣器官采用異位輔助肝移植方法植入肝硬化小鼠體內(nèi)后，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)肝硬化小鼠具有明顯的修復(fù)作用，表明本發(fā)明制得的人工肝臟具有肝臟的結(jié)構(gòu)和功能，能夠作為肝移植供體使用，對(duì)臨床治療終末期肝病具有重要臨床價(jià)值。
【附圖說明】
[0035]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0036]圖1為成年小鼠全肝去細(xì)胞支架去細(xì)胞過程中各階段照片(白光下)。(a為體內(nèi)腹主動(dòng)脈灌注0.9%生理鹽水后離體；b為灌注去離子水2h、緊接SDS-Trypsin-EDTA混合液24h ；c為灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48h，d為灌注去離子水6h、緊接PBS灌注1.5h最終獲取的全肝去細(xì)胞支架(WDLS) ;e為放大d顯示的清晰去細(xì)胞后的管道網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。
[0037]圖2為NG2+HSC在CMl條件培養(yǎng)基中分化為內(nèi)皮細(xì)胞和管腔樣結(jié)構(gòu)，采用抗小鼠血管性血友病因子(von Willebrand factory, vfff)單克隆抗體的免疫熒光方法，在CMl培養(yǎng)基中2-D培養(yǎng)24小時(shí)分化為內(nèi)皮細(xì)胞(細(xì)箭頭表示)和管腔樣結(jié)構(gòu)(寬箭頭表示)。
[0038]圖3為NG2+HSC在條件培養(yǎng)基中分化為成熟肝細(xì)胞的動(dòng)態(tài)照片。NG2+HSC在條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，I小時(shí)內(nèi)即可分化為超過87%的功能性肝細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)((I)?(3) 二維培養(yǎng)在 CMl 中，從 0min、5min、1min ; (4)?(6) 二維培養(yǎng)在 CM2 中，從 20min、30min、40min ;(J)?⑶二維培養(yǎng)在CM3中，從50min到60min下照片(白光下)；(9)最后階段培養(yǎng)的免疫熒光雙染色。
[0039]圖4為WDLS-NG2+HSC在三種條件培養(yǎng)基(CM1, CM2, CM3)中不同時(shí)間體外培養(yǎng)狀況(箭頭所示)。
[0040]圖5為WDLS-NG2+HSC培養(yǎng)物在條件培養(yǎng)基微環(huán)境下生成人工肝臟和肝臟功能蛋白分析結(jié)果(A為第O天到第9天的培養(yǎng)狀況，尤其第9天時(shí)形成了肝葉樣輪廓(白光+熒光)，B為第O天和第21天時(shí)形成了全肝樣輪廓，C為組織切片對(duì)21天的培養(yǎng)物進(jìn)行H&E染色和培養(yǎng)物上清功能蛋白Western blot分析，C中b表示培養(yǎng)物具有與正常組織類似結(jié)構(gòu)，C中a表示肝小葉形成(以箭頭表示)，C中c表示培養(yǎng)物上清功能蛋白Western blot分析，顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)物上清功能蛋白(Alb表示白蛋白)分泌增加)。
[0041]圖6為異位輔助肝移植手術(shù)將體外生成的人工肝臟植入二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型后對(duì)硬化肝臟的修復(fù)和功能恢復(fù)作用。A異位輔助肝移植手術(shù)過程:a為暴露腎臟(圈內(nèi)所示)，b為摘除腎臟后(圈內(nèi)所示)，c為端-端吻合將WDLS-NG2+HSC與腎臟動(dòng)-靜脈相接，WDLS門靜脈接受體腎動(dòng)脈(寬箭頭表示)，WDLS下腔靜脈接腎靜脈(細(xì)箭頭表示)，d為受體血流進(jìn)WDLS瞬間(圈內(nèi)所示)，e為充血后5min(圈內(nèi)所示);B體內(nèi)運(yùn)作4周后通過Masson染色檢測(cè)肝纖維化(陽性為藍(lán)色):(1)為新鮮肝組織組，⑵為DEN+PBS組，(3)為DEN+單獨(dú)WDLS組，(4)為DEN+單獨(dú)NG2+HSC治療組，(5)為DEN+WDLS-NG2+HSC治療組，(6)為對(duì)各組進(jìn)行定量分析結(jié)果；C通過ELASA檢測(cè)肝功能:a為尿素酶含量，b為Cyp450含量。
[0042]圖7為原位輔助肝移植手術(shù)。A:將WDLS-NG2+HSC體外3-D培養(yǎng)21天的人工肝臟植入70%肝切除(左葉、中葉切除)的急性肝衰小鼠模型，受體血流進(jìn)入人工肝臟瞬間情況(端-側(cè)吻合):WDLS-NG2+HSC體外3-D培養(yǎng)3天的培養(yǎng)物植入30-40%肝切除(左葉切除)的急性肝損傷小鼠模型體內(nèi)(端-側(cè)吻合)，2周后可見有血運(yùn)的類肝葉樣結(jié)構(gòu)(圓圈中所示)。
[0043]圖8為哺乳類動(dòng)物肝臟發(fā)育成熟示意圖；A為小鼠；B為人類。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0045]本發(fā)明的構(gòu)思是在采用天然WDLS的基礎(chǔ)上，以公開號(hào)為102899291A的中國專利從成年小鼠肝臟分離純化表達(dá)神經(jīng)-膠質(zhì)抗原2的成體肝源性干細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱NG2+HSC)作為種子細(xì)胞，通過模擬肝組織器官發(fā)育生成的微環(huán)境自制的三種條件培養(yǎng)基(分別為CMl, CM2, CM3，以下稱為“培養(yǎng)微環(huán)境”)，在體外3-D培養(yǎng)，誘導(dǎo)NG2+HSC生成(重建)具有結(jié)構(gòu)與功能人工肝臟器官，再通過原位和異位輔助肝移植將體外3-D培養(yǎng)生成的類肝臟樣組織或器官植入ESLD動(dòng)物模型，驗(yàn)證替換ESLD肝臟的可能性。
[0046]實(shí)施例1、成年小鼠天然全肝去細(xì)胞生物支架(WDLS)的獲得
[0047]本實(shí)施例使用的主要材料和試劑如下:
[0048]灌注泵，超凈臺(tái)，輸液針，0.9%生理鹽水，I %十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.005%胰酶，0.002% EDTA 混合液(0.25%胰酶:0.02% EDTA = 1: LHyclone, cat.n0.J110831)，去離子無菌雙蒸水(ddH20)，IXPBS磷酸鹽緩沖液(0.0lM PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)公司，cat.n0.ZL1-9062)。
[0049]采用體外灌注獲得WDLS，具體步驟如下:
[0050](I)取小鼠離體肝臟，然后以5mL/min速度門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注0.9%生理鹽水600mL以洗出