[0037]
[0038] 表6.添加了L-天冬氨酸的培養(yǎng)中的菌株和3HP滴度
[0040] 表7.以葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)中的菌株和3HP滴度
[0042] 表8.具有用于3HP生物合成的染色體整合基因的酵母菌株
[0043]
[0044] 在下述實施例中獲得的結(jié)果部分顯示在附圖中，其中：
[0045] 圖1顯示從丙酮酸經(jīng)天冬氨酸、0_丙氨酸和丙二酸半醛至3-HP的代謝通路。
[0046] 圖2顯示實施例2中獲得的NMR結(jié)果。
[0047] 圖3顯示整合多拷貝的基因和過表達前體供應基因?qū)?HP滴度的影響。通過HPLC 法測定培養(yǎng)液中3HP的濃度并以g I71表示。丨-單拷貝的基因整合至基因組，丨丨-多拷 貝的基因整合至基因組（實施例6)。
[0048] 圖4顯示pH5時葡萄糖限制補料分批培養(yǎng)中SCE-R2-200的生長和代謝物濃度。三 個培養(yǎng)之一的代表圖（實施例7)。
[0049] 如圖1中所闡釋，利用酶PanD即天冬氨酸1-脫羧酶，天冬氨酸可被轉(zhuǎn)化成丙 氨酸。丙氨酸可利用BAPAT或GabT轉(zhuǎn)化成丙二酸半醛，并且丙二酸半醛可利用HIBADH/ HPDH轉(zhuǎn)化成3-HP。本發(fā)明使用經(jīng)BAPAT的路徑。
[0050] 實施例1.克隆異源0 -丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、3-羥基異丁酸脫氫酶和3-羥基 丙酸脫氫酶并在釀酒酵母中過表達異源和天然y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶
[0051] 以針對酵母釀酒酵母進行了密碼子優(yōu)化的版本（對應SEQ ID N02, SEQ ID N04， SEQ ID N06, SEQ ID N08, SEQ ID N010, SEQ ID N012, SEQ ID N014, SEQ ID N016, SEQ ID N018)由GeneArt(Life Technologies)合成編碼下述酶的基因：推定的賭狀芽孢桿菌轉(zhuǎn) 氨酶yhxA(SEQ ID N01)、惡臭假單胞菌丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（SEQ ID N03)、銅綠假 單胞菌3-羥基丁酸脫氫酶（SEQ ID N05)、白色念珠菌3-羥基丁酸脫氫酶（SEQ ID N07)、 惡臭假單胞菌3-羥基丁酸脫氫酶（SEQ ID N09)、蠟狀芽孢桿菌3-羥基丁酸脫氫酶（SEQ ID N011)、勤奮生金球菌3-羥基丙酸脫氫酶（SEQ ID N013)、頭寇岱硫化葉菌（Sulfolobus tokadaii)3-羥基丙酸脫氫酶（SEQ ID N015)和丙酮丁醇梭菌y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（SEQ ID N017)〇
[0052] 有序的基因構(gòu)建體具有如下的通用結(jié)構(gòu)：GGTACCAAAACAATG NN… NNTGAGTCGAC(SEQ ID N067)，其中GGTACC是Kpnl限制酶切位點，AAAACA是Kozak序列，ATG 是起始密碼子，NN…NN表示沒有起始密碼子和終止密碼子的蛋白質(zhì)編碼序列，TGA是終止 密碼子，GTCGAC是Sail限制酶切位點。
[0053] 使用Kpnl和Sail從質(zhì)粒切下合成基因，凝膠純化并連接至用相同的酶對消化的 質(zhì)粒pEl(SEQ ID 81)或pE2(SEQ ID82)。使用熱激將所得連接混合物轉(zhuǎn)化至化學感受態(tài)大 腸桿菌DH5 a并且在含有1〇〇 y g/ml氨芐西林的Luria-Bertani (LB)瓊脂培養(yǎng)基上對細胞 進行選擇。
[0054] 通過菌落PCR鑒定具有正確插入序列的克隆，接種在含有100 y g/ml氨芐西林的 液體LB培養(yǎng)基中并且分離質(zhì)粒（表2)。通過測序確認所得質(zhì)粒。
[0055] 使用如表3中所示的引物和模板，通過PCR擴增產(chǎn)生用于USER-克隆的帶有基 因和正確突出的基因片段。PCR混合物包含：28y 1水，l〇y 1高保真度Phusion?聚合 酶緩沖液（5x)，5 y 1 2mM dNTP，1 y 1Phusion??聚合酶，2. 5 y 1濃度為10 yM的正向引 物，2. 5yl濃度為10yM的反向引物，以及l(fā)yl DNA模板。循環(huán)程序是：95°C2min，30個 循環(huán)的[95°C 10sec，50°C 20sec，68°C 2min]，68°C 5min，在 10°C 暫停。在包含SYBR?. -SAFEdnvitrogen)的1%瓊脂糖凝膠上分離基因片段并使用NucleoSpin?凝膠和PCR清 潔試劑盒（PCR Clean-up Kit)(Macherey_Nagel)純化。同樣地通過PCR產(chǎn)生啟動子片段 并隨后進行基因純化（表3)。表達質(zhì)粒上已存在終止子。
[0056] 將親本質(zhì)粒 pESC-Ura-USER(SEQ ID N0 85)、pESC-His-USER(SEQ ID N0 83)和 pESC-Leu-USER(SEQ ID NO 84)在 37°C用FastDigest?AsiSI(Fermentas)線性化 1 小時 并用Nb. BsmI在37°C處理1小時產(chǎn)生切口。從溶液中純化所得的線性化且?guī)в星锌诘腄NA 并且在5mM pH8. OTris緩沖液中洗脫。
[0057] 通過USER-克隆使用下述方案構(gòu)建表達質(zhì)粒。將1y1的線性化且?guī)в星锌诘挠H 本質(zhì)粒與1 y 1的啟動子片段、2 y 1的基因片段、0. 5 y 1 Taq聚合酶緩沖液、0. 5 y 1 USER酶 (NEB)混合。將混合物在37°C溫育25min、在25°C溫育25min并轉(zhuǎn)化至化學感受態(tài)大腸桿 菌DH5 a。通過菌落PCR鑒定具有正確插入序列的克隆，從大腸桿菌過夜培養(yǎng)物分離質(zhì)粒并 通過測序確認。表達質(zhì)粒列舉在表4中。
[0058] 使用乙酸鋰轉(zhuǎn)化方案將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細胞。在缺乏尿嘧啶、組氨酸和 亮氨酸的合成完全（SC)瓊脂培養(yǎng)基上對細胞進行選擇。所得菌株列舉在表5中。
[0059] 實施例2. 3-羥基丙酸在以0 -丙氨酸培養(yǎng)的釀酒酵母中的生產(chǎn)
[0060] 在SC ura-his-leu-瓊脂平板上劃線純化至少四個獨立的酵母轉(zhuǎn)化子。將來自獨 立的轉(zhuǎn)化子的四個單克隆接種在具有透氣蓋子的96-深孔微量滴定板中（EnzyScreen)的 0.5ml SC ura-his-leu-中。使滴定板在30°C以5cm軌道拋物線的250rpm振蕩溫育過夜。 50 y 1的過夜培養(yǎng)物用于接種96-深孔板中的0. 5ml含有10g/Lf3 -丙氨酸的最低礦物質(zhì) (Delft)培養(yǎng)基。
[0061] Delft 培養(yǎng)基的組分如下：7. 5g(NH4)2S04、14. 4g KH2P04、0. 5g MgS04 ? 7H20、22g 右 旋糖、2mL痕量金屬溶液和lmL維生素。將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6。每升痕量金屬溶液包 含：4.5g CaCl2.2H20、4.5g ZnS04.7H20、3g FeS04.7H20、lg H3B03、lg MnCl2.4H20、0.4g Na2Mo04 ? 2H20、0. 3g CoCl2 ? 6H20、0. lg CuS04 ? 5H20、0. lg KI、15g EDTA。通過將 EDTA 之外 的所有成分溶解在900mL的pH6的超純水中隨后溫和加熱并添加EDTA來制備痕量金屬溶 液。最后將痕量金屬溶液pH調(diào)節(jié)至4,將溶液體積調(diào)節(jié)至1L并高壓滅菌（12rC，20min)。 痕量金屬溶液儲存在+4°C。每升維生素溶液包含：50mg生物素、200mg對氨基苯甲酸、lg煙 酸、lg泛酸鈣、lg鹽酸吡哆醇、lg鹽酸硫胺素、25g肌醇。將生物素溶解在20mL 0. 1M NaOH 中并添加900mL水。用HC1將pH調(diào)節(jié)至6. 5并添加其他維生素。就在添加肌醇之前及之 后，將pH重新調(diào)節(jié)至6. 5。將維生素溶液的終體積調(diào)節(jié)至11并無菌過濾，然后儲存在+4°C。
[0062] 在與上述相同的條件下進行72小時發(fā)酵。
[0063] 在培養(yǎng)結(jié)束時測量0D_。將10 y 1的樣品與190 y 1的水混合并在分光光度計 (BioTek)中在600nm波長下測量吸光度。
[0064] 對培養(yǎng)發(fā)酵液進行離心沉降并使用酶試驗對上清液的3-羥基丙酸濃度進行分析 (表5)。當惡臭假單胞菌丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶或丙酮丁醇梭菌Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶 與3-羥基丁酸脫氫酶或3-羥基丙酸脫氫酶組合使用時，沒有獲得3HP的生產(chǎn)。但是，當推 定的蠟狀芽孢桿菌轉(zhuǎn)氨酶YhxA或釀酒酵母Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶與3_羥基丁酸脫氫酶或 3-羥基丙酸脫氫酶（表5:菌株133-147)組合時，觀察到由丙氨酸的3HP的生產(chǎn)。在 測試條件下，最佳的酶組合是表達蠟狀芽孢桿菌轉(zhuǎn)氨酶YhxA和大腸桿菌3-羥基丙酸脫氫 酶YdfG的菌株147,其中獲得2, 145±89mg/L 3HP。
[0065] 如下進行酶試驗。將20 y 1的標準品（Delft培養(yǎng)基中3HP的濃度從0. 03至lg/ L)和樣品添加至96孔平底透明板（Greiner)。使用多通道移液器，將180 yl的混合物 (14. 8ml 水、2ml 緩沖液（ImM Tris、25mM MgCl2，pH8. 8)、lml NADP+溶液（50mg/ml)