一種鈣調(diào)素基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鈣調(diào)素基因，其是在土生隱球酵母BSLL1-1菌株中克隆的，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，編碼如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；將該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步將該基因在釀酒酵母中成功表達(dá)，該基因使釀酒酵母的耐鋁能力增加，基因工程菌可以吸附（或者吸收）培養(yǎng)介質(zhì)中的活性鋁，該釀酒酵母基因工程菌菌株具有降低酸性土壤中活性鋁含量的應(yīng)用潛力。
【專利說(shuō)明】-種鈣調(diào)素基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及土生隱球酵母編碼鈣調(diào)素的耐鋁基因，核 昔酸序列和氣基酸序列，以及耐錯(cuò)蛋白的異源表達(dá)，涉及含有該基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)該 耐鋁基因的工程菌株，它們的制備和表達(dá)方法，以及它們?cè)谖江h(huán)境中活性鋁的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酸性土壤在世界上廣泛存在，其中可耕種面積為1. 79億hm2。我國(guó)酸性土壤的分 布遍及14個(gè)省區(qū)，約占全國(guó)耕地面積的21% (熊毅和李慶逵，1987)。氮肥的過(guò)量施用是導(dǎo) 致農(nóng)田土壤酸化的最主要原因。此外，工業(yè)化發(fā)展導(dǎo)致的酸雨、人類不良的耕作方式和陽(yáng)離 子在土壤中的淋失，使酸性土壤的面積不斷擴(kuò)大，酸化程度不斷加劇。
[0003] 鋁（aluminum，A1)在地殼中分布廣泛，約占地殼總質(zhì)量的7%。在土壤中，鋁的主 要存在形態(tài)是不溶于水的氧化物或鋁硅酸鹽，這些形態(tài)是對(duì)植物和環(huán)境沒有傷害的。但是 隨著土壤酸化程度的增加，土壤中的鋁從不溶于水的形態(tài)中溶解出來(lái)，轉(zhuǎn)化為可溶于水的 無(wú)機(jī)離子態(tài)，如Al 3+、（A10H)2+、（A10H)2+，這些形態(tài)對(duì)植物根系的毒害作用最大，又稱為活性 A1。因此，在酸性土壤上鋁毒害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素之一。通常，解決鋁毒害 的方法是大量施用石灰來(lái)提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀。但是這種方法難以徹底解決土 壤酸度和鋁毒害問(wèn)題，同時(shí)還存在著潛在的環(huán)境問(wèn)題。
[0004] 土壤微生物是土壤生態(tài)體系的重要組成部分，在植物和土壤的相互作用過(guò)程中扮 演著重要的角色。土壤微生物參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、有機(jī)物分解、礦化以及污染物 降解等多種生化反應(yīng)。特別是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金屬清除中發(fā)揮了重 要作用，也即微生物修復(fù)技術(shù)。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物(土著菌、外來(lái)菌、基因工程 菌)對(duì)污染物的代謝作用而轉(zhuǎn)化、降解污染物。微生物修復(fù)技術(shù)已成功應(yīng)用于煤氣廠址PAHs 污染修復(fù)，石油烴污染土壤修復(fù)，農(nóng)藥污染土壤修復(fù)等。此外，重金屬污染土壤的微生物修 復(fù)主要是利用土壤中天然的微生物資源，削減、凈化土壤中重金屬或降低重金屬毒性，從而 使污染物的濃度降低到可以接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，也包 括將其穩(wěn)定化以減少其向周邊環(huán)境擴(kuò)散。在重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)中微生物主要通過(guò) 以下幾種方式起作用：（1)通過(guò)微生物的吸附、代謝達(dá)到對(duì)重金屬消減、凈化作用和固定作 用；（2)通過(guò)微生物改變重金屬的化學(xué)形態(tài)，使重金屬固定或生物可利用性降低，減少重金 屬的危害；（3) 土壤微生物通過(guò)氧化還原作用改變根際重金屬形態(tài)或產(chǎn)生的有機(jī)酸可增加 金屬的溶解性，提高重金屬的有效性，以利于植物吸收；（4)通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物 抗病性、抗逆能力等方式間接影響修復(fù)效率。因?yàn)槲⑸锓N類多，代謝類型豐富，生長(zhǎng)在酸 性環(huán)境中的微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為了保護(hù)細(xì)胞免受鋁的毒害，產(chǎn)生了一系列的抗 鋁毒機(jī)制：如有機(jī)酸及其代謝產(chǎn)物對(duì)鋁的螯合作用；抗氧化脅迫作用；抗細(xì)胞程序性死亡 等。因此，篩選或者改良土壤微生物使其增加對(duì)鋁的耐受性或者提高其對(duì)土壤中鋁的清除 能力，是解決酸性土壤上鋁毒害的直接而有效的措施。
[0005] 鈣離子（Ca2+)作為動(dòng)植物及微生物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了胞內(nèi)很多生理 反應(yīng)。Ca2+作為離子信號(hào)分子，需要下游受體才能將信號(hào)傳遞下去，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞反應(yīng)和 生物進(jìn)程。鈣調(diào)素 （Calmodulin，CaM)是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的、廣泛存在的一種非常重 要的鈣離子受體蛋白。CaM自身不具有酶的活性，但其能與靶蛋白相互作用，從而對(duì)靶蛋白 的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Ca 2+濃度升高時(shí)，Ca2+會(huì)與CaM的EF-hand結(jié)構(gòu)域結(jié)合，直接 導(dǎo)致鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域被釋放出來(lái)，結(jié)合了四個(gè)Ca 2+ 的CaM再通過(guò)CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與CaM結(jié)合蛋白相結(jié)合，從而將信號(hào)傳導(dǎo)下去。很多研究表 明，鈣離子/鈣調(diào)素信號(hào)途徑參與包括干旱脅迫、鹽脅迫、冷和熱刺激在內(nèi)的很多非生物脅 迫應(yīng)答。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中敲除突變株對(duì)熱的耐受性明顯降低，而過(guò)表達(dá) 使植株耐熱性增加 （Zhang etal·，Plant Physiol, 2009，149 (4): 1773-1784·)。這些結(jié) 果表明，鈣調(diào)素信號(hào)途徑可能是生物體耐受逆境脅迫的一種普遍機(jī)制，過(guò)表達(dá)該途徑上的 基因會(huì)提高對(duì)逆境脅迫的耐受能力。因此，克隆這些基因?qū)ρ芯克鼈冊(cè)诳逛X毒中的作用具 有非常重要的意義。同時(shí)，對(duì)克隆到的基因進(jìn)行改造或者構(gòu)建基因工程菌株，還可以為治理 酸性土壤上的鋁毒害問(wèn)題提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種鈣調(diào)素基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示，編碼如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；其由土生隱球酵母(C A腫icoA/dBSLLl-l菌株產(chǎn)生， 基因序列全長(zhǎng)450bp，與大豆疫霉菌(A如)：^)鈣調(diào)素基因同源性達(dá)到85%，鈣調(diào)蛋白由 149個(gè)氨基酸編碼，理論pi值為4. 36,分子量約為17KDa。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種鈣調(diào)素基因的重組表達(dá)載體pYES3/CT_CaM。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種含有鈣調(diào)素基因或上述重組表達(dá)載體的釀酒酵母工 程菌株。
[0009] 本發(fā)明另一目的是將鈣調(diào)素基因應(yīng)用在吸附環(huán)境中活性鋁中。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： 1、本發(fā)明利用從云南省保山市龍陵縣周邊茶園茶樹根際酸性土壤中分離的土生隱球 酵母(d Aawico/iAs) BSLL1-1 菌株，采用 TRIzoL 試劑盒（Invitrogen 公司）提取總 RNA, 然后用 PoylATract mRNA Isolation systems 試劑盒（Pormega 公司）進(jìn)行 mRNA 分離。以 鋁處理的土生隱球酵母為測(cè)試方，沒有鋁處理的作為消減方，構(gòu)建土生隱球酵母的正向SSH cDNA文庫(kù)。用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用限制性內(nèi)切酶T&al酶切，酶切產(chǎn) 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后涂布含氨 芐青霉素的平板，挑取陽(yáng)性菌落測(cè)序，鑒定出編碼CaM蛋白的基因，其序列如SEQ ID N0 :1 所示，該蛋白由149個(gè)氨基酸編碼，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0011] 2、以土生隱球酵母的cDNA作為模板，用特異引物擴(kuò)增CaM片段，與經(jīng)限制性 內(nèi)切酶酶切的PGEX-4T-1載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒 pGEX-4T-l-CaM和含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿菌BL21 (DE3) - pGEX-4T-l-CaM。
[0012] 3、從測(cè)序正確的pMD-18T-CaM質(zhì)粒上酶切回收目的片段，連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶 酶切的PYES3/CT質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pYES3/CT-CaM，將重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化釀酒酵母 (INVScl)感受態(tài)細(xì)胞，用Western blotting法在轉(zhuǎn)基因酵母中檢測(cè)到了目的條帶的存在， 從而成功得到含pYES3/CT-CaM表達(dá)載體的重組酵母工程菌株INVSc-pYES3/CT-CaM。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下： 本發(fā)明的鈣調(diào)素基因可以增加酵母的耐鋁能力，鈣調(diào)素基因工程菌株可以通過(guò)吸附作 用降低環(huán)境中活性鋁的含量，這種利用微生物修復(fù)環(huán)境中活性鋁的技術(shù)費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便， 對(duì)環(huán)境影響小，不會(huì)造成二次污染。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明鈣調(diào)素蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)電泳檢測(cè)示意圖，其中Μ :蛋白 Marker ;誘導(dǎo)時(shí)間0h，2h，4h，6h，8h ;空4Τ :轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照菌株；上清：誘導(dǎo)菌體上清液； 沉淀：誘導(dǎo)菌體沉淀； 圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母的構(gòu)建及檢測(cè)示意圖，其中A圖為pYES3/CT-CaM質(zhì)粒的酶 切檢測(cè)示意圖，1-5 JcoRI和通〇1酶切的pYES3/CT-CaM質(zhì)粒；B圖為Western blotting檢 測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母中CaM蛋白的表達(dá)； 圖3為本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因酵母耐鋁能力檢測(cè)示意圖； 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母吸附(或吸收)鋁能力的檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中：圖A為0.2mM 鋁時(shí)轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照酵母培養(yǎng)基中剩余鋁含量；圖B為2mM鋁時(shí)轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照酵母 培養(yǎng)基中剩余鋁含量。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0016] 實(shí)施例1 :土生隱球酵母(C. A應(yīng)BSLL1-1菌株CaM基因的克隆和鑒定 從云南省保山市龍陵縣周邊茶園茶樹根際酸性土壤中分離的一株對(duì)鋁離子具有高抗 性的土生隱球酵母（G A腫菌株，收集菌體材料約0. lg，采用TRIzoL試劑 盒（Invitrogen 公司）提取總 RNA 500 μ g，然后用 PoylATract mRNA Isolation systems 試劑盒（Pormega公司）進(jìn)行mRNA分離。以鋁處理的土生隱球酵母為測(cè)試方，沒有鋁處理 的作為消減方，來(lái)構(gòu)建土生隱球酵母的正向SSH cDNA文庫(kù)。
[0017] 1、cDNA第一條鏈的合成 分別取測(cè)試方和消減方的mRNA 2 μ g，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條 鏈。具體反應(yīng)如下：在兩個(gè)1.5 ml Eppendorf管中，分別加入測(cè)驗(yàn)方和消減方mRNA 2 yg 約2?4 yl，01igo (dT)18引物（ΙΟμπιοΙ/L) Ιμ?，然后加水至總體積5μ1?；旌喜⒖焖?短暫離心后，將Eppendorf管置于金屬浴中，70°C保溫2 min?？焖匐x心收集液體至管底， 冰上冷卻2 min。然后在每一個(gè)Eppendorf管中加入如下試劑，輕輕混合離心。5X第一鏈 Buffer 2μ 1，dNTP混合物(各10 mmol/L) 1 μ 1，滅菌去離子水1 μ 1，AMV反轉(zhuǎn)錄酶（20U/ μ 1) 1 μ 1。42°C保溫1. 5h，將Eppendorf管放于冰上終止第一條鏈的合成。
[0018] 2、cDNA第二條鏈的合成 在第一條鏈的反應(yīng)體系（10 μ 1)中加入如下成分：5X第二鏈Buffer 16 μ 1，dNTP混合 物(各10mmol/L) L 6 μ 1，20 X第二鏈酶混合物4 μ 1，加 ddH20 48. 4 μ 1至總體積70 μ 1。 將混合物短暫離心，16°C水浴或金屬浴保溫2 h。加入2 μ 1 (6們的T4 DNA聚合酶，混合均 勻。16°C水浴保溫30 min。加入4μ1 20XEDTA/肝糖原混合物以終止第二鏈的合成。加 入1〇〇μ1酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)。充分混合，14000轉(zhuǎn)/min室溫離心10 min。小心 地吸取上清液到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。加入ΙΟΟμΙ氯仿/異戊醇。小心地吸取上 清液到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。加入40 μ 1 4 mol/L NH6Ac和300 μ 1 95%乙醇。充 分混合，14000轉(zhuǎn)/min室溫離心20 min。小心地棄上清液，用500 μ 1 80%乙醇清洗沉淀。 14000轉(zhuǎn)/min室溫離心10 min。棄上清液?？諝飧稍?0 min,蒸發(fā)剩余的乙醇。用50 μ 1 滅菌去離子水溶解沉淀。
[0019] 3、7&a I 酶切 在 Eppendorf 管中加入 Ds cDNA 43.5yl，10X7&a I 酶酶切緩沖液 5yl，7&a I 酶（10 U/ μ 1) 1. 5 μ 1，加 ddH20使總體積達(dá)到50 μ 1。將混合物短暫離心，金屬浴37°C保溫過(guò)夜。 取出5 μ 1酶切混合物電泳分析I酶酶切的效果。加入2. 5 μ 1 20 XEDTA/肝糖原混合 物終止反應(yīng)。加入50μ1酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)，充分混合。室溫14000轉(zhuǎn)/min離心 10 min。小心地吸取上清液到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。加入50 μ 1氯仿：異戊醇，充 分混合。室溫14000 rpm離心10 min。小心地吸取上層的液體到一個(gè)干凈的Eppendorf 管。加入25μ1 4 mol/L NH4Ac和187·5μ1無(wú)水乙醇，充分混合。室溫14000 rpm離心 20 min。棄上清液。用200 μ 1 80%乙醇清晰沉淀。室溫14000 rpm離心10 min。小心地 棄去上清液，空氣干燥5~10 min。用5. 5 μ 1滅菌去離子水溶解沉淀物，貯存于-20°C。瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)I酶酶切產(chǎn)物。
[0020] 4、接頭的連接 此步驟中只有測(cè)驗(yàn)方cDNA連接接頭，消減方cDNA不連接接頭。將5 μ 1蒸餾水與T&a I 酶酶切的每種測(cè)驗(yàn)方cDNA 1 μ 1混合，進(jìn)行稀釋。在兩個(gè)0. 5 ml的微型Eppendorf管中分 別混合如下試劑：

【權(quán)利要求】
1. 一種鈣調(diào)素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，編碼如SEQ ID NO :2所示氨 基酸序列的蛋白質(zhì)。
2. -種含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)素基因的重組表達(dá)載體。
3. -種釀酒酵母工程菌株，所述工程菌株含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)素基因或權(quán)利要 求2所述的重組表達(dá)載體。
4. 權(quán)利要求1所述鈣調(diào)素基因在吸附環(huán)境中活性鋁中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK104195147SQ201410423604
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】年洪娟, 張磊, 張晶晶, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)