在不存在全能核酸酶的情況下分離synagis*的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】在不存在全能核酸酶的情況下分離synagis^的方法
[0001] 本申請(qǐng)包含一個(gè)經(jīng)由EFS-Web向美國(guó)專(zhuān)利及商標(biāo)局電子地提交為ASCII文本的序 列表，提交名稱(chēng)為"RSVAB-300P1_序列表_ST25.txt"，具有10千字節(jié)的大小并且創(chuàng)建日期 為2013年11月4日。該電子地提交的序列表充當(dāng)37CFR§ 1. 821 (c)要求的紙質(zhì)復(fù)印件以 及§1. 821(e)要求的CRF兩者。該序列表中所含的信息通過(guò)引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明針對(duì)一種從組合物中分離抗體的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括從包 含Synagis"的組合物中分離Synagis% (帕利珠單抗），該方法包括：（i)對(duì)該組合物進(jìn) 行一個(gè)離子交換色譜過(guò)程；（ii)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)親和純化過(guò)程；以及（iii)對(duì)該組合 物進(jìn)行一個(gè)過(guò)濾過(guò)程，其中一種終產(chǎn)物包括獲得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis氣其中 該終產(chǎn)物適合于向人類(lèi)給予并且具有< 〇.5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該 組合物中添加全能核酸酶（benzonase)。 發(fā)明背景
[0003] 抗體已經(jīng)用于各種疾病與病癥的治療并且總體上衍生自使用真核或原核細(xì)胞系 的細(xì)胞培養(yǎng)物。然而，在藥物應(yīng)用領(lǐng)域使用的抗體必須具有高純度，尤其是對(duì)于來(lái)自細(xì)胞培 養(yǎng)物的污染物而言，該細(xì)胞培養(yǎng)物包括細(xì)胞蛋白污染物、細(xì)胞DNA污染物、病毒以及其他可 傳染的藥劑。參見(jiàn)"WHO關(guān)于在生物制品生產(chǎn)中作為體外基質(zhì)的動(dòng)物細(xì)胞的應(yīng)用要求：關(guān)于 生物活性物質(zhì) No.50 的要求"（"WHO Requirementsfortheuseofanimalcellsasin vitrosubstratesfortheproductionofbiologicals:RequirementsforBiological SubstancesNo.50. "）878號(hào)，附錄 1，1998。
[0004] 響應(yīng)于關(guān)于污染物的關(guān)注點(diǎn)，世界衛(wèi)生組織（WHO)對(duì)多種污染物水平進(jìn)行設(shè)限。 例如，WHO建議對(duì)于蛋白產(chǎn)品而言每個(gè)劑量的DNA限值小于10ng。同樣地，美國(guó)食品與藥品 管理局（FDA)設(shè)定DNA限值為小于或等于0. 5pg/mg蛋白。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)藥學(xué)上可接受的抗體要求的所需純度水平，已經(jīng)報(bào)道了用于分離抗體的 多種方法。這些方法典型地涉及多個(gè)步驟以及除了其他細(xì)胞產(chǎn)物和污染物外，宿主細(xì)胞DNA 清除的報(bào)告，以達(dá)到與政府監(jiān)管的指導(dǎo)方針一致的純度水平。這些分離步驟取決于不同因 子而變化，包括進(jìn)行分離的抗體的特征、要產(chǎn)生的量、表達(dá)系統(tǒng)、以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基。然而，一 般而言該分離過(guò)程涉及用于表達(dá)抗體的細(xì)胞的初步裂解、DNA降解步驟、一個(gè)或多個(gè)色譜步 驟、病毒去除步驟、以及一個(gè)過(guò)濾步驟，僅舉幾例。
[0006] 確保必要純度的過(guò)程可以是昂貴且耗時(shí)的。因此，經(jīng)濟(jì)有效純化方法的發(fā)展對(duì)于 制藥和生物技術(shù)工業(yè)越來(lái)越重要。 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明針對(duì)一種從組合物中分離Synagis61的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包 括從包含Synagi的組合物中分離Synagis氣該方法包括：⑴對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)離 子交換色譜過(guò)程；（ii)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)親和純化過(guò)程；并且（iii)對(duì)該組合物進(jìn)行一 個(gè)過(guò)濾過(guò)程，其中一種終產(chǎn)物包括獲得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis'其中該終產(chǎn)物 適合于向人類(lèi)給予并且具有<〇.5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該組合物中 添加全能核酸酶。
[0008] 在一些實(shí)施例中，該方法不包括添加一種外源核酸酶到該組合物中。
[0009] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括進(jìn)行一個(gè)病毒滅活過(guò)程。例如，在一些 實(shí)施例中，該病毒滅活過(guò)程包括在pH小于4. 0下孵育該組合物。
[0010]
[0011] 在一些實(shí)施例中，該親和純化過(guò)程包括一個(gè)蛋白A純化過(guò)程。在一些實(shí)施例中， 該離子交換色譜過(guò)程是一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜過(guò)程。在一些實(shí)施例中，該陽(yáng)離子交換過(guò)程包 括使該抗體穿過(guò)選自下組的一種陽(yáng)離子樹(shù)脂，該組由以下各項(xiàng)組成：卡普托S(CaptoS)、 S_ 交聯(lián)瓊脂糖FF(S-S印haroseFF)、以及波羅斯 50HS(Poros50HS)。
[0012] 在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)第二離子交換過(guò)程。在一些實(shí)施例中，該 第二離子交換過(guò)程是一個(gè)陰離子交換色譜過(guò)程。
[0013] 在一些實(shí)施例中，該陰離子交換過(guò)程包括使該抗體穿過(guò)選自下組的一種陰離子 膜，該組由以下各項(xiàng)組成：超級(jí)Q(SuperQ)、那翠絲Q(NatrixQ)、科羅馬索布Q(Chromasorb Q)以及木斯塘Q(MustangQ)。
[0014] 在一些實(shí)施例中，該終產(chǎn)物具有>80% (mol/mol)的抗體得率。在一些實(shí)施例中， 該終產(chǎn)物的DNA濃度< 200ng/mg。
[0015] 在一些實(shí)施例中，該組合物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：免疫動(dòng)物血清、腹水 液、雜交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重組細(xì)胞系培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基、以及產(chǎn)免疫球蛋白細(xì)胞 的細(xì)胞提取物。
[0016] 在一些實(shí)施例中，該組合物來(lái)自一個(gè)生物反應(yīng)器。在一些實(shí)施例中，該組合物具有 大于100升的體積。在一些實(shí)施例中，該組合物具有大于1000升的體積。
[0017] 在一些實(shí)施例中，該親和純化過(guò)程發(fā)生在該離子交換過(guò)程后。在一些實(shí)施例中，該 過(guò)濾過(guò)程發(fā)生在該親和過(guò)程后。
[0018] 在一些實(shí)施例中，該方法包括從包含Synagis?的組合物中分離Synagis?,該 方法包括：（i)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜過(guò)程以形成一種包含該抗體的第一產(chǎn) 物；（ii)添加一種緩沖液到該第一產(chǎn)物中以形成一種緩沖產(chǎn)物；（iii)對(duì)該緩沖產(chǎn)物進(jìn)行 一個(gè)親和純化過(guò)程以形成一種包含該抗體的第二產(chǎn)物；（iv)對(duì)該第二產(chǎn)物進(jìn)行一個(gè)過(guò)濾 過(guò)程以形成一種包含該抗體的第三產(chǎn)物；（v)對(duì)該第三產(chǎn)物進(jìn)行一個(gè)病毒滅活過(guò)程；并且 (vi)配制該第三產(chǎn)物以形成一種終產(chǎn)物，其中該終產(chǎn)物包含Synagis?，Synagis?適合 于向人類(lèi)給予并且具有<〇.5pg/mg的DNA濃度；其中該方法不包括向該組合物中添加全能 核酸酶。
[0019] 在一些實(shí)施例中，該方法包括從包含Synagis?的組合物中分離Synagis'該方 法包括下列（i)-(v)中的至少三個(gè)：（i)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜過(guò)程；（ii) 對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)親和純化過(guò)程；（iii)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)超濾過(guò)程；（iv)對(duì)該組合 物進(jìn)行一個(gè)病毒滅活過(guò)程；以及（V)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)陰離子交換色譜過(guò)程；其中獲得 自⑴-(v)中的至少三個(gè)的產(chǎn)物包含Synagis?，適合于向人類(lèi)給予并且具有彡0. 5pg/mg 的DNA濃度；并且其中該方法不包括向該組合物中添加全能核酸酶。 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0020] 圖1是實(shí)例1中描述的"全能核酸酶"以及"無(wú)全能核酸酶"（benzonase-free)過(guò) 程的示意圖。該過(guò)程包括陽(yáng)離子交換色譜過(guò)程、三/氯化鎂緩沖液添加、蛋白A色譜過(guò)程、 納米過(guò)濾、低pH處理、以及陰離子交換色譜過(guò)程。
[0021] 圖2是實(shí)例2中描述的過(guò)程的示意圖。左欄表示其中在陽(yáng)離子色譜過(guò)程后加或 "添加"（spike) 了DNA的分離過(guò)程。右欄表示其中在低pH處理過(guò)程之后添加了DNA的分 離過(guò)程。 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0022] 本發(fā)明在部分上是基于在不存在全能核酸酶的情況下，對(duì)分離抗體或其片段的方 法的開(kāi)發(fā)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法提供分離的抗體，該方法包括：（i)對(duì)該組合物 進(jìn)行一個(gè)離子交換色譜過(guò)程；（ii)對(duì)該組合物進(jìn)行一個(gè)親和純化過(guò)程；以及（iii)對(duì)該組 合物進(jìn)行一個(gè)過(guò)濾過(guò)程，其中一種終產(chǎn)物獲得自（i)、（ii)、和（iii)，其中該終產(chǎn)物適合于 向人類(lèi)給予并且具有< 0. 5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該組合物中添加全 能核酸酶。在一些實(shí)施例中，該抗體具有大于8.0的等電點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，該抗體具有 大于9. 0的等電點(diǎn)。
[0023] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法使得制造商能夠以更有效的方式生產(chǎn)適用于向 人類(lèi)給予的抗體藥物產(chǎn)品，該方式為通過(guò)降低成本、減少方法步驟、降低錯(cuò)誤機(jī)會(huì)、降低不 安全或不適當(dāng)添加劑引入的機(jī)會(huì)等等，通過(guò)省去全能核酸酶或在一些實(shí)施例中任何外源 核酸酶的添加。在本發(fā)明中，抗體可以在不添加全能核酸酶的情況下來(lái)分離，以前該全 能核酸酶已在適合于向人類(lèi)給予的抗體的分離過(guò)程中被添加。全能核