專利名稱：一種發(fā)酵法制備核酸酶p的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)制備核酸酶P1的方法。
背景技術(shù)：
核酸的降解產(chǎn)物——核苷酸及其衍生物在食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品及生化試劑等領(lǐng)域具有十分廣泛的用途(陳陶聲，近代工業(yè)微生物學(xué)上冊，上?？萍汲霭嫔?，1979，153～164)，而核酸酶P1是酶解RNA、DNA成5’-核苷酸的主要用酶。
上個世紀(jì)60年代，日本為了開拓味精市場，就開始從降解RNA取得增鮮劑——調(diào)味核苷酸(5’-GMP和5’-IMP等)。1957年日本學(xué)者國中明等篩選到了一株青霉菌屬的桔青霉(Penicillium citrinum)(Agric Biol Chem 25，693(1961))，能分泌出一種胞外酶，具有磷酸二酯酶的功能，酶解RNA生成5’NMP。把此酶純化后，發(fā)現(xiàn)此酶除能降解RNA外，還能降解DNA，而且還具有切割3’-單核苷酸的磷酸，即3’-磷酸單酯酶的功能，與典型的磷酸二酯酶不同，故把此酶命名為核酸酶P1，其中P1是桔青霉的代表符號(Agric Biol Chem 38785，1974；39579，1975)。此后，酶解RNA生成5’-NMP都采用桔青霉生產(chǎn)核酸酶P1。
在國內(nèi)，1964年上海輕工業(yè)研究所和科學(xué)院微生物研究所等先后研究了用桔青霉生產(chǎn)核酸酶P1的方法，隨后上海工業(yè)微生物研究所用櫟曲霉(Aspergillus Fumigatus Fresemius)生產(chǎn)出酶活較高的核酸酶P1，1974年至1975年，上海食品加工廠采用桔青霉桔青霉3.2788進(jìn)行固體培養(yǎng)制備出核酸酶P1，(寧波大學(xué)學(xué)報10(3)21～28)。
上個世紀(jì)60年代末到70年代初，國內(nèi)“首都啤酒廠與中科院824任務(wù)組”也采用此菌桔青霉3.2788菌株，應(yīng)用固體培養(yǎng)法生產(chǎn)核酸酶P1，降解RNA，生成5’-NMP。(核苷酸類物質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用，科學(xué)出版社，1971)廣東江門和華北制藥廠曾應(yīng)用過液體培養(yǎng)法生產(chǎn)核酸酶P1，但是活力不高，且陳述的都是用菌絲體接種發(fā)酵罐，未見用孢子直接接種發(fā)酵罐(內(nèi)部交流，1982)。相對于固體培養(yǎng)法生產(chǎn)核酸酶P1，液體培養(yǎng)法具備環(huán)保的優(yōu)點。
關(guān)于核酸酶P1解核酸方面，有一些報道(Agric Biol Chem 38(9)1555-1561；38(11)2141～2147 38(4)785～790 1974)但多是從對底物特異性，作用方式等理論上進(jìn)行試驗和論證；根據(jù)這些理論，核酸酶P1對RNA酶解，應(yīng)是徹底的；但在工業(yè)上應(yīng)用，對RNA的酶解率僅略高于70％(劉樹煌，酶制劑工業(yè)，下冊P765，科學(xué)出版社，1984)。原有生產(chǎn)方法無論用固體和液體培養(yǎng)，酶活力單位都較低，只有100～150單位/毫升，并且發(fā)酵周期長，生產(chǎn)成本大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足提供一種制備核酸酶P1的方法；本發(fā)明的另一個目的在于針對上述不足提供一種有高活力的核酸酶P1液，以提高對核酸的酶解率。
本發(fā)明再一個目的是提供一種核酸酶P1高產(chǎn)菌株。
本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1是利用桔青霉的孢子體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從而大大地縮短了發(fā)酵培養(yǎng)的周期，同時P1酶液的單位酶活得到了提高；在發(fā)酵過程中采用分批補(bǔ)料地方式進(jìn)行添加培養(yǎng)基和葡萄糖，進(jìn)一步提高了P1酶的單位酶活。下面是本發(fā)明制備核酸酶P1的具體方法1、菌種活化取1環(huán)菌接入土豆斜面培養(yǎng)基，28～30℃培養(yǎng)3天為第一代，依此類推，轉(zhuǎn)接3～5代斜面培養(yǎng)基，常規(guī)保存?zhèn)溆谩?br> 2、擴(kuò)大培養(yǎng)用無菌水充分洗滌新鮮的第四代斜面，得到孢子懸浮液，取0.1～2.0毫升接入配制好的麩皮培養(yǎng)基中，28～30℃培養(yǎng)3天。麩皮孢子計數(shù)達(dá)到105～109個/克為合格。
3、發(fā)酵培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，按發(fā)酵罐有效容積70～80％裝罐；將步驟2得到的麩皮孢子按0.35～0.6克/升培養(yǎng)基接種到發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)采用分批補(bǔ)糖的方式進(jìn)行。
發(fā)酵條件控制在pH3.0～6.0，溫度28～30℃，罐壓0.03～0.1Mpa，通氣量0.5～2.0∶1，轉(zhuǎn)速100～300轉(zhuǎn)/分鐘。
通常發(fā)酵大約7小時后進(jìn)入對數(shù)生長期；24小時開始進(jìn)入產(chǎn)酶期。
發(fā)酵大約22～40小時，間隔2～6小時，分批補(bǔ)加液體培養(yǎng)基2～6次，以2噸發(fā)酵罐為例，每次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料。
發(fā)酵大約30～終止前兩小時，間隔2～6小時，分批補(bǔ)加葡萄糖，共補(bǔ)加2～6次，以2噸發(fā)酵罐為例，每次5～20公斤。
發(fā)酵40～60小時，當(dāng)pH值和溶氧曲線呈明顯上升趨勢，分別超過4.5和60％就可以終止發(fā)酵。
4、板框過濾采用板框過濾的方法進(jìn)行固液分離，獲得核酸酶P1液。
5、核酸酶P1液的保存低溫冷藏保存。
6、利用上述發(fā)酵所得到的核酸酶P1液用于酶解核糖核酸，酶解率高達(dá)85～90％，所得的酶解液中核苷酸的終濃度可達(dá)到15mg/ml以上。
本發(fā)明還提供了一種核酸酶P1高產(chǎn)菌株桔青霉(Penicilliumcitrinum)3.2788-Y01，該菌株是從桔青霉3.2788菌株出發(fā)，經(jīng)過高鋅離子濃度、亞硝酸鈉和紫外線等物理化學(xué)復(fù)合誘變，并純化篩選近千株菌得到的，該菌株已于2007年2月8號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1943。
上面所涉及到的培養(yǎng)基配方分別為馬鈴薯斜面培養(yǎng)基馬鈴薯(切片)300克，葡萄糖20克，瓊脂15克，水1000ml)麩皮固體培養(yǎng)基麩皮∶水＝1∶1.0～1.5液體發(fā)酵培養(yǎng)基磷酸鹽0.5～5g/L、硫酸鎂0.1～1g/L、碳酸鈣0.2～2g/L、硫酸鋅0.1～0.5g/L、工業(yè)蛋白胨1～10g/L、工業(yè)葡萄糖1～5g/L。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、使用麩皮上培養(yǎng)的孢子直接接種發(fā)酵罐，不需要一、二級種子發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，減少了設(shè)備成本，簡化了工藝，發(fā)酵周期50小時左右，縮短生產(chǎn)周期約5～6天；另外，若使用菌絲接種，發(fā)酵周期為60小時以上，相對而言縮短發(fā)酵周期約10小時；2、采用桔青霉3.2788-Y01菌株發(fā)酵，可使核酸酶P1活力在原菌株的基礎(chǔ)上增加200％，達(dá)到300單位/毫升；3、用分批補(bǔ)料發(fā)酵代替分批發(fā)酵，可使菌體量增加50％，核酸酶P1活力從300單位/毫升提高到500單位/毫升以上。
4、采用桔青霉3.2788-Y01菌株生產(chǎn)的核酸酶P1液進(jìn)行酶解，可獲得酶解率高達(dá)85～90％，核苷酸的濃度可達(dá)到15mg/ml以上。


圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 制備麩皮孢子1、菌種活化取1環(huán)菌接入土豆斜面培養(yǎng)基，28～30℃培養(yǎng)3天為第一代，依此類推，轉(zhuǎn)接四代斜面培養(yǎng)基，常規(guī)保存?zhèn)溆谩?br> 2、擴(kuò)大培養(yǎng)用無菌水充分洗滌新鮮的第四代斜面，得到孢子懸浮液，取0.1～2.0毫升接入配制好的麩皮培養(yǎng)基中，28～30℃培養(yǎng)3天。麩皮孢子計數(shù)達(dá)到109個/克。
實施例2(2噸發(fā)酵罐)1、培養(yǎng)基配方磷酸鹽15Kg、硫酸鎂3Kg、碳酸鈣3Kg、硫酸鋅1.2Kg、工業(yè)蛋白胨15Kg、工業(yè)葡萄糖9Kg，用水補(bǔ)足至1500L。
2、接種量900克麩皮孢子(實施例1)；3、培養(yǎng)溫度29～30℃；4、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速150rpm～250rpm，當(dāng)溶氧降至40％以下時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速；7、通氣量1.5m3/min；8、罐壓0.05～0.06Mpa；9、初始pH值6.010、補(bǔ)加培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)約24.1小時，開始培養(yǎng)基第一次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；發(fā)酵培養(yǎng)約29.5小時，進(jìn)行培養(yǎng)基第二次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；發(fā)酵培養(yǎng)約32小時，進(jìn)行培養(yǎng)基第三次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料。
11、補(bǔ)加葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)約34小時，進(jìn)行第一次補(bǔ)葡萄糖5公斤；
發(fā)酵培養(yǎng)約36小時，進(jìn)行第二次補(bǔ)葡萄糖5公斤；發(fā)酵培養(yǎng)約38小時，進(jìn)行第三次補(bǔ)葡萄糖5公斤；發(fā)酵培養(yǎng)約43小時，進(jìn)行第四次補(bǔ)葡萄糖5公斤。
7、終止發(fā)酵發(fā)酵46小時，pH值和溶氧曲線呈明顯上升趨勢，分別達(dá)到4.7和62％。核酸酶P1活力532單位/毫升，發(fā)酵終體積1250升。
8、酶解(8噸罐)酶解率為90％，核苷酸的終濃度為16.2mg/ml。
實施例3(2噸發(fā)酵罐)1、培養(yǎng)基配方磷酸鹽3Kg、硫酸鎂1.3Kg、碳酸鈣1.3Kg、硫酸鋅1.5Kg、工業(yè)蛋白胨30Kg、工業(yè)葡萄糖6Kg，用水補(bǔ)足至1500L。
2、接種量840克麩皮孢子；3、培養(yǎng)溫度29～30℃；4、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速150rpm～270rpm，當(dāng)溶氧降至40％以下時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速；7、通氣量1.5m3/min；8、罐壓0.05～0.06Mpa；9、初始pH值5.910、補(bǔ)加培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)約23小時，開始培養(yǎng)基第一次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；發(fā)酵培養(yǎng)約28小時，進(jìn)行培養(yǎng)基第二次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；發(fā)酵培養(yǎng)約33小時，進(jìn)行培養(yǎng)基第三次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；發(fā)酵培養(yǎng)約36小時，進(jìn)行培養(yǎng)基第四次補(bǔ)加250L發(fā)酵罐培養(yǎng)基所需的干料；
11、補(bǔ)加葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)約38.5小時，進(jìn)行第一次補(bǔ)葡萄糖5公斤；發(fā)酵培養(yǎng)約43小時，進(jìn)行第二次補(bǔ)葡萄糖15公斤。
發(fā)酵培養(yǎng)約57小時，進(jìn)行第三次補(bǔ)葡萄糖5公斤。
11、終止發(fā)酵發(fā)酵59小時，pH值和溶氧曲線呈明顯上升趨勢，分別達(dá)到4.6和60％。核酸酶P1活力662單位/毫升，發(fā)酵終體積1280升。
12、酶解(8噸罐)酶解率為88％，核苷酸的終濃度為16.1mg/ml。
試驗例1、酶活力的測定稱取100mg核糖核酸(純度100％)溶于5毫升水中，即為2％的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液。
鉬酸銨-過氯酸試劑0.25％鉬酸銨溶于2.5％過氯酸中。(如配200ml該試劑則在193ml水中加入70％過氯酸7ml和0.5g鉬酸銨)取甲乙兩支試管，分別加入2％核酸1ml和0.8ml 0.2M pH5醋酸緩沖液。63℃預(yù)熱10分鐘，然后甲管加入0.2ml酶液。繼續(xù)保溫30分鐘。甲乙兩管分別加入2ml鉬酸銨-過氯酸試劑。乙管補(bǔ)加0.2ml酶液，混勻。冷卻放置15分鐘后離心。分別取0.1ml上清液加9.9ml無離子水。測OD260值。酶活力＝(OD260甲-OD260乙)×100×酶液稀釋倍數(shù)2、5’-單核苷酸的測定降解液經(jīng)處理后，吸上清液0.1微升定容到10毫升。標(biāo)準(zhǔn)在使用前需將標(biāo)準(zhǔn)磷溶液稀釋10倍，取試管按下表表1順序(一二三四五)加樣品和試劑，各管凡加畢甲胺試劑后在45℃水浴保溫10分鐘，再分別加定磷試劑3毫升，繼續(xù)在45℃保溫20分鐘，冷卻至室溫后，以空白作為對照，測OD650。同時以標(biāo)準(zhǔn)磷測定結(jié)果作為參比定磷值。甲(氧化)和乙(不氧化)含磷量之差即為5’-核苷酸磷。
表1 5’-單核苷酸的測定 簡化為5’-核苷酸(g)＝(甲-乙)含磷量(mg/ml)×1.097×總體積(L)31-磷原子量；340-四種單核苷酸平均分子量；100-樣品稀釋倍數(shù)。
4、核酸降解率的計算
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵法制備核酸酶P1的方法，其特征在于，采用桔青霉孢子體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵前期分批補(bǔ)加培養(yǎng)基，后期分批補(bǔ)加葡萄糖。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述桔青霉孢子體通過如下方式獲得取桔青霉菌株經(jīng)活化后，取其孢子制成懸液接種麩皮培養(yǎng)基，28～30℃培養(yǎng)3天。
5.如權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其特征在于，所述的桔青霉為桔青霉3.2788或桔青霉3.2788-Y01。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5所述方法制得的核酸酶P1液。
7.一種核酸酶P1高產(chǎn)菌株桔青霉(Penicillium citrinum)3.2788-Y01 CGMCC No.1943。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵法制備核酸酶P
文檔編號C12N1/14GK101037681SQ20071006391
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者洪娜, 陳慎, 黎高沃 申請人:北京燕京中科生物技術(shù)有限公司