專利名稱：一種g蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體和它的編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體和它的編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，它參與調(diào)控眾多的植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程，特別是在植物對(duì)逆境，如干旱、鹽堿、低溫等的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鑒于ABA在植物中的重要作用，人們已經(jīng)對(duì)ABA的作用及其機(jī)制進(jìn)行了大量、廣泛的研究，目前人們對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的組分已有了相當(dāng)多的了解。最近的兩個(gè)報(bào)導(dǎo)表明一種細(xì)胞核定位的RNA結(jié)合蛋白FCA和一種葉綠體定位的參與葉綠素合成的CHLH亞基也可能是ABA的受體。然而FCA并不參與調(diào)控典型的ABA反應(yīng)，如種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)等，而且ABA不敏感突變體也沒有FCA突變體的表型，表明FCA不是ABA的主要受體。以前的眾多研究結(jié)果表明ABA的接受位點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)膜外測(cè)，所以其它的ABA受體，特別是質(zhì)膜上的ABA受體，可能是參與ABA逆境反應(yīng)的主要參與者。
由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是在真核生物中比較保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的作用模式是GPCR定位在質(zhì)膜上，其在質(zhì)膜外測(cè)的結(jié)構(gòu)域接受細(xì)胞外的信號(hào)，而GPCR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與異三聚體G蛋白相偶聯(lián)，從而通過G蛋白進(jìn)一步把信號(hào)傳遞下去。在動(dòng)物細(xì)胞中GPCR介導(dǎo)的信號(hào)途徑是最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，比如動(dòng)物對(duì)視覺、味覺、嗅覺的感知就是通過GPCR介導(dǎo)的信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。動(dòng)物中GPCR和G蛋白的種類也很多，如人的細(xì)胞中大約有1000種GPCR，20多種Gα，6種Gβ和12種Gγ(Morris，A.J.& Malbon，C.C.Physiological regulation of G protein-linked signalling.Physiol.Rev.79，1373-1430(1999)；Spiegel，A.M.& Weinstein，L.S.Inherited diseasesinvolving G proteins and G protein-coupled receptors.Annu.Rev.Med.55，27-39(2004))。GPCR介導(dǎo)的途徑發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，現(xiàn)在臨床上所用的藥物大約50％就是針對(duì)GPCR設(shè)計(jì)的。與此相反，高等植物中的GPCR和G蛋白的種類則非常有限，如模式生物擬南芥基因組中只有一種Gα(GPA1)、一種Gβ(AGB1)和2種Gγ(AGG1和AGG2)，而且到目前為止只有一種GPCR(GCR1)被比較詳細(xì)地研究過，目前植物中還沒有找到任何一種GPCR的配基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體和它的編碼基因。
本發(fā)明所提供的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體，名稱為GCR2，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能與G蛋白相互作用并可與脫落酸結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列2由401個(gè)氨基酸殘基組成。
可在序列2的自氨基末端第1-50位氨基酸殘基進(jìn)行取代，在自氨基末端第290-401位氨基酸殘基進(jìn)行缺失和/或添加。
為了(a)中的GCR2便于純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1.標(biāo)簽的序列

上述(b)中的GCR2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的GCR2的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID №1的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
上述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體編碼基因(GCR2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因的編碼序列可為序列表中序列1的自5′末端第1位至1206位脫氧核糖核苷酸組成的核苷酸序列。
所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因，具體可為如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的DNA分子。
所述嚴(yán)格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。
序列表中的序列1由1206個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的基因組基因的核苷酸序列是序列表中的序列3，由1662個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
含有上述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
和動(dòng)物在遇到不利環(huán)境可以立即逃避不同，植物根植于土地上不能移動(dòng)，所以對(duì)外界的逆境不能逃避，只能選擇忍受和抵抗。在植物對(duì)外界逆境抵抗反應(yīng)中，植物激素ABA發(fā)揮著重要作用，植物對(duì)逆境的抵抗很大程度上依賴ABA，所以研究植物接受ABA信號(hào)的分子機(jī)制不但有重要的理論意義，而且還具有潛在的重大的應(yīng)用前景。本發(fā)明以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明GCR2是ABA的主要受體并參與調(diào)控ABA介導(dǎo)的反應(yīng)1、gcr2突變體對(duì)ABA的所有反應(yīng)均缺失；2、超表達(dá)GCR2對(duì)ABA的反應(yīng)超敏感；3、GCR2可以結(jié)合ABA，并滿足受體動(dòng)力學(xué)特征；4、GCR2定位于細(xì)胞質(zhì)膜上；5、GCR2與G蛋白α亞基GPA1相互作用；6、ABA與GCR2結(jié)合導(dǎo)致GCR2-GPA1復(fù)合體解離，進(jìn)而游離Gα去激活下游效應(yīng)器。本發(fā)明不但證實(shí)GCR2是ABA的受體，而且還搞清除了ABA信號(hào)接受和傳遞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并發(fā)現(xiàn)了植物體系中的第一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體-配基對(duì)。據(jù)此，可以通過調(diào)節(jié)GCR2的表達(dá)和活性來改變和影響植物對(duì)逆境(如干旱、低溫等)的反應(yīng)。另外，ABA-GCR2是目前植物中已知的唯一一對(duì)受體-配基對(duì)，這一受體-配基對(duì)可以在其它方面應(yīng)用。


圖1為GCR2跨膜域預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位圖2為用表面等離子共振驗(yàn)證GCR2和GPA1的相互作用圖3為用酵母裂解系統(tǒng)驗(yàn)證GCR2和GPA1之間的相互作用圖4為用雙分子熒光和免疫共沉淀驗(yàn)證GCR2和GPA1在植物體內(nèi)的相互作用圖5為gcr2突變體的鑒定圖6為GCR2突變導(dǎo)致的ABA反應(yīng)發(fā)生變化圖7為GCR2突變體中ABA調(diào)控基因表達(dá)變化圖8為GCR2突變體和超表達(dá)植株葉片失水速率圖9為GCR2和GPA1在調(diào)控氣孔關(guān)閉過程中的相互作用圖10為ABA和GCR2的結(jié)合
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)1、GCR2是一種細(xì)胞質(zhì)膜蛋白通過軟件做跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GCR2具有七次跨膜的結(jié)構(gòu)(圖1中A和B)。把GCR2用YFP標(biāo)記以后轉(zhuǎn)化擬南芥，在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)GCR2定位在質(zhì)膜上(圖1中C)，并進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因植物的膜組分提取出來用抗GFP抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GCR2主要存在于膜組分中，而且經(jīng)過去污劑或高pH值的緩沖液洗滌后GCR2還是存在于膜組分中，表明GCR2是一種膜內(nèi)在蛋白(圖1中D)。
2、GCR2與異三聚體G蛋白α亞基發(fā)生直接相互作用上述GCR2結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明GCR2可能是一種新的GPCR。GPCR的特點(diǎn)之一是能夠與G蛋白結(jié)合形成一個(gè)蛋白復(fù)合體。為了證實(shí)GCR2與Gα之間的關(guān)系，本發(fā)明用四種方法來證明它們?cè)隗w外和體內(nèi)的相互作用。首先，用表面等離子共振的方法檢測(cè)GCR2是否可以和GPA1相互作用。首先在細(xì)菌中分別表達(dá)和純化了GCR2和GPA1的重組蛋白，然后分別把GCR2或BSA標(biāo)記在芯片的表面，并讓不同濃度的GPA1溶液流過芯片的表面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GCR2可以和GPA1相互作用，而對(duì)照BSA不能和GPA1相互作用。GCR2和GPA1相互作用的解離常數(shù)是2.1×10-9M(圖2)。
由于常規(guī)的酵母雙雜交不能檢測(cè)膜蛋白之間的相互作用，本發(fā)明用分裂泛素系統(tǒng)(Split-Ubiquitin)來檢測(cè)GCR2和GPA1在酵母中的可能的相互作用。結(jié)果如圖3所示，全長(zhǎng)的GCR2可以與GPA1相互作用，但當(dāng)GCR2的C-末端被影響后，GCR2就不能再與GPA1相互作用，進(jìn)一步觀察到GCR2的C-末端(C290-401，包括C-末端和預(yù)測(cè)的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)域)可以與GPA1相互作用(圖3)，表明對(duì)GCR2與GPA1相互作用而言，GCR2的C-末端是必需和足夠的。
進(jìn)一步用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)來驗(yàn)證GCR2和GPA1在植物體內(nèi)的相互作用。結(jié)果表明，GCR2和GPA1可以在植物體內(nèi)相互作用，它們相互作用發(fā)生在質(zhì)膜上而且GCR2的C-末端對(duì)它們體內(nèi)相互作用是必需的(圖4)。
3、GCR2參與ABA的調(diào)控的過程為了研究GCR2的生物學(xué)功能，鑒定了GCR2的三個(gè)基因敲除等位基因突變體，gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3。轉(zhuǎn)錄水平分析證實(shí)這三個(gè)突變體都沒有GCR2全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，但都有部分轉(zhuǎn)錄本存在(圖5)。
植物的種子在母體內(nèi)形成以后有一個(gè)休眠過程，從而防止種子在母體上萌發(fā)。結(jié)果表明從新鮮成熟的野生型擬南芥植株中得到的種子直接種到培養(yǎng)基上種子不能萌發(fā)，而從GCR2的三個(gè)等位基因突變體上得到的相同發(fā)育時(shí)期的種子都可以萌發(fā)(圖6A)，說明gcr2突變體種子休眠過程喪失。種子休眠過程主要是由植物激素ABA控制的，暗示gcr2突變體可能導(dǎo)致ABA信號(hào)途徑障礙，并降低了植物對(duì)ABA的敏感性。為了進(jìn)一步證實(shí)上述假設(shè)，檢測(cè)了gcr2突變體對(duì)ABA控制的其它過程的反應(yīng)。與野生型植物相比，gcr2突變體對(duì)ABA抑制的種子萌發(fā)不敏感，但GCR2超表達(dá)植株對(duì)ABA抑制的種子萌發(fā)超敏感(圖6中B)，gcr2突變體對(duì)ABA抑制的幼苗發(fā)育不敏感，而其超表達(dá)植株對(duì)ABA控制的幼苗發(fā)育超敏感(圖6中C)。ABA調(diào)節(jié)植物發(fā)育是通過其調(diào)控一些基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，為此比較一些典型的受ABA調(diào)控的基因在野生型和gcr2突變體的表達(dá)情況。選取三種已知的ABA調(diào)控的基因，包括RD29A、KIN1、和ABI5，把它們的啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)植物，結(jié)果表明與野生型植株相比，這三個(gè)基因在GCR2突變體中的表達(dá)水平被顯著抑制(圖7)，表明GCR2突變也影響了受ABA調(diào)控基因的表達(dá)。
植物的氣孔是植物與外界環(huán)境進(jìn)行水分和氣體交換的門戶。在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，植物通過氣孔交換水分和氣體，從而保證植物體內(nèi)的水分狀態(tài)平衡并進(jìn)行正常的光合作用。在逆境條件下，植物為了防止水分過度散失而關(guān)閉氣孔。目前已知調(diào)控氣孔開閉的主要激素是ABA，由ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和ABA抑制的氣孔開放是ABA的經(jīng)典反應(yīng)。結(jié)果表明在外源ABA的處理下(模擬逆境條件)，野生型植物的氣孔很快關(guān)閉，而gcr2突變體的氣孔卻照常開放(圖6中D)。同時(shí)gcr2突變體的氣孔對(duì)ABA抑制的氣孔開放也不敏感(圖6中E)。ABA調(diào)控氣孔開放是通過調(diào)控植物氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的K+通道活性實(shí)現(xiàn)的，為此，用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)了野生型和gcr2突變體的保衛(wèi)細(xì)胞中的K+通道的活性，表明外源ABA可以抑制野生型植物的保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流的K+通道的活性，但gcr2突變體保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流K+通道活性卻對(duì)外源ABA處理沒有反應(yīng)(圖6中F)，表明GCR2參與調(diào)控由ABA控制的內(nèi)流K+通道的活性。與野生型植株氣孔反應(yīng)相比，GCR2超表達(dá)植株氣孔關(guān)閉對(duì)ABA超敏感(圖6中G)，作為氣孔關(guān)閉的反應(yīng)，gcr2突變體葉片失水速率較野生型植株葉片要快，而GCR2超表達(dá)植株葉片失水速率比野生型葉片要慢(圖8)。綜合上述結(jié)果，表明GCR2參與調(diào)控了所有ABA的重要反應(yīng)。
4、GCR2和GPA1共同作用調(diào)控ABA反應(yīng)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GCR2的突變體導(dǎo)致ABA反應(yīng)缺失。GPA1的突變體也會(huì)導(dǎo)致一些ABA反映的缺失(Wang等，2001，G protein regulation of ion channels andabscisic acid signalling in Arabidopsis guard cells.Science 292，2070-2072)，表明二者可能共同作用傳遞ABA信號(hào)。結(jié)果表明GCR2和GPA1有相同的表達(dá)模式(圖9中A和B)，進(jìn)而用氣孔關(guān)閉做為指標(biāo)觀察二者在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互關(guān)系。gcr2和gpa1的雙重突變體對(duì)ABA的反應(yīng)與它們各自的單突變體相似，超表達(dá)GCR2或GPA1能使植物對(duì)ABA信號(hào)超敏感，但GCR2的這種作用依賴于GPA1的存在，GPA1的作用也依賴于GCR2的存在(圖9中C和D)，表明是GCR2和GPA1共同作用傳遞ABA信號(hào)。
5、GCR2是ABA的質(zhì)膜受體上述結(jié)果表明GCR2參與調(diào)控所有ABA反應(yīng)，而且GCR2本身是一種膜受體，暗示GCR2可能就是ABA的受體。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，首先檢測(cè)純化的GCR2重組蛋白是否可以結(jié)合ABA。結(jié)果表明GCR2確實(shí)可以結(jié)合ABA，但變性的GCR2以及GPA1和BSA都不能結(jié)合ABA(圖10中A)。GCR2與ABA的結(jié)合是特異性的，因?yàn)锳BA的無生理活性的結(jié)構(gòu)同系物不能與GCR2結(jié)合(圖10中B)。ABA與GCR2的結(jié)合具有飽和性(圖10中C)，二者結(jié)合的解離常數(shù)為20.1nM，每一個(gè)GCR2蛋白可以結(jié)合一個(gè)ABA分子(圖10中D)。
進(jìn)一步在重組的酵母體系中發(fā)現(xiàn)用處理后，GCR2-GPA1復(fù)合體的數(shù)量減少，同時(shí)酵母的生長(zhǎng)受到抑制(圖10中E)，表明ABA與GCR2結(jié)合導(dǎo)致GCR2-GPA1復(fù)合體的解離，從而游離Gα和Gβγ亞基去激活下游的效應(yīng)器。
下面通過具體的實(shí)施例來闡明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
除了特別說明，所有實(shí)驗(yàn)用到的擬南芥的生態(tài)型為Columbia(Col-0)背景。
實(shí)施例1、GCR2及其編碼基因的獲得為了進(jìn)一步研究和鑒定植物中新的GPCR，根據(jù)目前已知的GPCR，設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR特異引物(上游5’-GCGGATCCATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’；下游5’-CCGCTCGAGTTAGAGTTCATAACCTGGAAACAGAG-3)，以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(ABRC)的蓮座葉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物具有序列表中序列2的核苷酸序列，為GCR2的cDNA序列，編碼氨基酸序列是序列表中序列1的GCR2。
將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切后，克隆至pET28a(Novagen)的BamHI和XhoI位點(diǎn)之間，得到重組載體pET28a-GCR2。pET28a-GCR2表達(dá)的GCR2的N端帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白His6-GCR2。將pET28a-GCR2轉(zhuǎn)化BL21(Novagen)，挑選卡那霉素(Kan)抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，在含有Kan液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定。陽(yáng)性克隆液體搖培過夜，1∶50擴(kuò)培到1L含Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)搖培1.5-2個(gè)小時(shí)到OD600＝0.6后加入IPTG至終濃度0.8mM，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)后，12000g，4度離心30分鐘收集菌體。表達(dá)的GCR2的N端帶有His6標(biāo)簽，按照Qiagen公司的技術(shù)手冊(cè)中利用Ni-NTA agarose柱操作純化蛋白。其中所用緩沖液做如下調(diào)整裂解緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，0.1％ Triton X-100，pH8.0)，洗滌緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，15mM imidazole，pH8.0)，洗提緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0)。洗提下的蛋白立刻用陰離子交換柱(Source-Q，Pharmacia)純化，洗提緩沖液為A(25mM HEPES，3mMDTT，pH8.0)及B(25mM HEPES，3mM DTT，1M NaCl，pH8.0)。得到的純化的His6-GCR2，將His6-GCR2中的His6標(biāo)簽通過Thrombin酶切除去，得到GCR2。蛋白質(zhì)序列分析儀測(cè)定GCR2的N末端氨基酸序列。結(jié)果表明該GCR2的N末端15個(gè)氨基酸殘基是MPEFVPEDLS GEEET，與序列表中序列1的N末端15個(gè)氨基酸殘基一致。
根據(jù)GCR2的cDNA序列設(shè)計(jì)引物上游5’-GCTCTAGAATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’；下游5’-CGAGCTCTTAGAGTTCATAACCTGGAAACAGAG-3，以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增GCR2的基因組DNA，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物具有序列表中序列3的核苷酸序列，為GCR2的基因組DNA序列，自序列3的5′末端第1-144位脫氧核糖核苷酸為第一外顯子，145-277位脫氧核糖核苷酸為第一內(nèi)含子，278-456位脫氧核糖核苷酸為第二外顯子，457-527位脫氧核糖核苷酸為第二內(nèi)含子，528-639位脫氧核糖核苷酸為第三外顯子，640-732位脫氧核糖核苷酸為第三內(nèi)含子，733-849位脫氧核糖核苷酸為第四外顯子，850-931位脫氧核糖核苷酸為第四內(nèi)含子，932-1246位脫氧核糖核苷酸為第五外顯子，1247-1323位脫氧核糖核苷酸為第五內(nèi)含子，1324-1662位脫氧核糖核苷酸為第六外顯子。
實(shí)施例2、GCR2是一種膜蛋白通過軟件DAS和TMpred做GCR2的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1中A和B所示，表明GCR2為七次跨膜蛋白。
以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的蓮座葉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，利用RT-PCR特異引物(上游5’-CCGCTCGAGATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’；下游5’-CTCCTTTACTAGGCCTCATGAGTTCATAACCTGGAAACAGAGC-3，PCR擴(kuò)增GCR2的序列1的自5′端第1至1203位脫氧核苷酸序列，同時(shí)引物末端帶有部分YFP蛋白核苷酸序列；同時(shí)用RT-PCR特異引物(上游5’-CCGCTCGAGATGAGGCCTAGTAAAGGAG-3’；下游5’-GACTAGTTTATHGTATAGTTCATCCATGC-3，PCR擴(kuò)增pEYFP(Clontech)上的YFP，然后回收2個(gè)PCR產(chǎn)物混合一起為模板，用上游5’-CCGCTCGAGATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’；下游5’-GACTAGTTTATTTGTATAGTTCATCCATGC-3，引物擴(kuò)增GCR2-YFP融合蛋白的核苷酸序列序列，產(chǎn)物克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果正確的克隆質(zhì)粒通過XhoI和SpeI酶切下片段連接進(jìn)入pBI101(Clontech)的XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)間，重組載體命名為pTA-GCR2-YFP。同時(shí)把PCR擴(kuò)增回收下來的YFP片段克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果正確的克隆質(zhì)粒通過XhoI和SpeI酶切下片段連接進(jìn)入pBI101的XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)間，重組載體命名為pTA-YFP。
pTA-GCR2-YFP或pTA-YFP通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dipa simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaiiana.Plant-Journal.1998，166，735-743)利用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥，對(duì)得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株用潮霉素(Hygromycin B，購(gòu)自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pTA-GCR2-YFPT0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定引物上游5’-GTTCACTGGTGTCACGGTGCTCCTGG-3’；下游5’-GACTAGTTTATTTGTATAGTTCATCCATGC-3，得到1119bp大小的片段(其中396bp為GCR2 C末端序列，723bp為YFP序列) 的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pTA-GCR2-YFP T0代植株。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pTA-YFP T0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定引物上游5’-CCGCTCGAGATGAGGCCTAGTAAAGGAG-3’；下游5’-GACTAGTTTATTTGTATAGTTCATCCATGC-3，得到723bp大小的片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pTA-YFP T0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。
結(jié)果如圖1中C所示，表明GCR2定位在Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥細(xì)胞的質(zhì)膜上(圖1C)。圖1中C，YFP表示激光共聚焦下YFP熒光圖照片，明視野表示透射光下組織照片，拼合表示熒光圖和透射光圖疊加照片；pTA-GCR2-YFP表示轉(zhuǎn)pTA-GCR2-YFP的根細(xì)胞照片，pTA-YFP表示轉(zhuǎn)pTA-YFP的根細(xì)胞照片。
進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因植物的膜組分提取出來用抗GFP抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GCR2主要存在于膜組分中，而且經(jīng)過去污劑或高pH值的緩沖液洗滌后GCR2還是存在于膜組分中，表明GCR2是一種膜內(nèi)在蛋白(圖1中D)。具體實(shí)驗(yàn)方法如下提取PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pTA-GCR2-YFP T1代植株、轉(zhuǎn)pTA-YFP T1代植株的總蛋白，樣品在液氮里充分研磨后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的研缽中加入3倍體積提取緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5或pH10，150mM NaCl，50mM蔗糖，1mM PMSF，0.1％或0.5％ Triton X-100，和1×植物蛋白酶抑制劑cocktail)(該蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche)繼續(xù)研磨充分。15，000g 4℃離心20分鐘。上清液于4℃，100000g離心1小時(shí)分離可溶蛋白和膜蛋白(沉淀)組分。將可溶蛋白和膜蛋白組分用樣品緩沖液溶解后用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白。蛋白濃度用Bradford法定量(Bio-Rad)。20微克的蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE膠電泳隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用兔源anti-GFP(Santa Cruz)抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。
圖1中D，pTA-GCR2-YFP表示轉(zhuǎn)pTA-GCR2-YFP的植株，pTA-YFP表示轉(zhuǎn)pTA-YFP植株；S表示可溶性蛋白組分；M表示膜蛋白組分；T表示總蛋白。
實(shí)施例3、GCR2與異三聚體G蛋白α亞基發(fā)生直接相互作用上述GCR2結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明GCR2可能是一種新的GPCR。GPCR的特點(diǎn)之一是能夠與G蛋白結(jié)合形成一個(gè)蛋白復(fù)合體。為了證實(shí)GCR2與Gα之間的關(guān)系，用四種方法證明來它們?cè)隗w外和體內(nèi)的相互作用。
一、首先，用表面等離子共振的方法檢測(cè)GCR2和GPA1的相互作用1、GPA1的N端帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白His6-GPA1的表達(dá)及純化以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(ABRC)的蓮座葉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，利用一對(duì)RT-PCR特異引物(上游5’-GGAATTCATGGGCTTACTCTGCAGTAGAAG-3’；下游5’-CCGCTCGAGTCATAAAAGGCCAGCCTCCAGAAAATTTC-3)進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是GenBank Accession Number為AT2G26300的自5′端第1至1152位脫氧核苷酸的GPA1的核苷酸片段。
將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切后，克隆至pET28a的EcoRI和XhoI位點(diǎn)之間，得到重組載體pET28a-GPA1。pET28a-GPA1表達(dá)的GPA1的N端帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白His6-GPA1。將pET28a-GPA1轉(zhuǎn)化BL21(Novagen)，挑選Kan抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，在Kan液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定。陽(yáng)性克隆液體搖培過夜，1∶50擴(kuò)培到1L含Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)搖培1.5-2個(gè)小時(shí)到OD600＝0.6后加入IPTG至終濃度0.8mM，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)后，12000g，4度離心30分鐘收集菌體。表達(dá)的GPA1的N端帶有His6標(biāo)簽，按照Qiagen公司的技術(shù)手冊(cè)中利用Ni-NTA agarose柱操作純化蛋白。其中所用緩沖液做如下調(diào)整裂解緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，0.1％ Triton X-100，pH8.0)，洗滌緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，15mMimidazole，pH8.0)，洗提緩沖液(25mM HEPES，50mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0)。洗提下的蛋白立刻用陰離子交換柱(Source-Q，Pharmacia)純化，洗提緩沖液為A(25mM HEPES，3mM DTT，pH8.0)及B(25mM HEPES，3mM DTT，1M NaCl，pH8.0)。得到的純化的His6-GPA1。
2、表面等離子共振檢測(cè)GCR2和GPA1的相互作用實(shí)時(shí)蛋白-蛋白相互作用分析用的儀器為BIAcore 2000(BIAcore)。操作按照儀器說明書進(jìn)行。純化好的His6-GCR2(200μg/ml)及BSA(200μg/ml，Sigma)蛋白用N端偶聯(lián)試劑盒(BIAcore)分別固定在CM5傳感芯片上。不同濃度的His6-GPA1蛋白分別流過標(biāo)記不同蛋白的小室，其中標(biāo)記GCR2的為檢測(cè)GCR2-GPA1相互作用，標(biāo)記BSA蛋白的為陰性對(duì)照。不同濃度的His6-GPA1蛋白(200，700，1400nM)流過芯片表面來獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)。參數(shù)的分析用軟件為BIAevaluation software3.2。所選用的模型為1∶1配基-受體模型。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GCR2可以和GPA1相互作用，而對(duì)照BSA不能和GPA1相互作用。GCR2和GPA1相互作用的解離常數(shù)是2.1×10-9M(圖2)。
二、分裂泛素系統(tǒng)(Split-Ubiquitin)檢測(cè)GCR2和GPA1在酵母中的相互作用由于常規(guī)的酵母雙雜交不能檢測(cè)膜蛋白之間的相互作用，本發(fā)明用分裂泛素系統(tǒng)(Split-Ubiquitin)來檢測(cè)GCR2和GPA1在酵母中的可能的相互作用。
1、PCR擴(kuò)增GCR2，GCR2IL2(C290-401)，GCR2IL(N1-289)，GCR1或GPA1GCR2擴(kuò)增產(chǎn)物是序列1的自5′端第1至1203位脫氧核苷酸序列，模板為pET28a-GCR2，引物為GCR2SUSB15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggctctccaaccaccATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’GCR2SUSB25’-TCCGCCACCACCAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTA GAGTTCATAACCTGGAAACAGAG-3’。GCR2IL2(C290-401)擴(kuò)增產(chǎn)物是序列1的自5′端第868至1203位脫氧核苷酸序列，模板為pET28a-GCR2，引物為GCR2SUSIL2B15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggctctccaaccaccATGCAGGTTTATAACACTAAGGAATTTG-3’、GCR2SUSB25’-TCCGCCACCACCAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGAGTTCATAACCTGGAAACAGAG-3’。GCR2IL(N1-289)擴(kuò)增產(chǎn)物是序列1的自5′端第1至867位脫氧核苷酸序列，模板為pET28a-GCR2，引物為GCR2SUSB15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggctctccaaccaccATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’，GCR2ILSUSB25’-TCCGCCACCACCAACCACCTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTTAGTGTTATAAACCTGAGCTGCC-3’。GCR1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是GenBank Accession Number為AT1g48270的自5′端第1至978位脫氧核苷酸的GCR1的核苷酸片段，模板為Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的蓮座葉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，引物為GCR1SUSB15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggctctccaaccaccATGTCGGCGGTTCTCACAGCCCGGC-3’GCR1SUSB25’-TCCGCCACCACCAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTGCTGGTCCTCGGTCTTGAGTG-3’。GPA1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是GenBank Accession Number為AT2G26300的自5′端第1至1152位脫氧核苷酸的GPA1的核苷酸片段，模板為pET28a-GPA1，引物為GPA1SUSB15’-GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTCCAACCACCATGGGCTTACTCTGCAGTAGA-3’GPA1SUSB25’-TCCGCCACCACCAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAAAAGGCCAGCCTCCAGTAAATTTC-3’。
2、分裂泛素系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)酵母的分裂泛素實(shí)驗(yàn)操作及相關(guān)的載體構(gòu)建參照下述文獻(xiàn)進(jìn)行Obrdlik等，2004，K+channel interactions detected by a genetic system optimized forsystematic studies of membrane protein interactions.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.12242-12247以及Pandey和Assmann 2004，The Arabidopsis putativeG-protein-coupled receptor，GCR1，interacts with the G protein α-subunit，GPA1 and regulates abscisic acid signalling.Plant Cell 16，1616-1632。GCR2，GCR2IL2(C290-401)，GCR2IL(N1-289)，GCR1或GPA1的PCR產(chǎn)物和pNXgate32-3HA(事先用EcoRI/SmaI/酶切回收)載體或者和pXNgate21-3HA(事先用EcoRI/SmaI酶切回收)載體分別共轉(zhuǎn)化到酵母DSY2(DUAL Systems Biotech)(MAT_α URA3leu2 trp1 his3 loxP∷ade2)菌株，同時(shí)和pmetYCgate(事先用HindIII/PstI酶切回收)載體分別共轉(zhuǎn)化到酵母菌DSYl(DUAL Systems Biotech)(MATa ura3 leu2lexA∷lacZ∷trpl lexA∷HIS3 lexA∷ADE2)中。轉(zhuǎn)化子在選擇培養(yǎng)基SC(DSY1在-Leu SC培養(yǎng)基(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.64g/1000ml-Leu合成氨基酸復(fù)合物)，DSY2(DUAL Systems Biotech)在-Trp SC培養(yǎng)基(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.74g/1000ml-Trp合成氨基酸復(fù)合物，20克/升瓊脂)上培養(yǎng)篩選，從陽(yáng)性菌中提出質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中擴(kuò)增，然后測(cè)序驗(yàn)證其正確性。把含有-NubG或-Nubwt的DSY1菌在-Leu SC培養(yǎng)基培養(yǎng)(如GPA1-NubG)，同時(shí)把含有-Cub的DSY2菌在-Trp SC培養(yǎng)基培養(yǎng)(如GCR2-Cub)過夜，1000g室溫離心5分鐘收集1毫升菌體，沉淀重懸于100微升YPD中，各取20微升混合后，一滴滴(約4微升一滴)滴在YPD平板上(20克/升細(xì)菌蛋白胨，10克/升酵母提取物，2％葡萄糖，20克/升瓊脂)，30度培養(yǎng)6-8小時(shí)(酵母雜交生長(zhǎng)過程)后，用滅菌濾紙影印到-Trp/-Leu/-Ura缺失培養(yǎng)基(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.74g/1000ml-Trp/-Leu/-Ura合成氨基酸復(fù)合物，20克/升瓊脂)平板上，繼續(xù)培養(yǎng)酵母菌過夜，所得酵母菌為二倍體的酵母菌(用所含質(zhì)粒代表如GPA1-NubG+GCR2-Cub)。
其中，pNXgate32-3HA、pXNgate21-3HA、pmetYCgate購(gòu)自ABRC(http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/vector_1.html)二倍體酵母菌在選擇培養(yǎng)基上做生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)同時(shí)做X-Gal顯色實(shí)驗(yàn)來鑒定蛋白-蛋白相互作用。
結(jié)果如圖3所示，當(dāng)以GCR2為誘餌檢測(cè)其與GPA1相互作用時(shí)，即圖A中左列兩個(gè)平板(I)GPA1-NubG+GCR2-Cub，(II)NubG-GPA1+GCR2-Cub酵母不能在缺失培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)有很低的LacZ活性，表明以GCR2為誘餌時(shí)不能和GPA1作用，而在圖A中右列兩個(gè)以GPA1為誘餌檢測(cè)其與GCR2作用時(shí)即圖A中(I)GCR2-NubG+GPA1-Cub，(II)NubG-GCR2+GPA1-Cub酵母能在缺失培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)有很高的LacZ活性，表明以GPA1為誘餌時(shí)能和GCR2作用，這個(gè)結(jié)果和已經(jīng)報(bào)道過的GCR1和GPA1的作用模式相同即圖A中(III)GPA1-NubG+GCR1-Cub，(IV)NubG-GPA1+GCR1-Cub；(III)GCR1-NubG+GPA1-Cub，(IV)NubG-GCR1+GPA1-Cub。同時(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照的(V)GPA1-Nubwt+GCR2-Cub，(VI)Nubwt-GPA1+GCR2-Cub；(V)GCR2-Nubwt+GPA1-Cub，(VI)Nubwt-GCR2+GPA1-Cub，及系統(tǒng)陽(yáng)性對(duì)照的(VII)NubG-KAT1+KAT1-Cub酵母能在缺失培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)有很高的LacZ活性，而系統(tǒng)陰性對(duì)照(VIII)NubG-SUC2+KAT1-Cub酵母不能在缺失培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)有很低的LacZ活性。同時(shí)圖B的實(shí)驗(yàn)表明GCR2的C-末端(C290-401)，包括C-末端和預(yù)測(cè)的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)域)為誘餌時(shí)不能檢測(cè)到與GPA1的相互作用(左列兩個(gè)平板)，但是用GPA1為誘餌可以檢測(cè)到其與GCR2 C末端片段的作用(右列兩個(gè)平板)，而C表明缺失了C端的GCR2 N端(1-289aa)卻不能與GPA1作用(左列兩個(gè)平板)，表現(xiàn)為酵母不能在缺失培養(yǎng)基上生長(zhǎng)同時(shí)有很低的LacZ活性，結(jié)果表明全長(zhǎng)的GCR2可以與GPA1相互作用，但當(dāng)GCR2的C-末端被影響后，GCR2就不能再與GPA1相互作用，進(jìn)一步觀察到GCR2的C-末端(C290-401，包括C-末端和預(yù)測(cè)的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)域)可以與GPA1相互作用(圖3)，表明對(duì)GCR2與GPA1相互作用而言，GCR2的C-末端是必需和足夠的。圖3中，D為各個(gè)平板的分區(qū)方式。A、B、C中，右列兩個(gè)平板均為以GPA1為誘餌時(shí)的檢測(cè)結(jié)果。
其中，LacZ活性測(cè)定方法YPD中過夜培養(yǎng)的酵母菌OD＝1.0左右稀釋到OD＝0.2-0.3繼續(xù)培養(yǎng)至OD＝0.5-0.8后，12000g室溫離心5分鐘收集菌體，吸取上清后，沉淀溶于150微升Z buffer(Na2HPO4·7H2O 16.1g/L，NaH2PO4·H2O 5.50g/L，KCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.246g/L，pH7.0)中，液氮和37度水浴重復(fù)3次后，加入100微升玻璃珠(Sigma公司產(chǎn)品)劇烈震蕩后，12000g 4度離心1分鐘，取10微升上清測(cè)定蛋白濃度(Bradford方法)，取另外100微升上清到新的EP管中，加入0.7毫升Z緩沖液(包含0.27％(v/v)β-mercaptoethanol)和160微升ONPG(4mg/ml溶于Z緩沖液，Sigma)，同時(shí)在一個(gè)對(duì)照反應(yīng)管中(只含有100微升Z緩沖液)中加入0.7毫升Z緩沖液(包含0.27％(v/v)β-mercaptoethanol)和160微升ONPG(4mg/ml溶于Z緩沖液，Sigma).30度水浴直到溶液變黃記錄下精確的反應(yīng)時(shí)間。然后加入0.4毫升1M Na2CO3到反應(yīng)管和對(duì)照管。14000rpm室溫離心10分鐘后吸取上清測(cè)定OD420的讀數(shù)。酶活定義為每分鐘每毫克蛋白分解1微摩爾的ONPG的量。
三、進(jìn)一步用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)來驗(yàn)證GCR2和GPA1在植物體內(nèi)的相互作用。
1、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)GCR2擴(kuò)增產(chǎn)物是序列1的自5′端第1至1203位脫氧核苷酸序列，引物上游5’-GCTCTAGAATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’、下游5’-TCCCCCGGGGAGTTCATAACCTGGAAACAGAG-3’；GCR2IL擴(kuò)增產(chǎn)物是序列1的自5′端第1至867位脫氧核苷酸序列，引物上游5’-GCTCTAGAATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’、下游5’-TCCCCCGGGGCTTAGTGTTATAAACCTGAGCTGCC-3’，模板均為pET28a-GCR2。GPA1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是GenBank Accession Number為AT2G26300的自5′端第1至1152位脫氧核苷酸的GPA1的核苷酸片段，模板為pET28a-GPA1，引物上游5’-GCTCTAGA ATGGGCTTACTCTGCAGTAGAAGTC-3’；下游5’-TCCCCCGGGGTAAAAGGCCAGCCTCCAGTA-3’。將GCR2擴(kuò)增產(chǎn)物和GCR2IL擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行XbaI和SmaI雙酶切后，分別克隆入pUC-SPYCE的XbaI和SmaI位點(diǎn)間，得到經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定含有GCR2的重組載體pUC-GCR2-YFPC，經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定含有GCR2IL的重組載體pUC-GCR2IL-YFPC。
將GPA1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行XbaI和SmaI雙酶切后，克隆入pUC-SPYNE的XbaI和SmaI位點(diǎn)間，得到經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定含有GPA1的重組載體命名為pUC-GPA1-YFPN。
pUC-SPYNE和pUC-SPYCE來源于pUC19(Promega)和pBIN121(CLONTECH)。pBIN121經(jīng)過HindIII和EcoRI酶切后，回收片段35S-GUS-Nos連接到pUC19 HindIII和EcoRI間，得到重組載體pUC35S-GUS-Nos。同時(shí)以pLP-EYFP-C1(Clontech)為模板，用上游引物5’-CCCGGGATGGAGCAAAAGTTGATTTCTGAGGAGGATCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’(含c-myc標(biāo)簽序列)和下游引物5’-CGAGCTCTTAGGCCATGATATAGACGTTGTG-3’擴(kuò)增c-myc-YFPN(1-155aa)片段；以pLP-EYFP-C1(Clontech)為模板，用上游引物5’-CCCGGGATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTG-3’(含HA標(biāo)簽序列)和下游引物5’-GAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3’擴(kuò)增HA-YFPC(156-239aa)，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確后分別連入pUC35S-GUS-Nos的SmaI和SacI位點(diǎn)間代替GUS片段，得到含有c-myc-YFPN的重組載體pUC-SPYNE，含有HA-YFPC的重組載體pUC-SPYCE。
用上游5’-CCGCTCGAGATGCCGGAGTTTGTACCGGAAG-3’；下游GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG引物，以pUC-GCR2-YFPC，和pUC-GCR2IL-YFPC為模板擴(kuò)增下來GCR2-YFPC和GCR2IL-YFPC片段，回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的克隆用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI切下外源片段再將其克隆入pBI101的XhoI和SpeI位點(diǎn)間，重組載體分別為pTA-GCR2-YFPC和pTA-GCR2IL-YFPC。
20到30μg的pUC-GPA1-YFPN和下述兩種質(zhì)粒中的任意一種按照Asai等2002，MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity.Nature 415，977-983文獻(xiàn)操作被共轉(zhuǎn)化到Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥原生質(zhì)體中pTA-GCR2-YFPC和pTA-GCR2IL-YFPC。加入30μM Dex后在22℃連續(xù)光照培養(yǎng)24h。激光共聚焦顯微鏡(LSM 510 Meta，Zeiss)下觀察YFP熒光信號(hào)。雙分子熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4中A所示，其中YFP蛋白分子分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中沒有分布的特異性，而GPA1-YFPN/GCR2-YFPC共轉(zhuǎn)的原生質(zhì)體細(xì)胞膜上有重組的YFP分子發(fā)出的特異熒光，而GPA1-YFPN/GCR2IL-YFPC共轉(zhuǎn)的原生質(zhì)體沒有發(fā)現(xiàn)YFP特異熒光，表明GCR2和GPA1可以在植物體內(nèi)相互作用，它們相互作用發(fā)生在質(zhì)膜上而且GCR2的C-末端對(duì)它們體內(nèi)相互作用是必需的。圖4中A的GPA1-YFPN/GCR2-YFPC表示共轉(zhuǎn)化pUC-GPA1-YFPN和pTA-GCR2-YFPC的原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GPA1-YFPN/GCR2IL-YFPC表示共轉(zhuǎn)化pUC-GPA1-YFPN和pTA-GCR2IL-YFPC的原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，YFP表示激光共聚焦下YFP特異熒光照片，明視野表示透射光下原生質(zhì)體照片，拼合表示疊加的熒光和透射光照片。
2、蛋白表達(dá)檢測(cè)用于蛋白檢測(cè)的材料來源于上面提到的GPA1-YFPN/GCR2-YFPC共轉(zhuǎn)化及GPA1-YFPN/GCR2IL-YFPC共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體經(jīng)過室溫100g離心2分鐘后收集材料，吸去上清后沉淀加入等體積的2倍SDS電泳上樣緩沖液，95度煮樣10分鐘后，冰浴5分鐘，最后跑12％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后分別用α-c-myc、α-HA抗體(Santa Cruz)檢測(cè)蛋白信號(hào)。蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖4中B所示，在GPA1-YFPN/GCR2-YFPC共轉(zhuǎn)化及GPA1-YFPN/GCR2IL-YFPC共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中均能用α-c-myc、α-HA檢測(cè)到特異蛋白條帶，表明GCR2和GPA1可以在植物體內(nèi)相互作用，它們相互作用發(fā)生在質(zhì)膜上，而且GCR2的C-末端對(duì)它們體內(nèi)相互作用是必需的。圖4中B的α-c-myc表示c-myc單克隆抗體，α-HA表示HA單克隆抗體，GPA1-YFPNGCR2-YFPC表示共轉(zhuǎn)化pUC-GPA1-YFPN和pTA-GCR2-YFPC的原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GPA1-YFPNGCR2IL-YFPC表示共轉(zhuǎn)化pUC-GPA1-YFPN和pTA-GCR2IL-YFPC的原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
其中，Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥原生質(zhì)體按照下述文獻(xiàn)中描述的方法制備Asai，T.等2002，MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innateimmunity.Nature 415，977-983。
3、植物體內(nèi)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)以pET28a-GCR2質(zhì)粒為模板，上游引物5’-cctcgagatgccggagtttgtaccggaagatttata-3’下游5’-gactagtttactcgactttatcgtcatcgtctttgtagtccatgagttcataacctggaaacagag-3’(帶一個(gè)FLAG標(biāo)簽)，擴(kuò)增GCR2后，片段回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的克隆用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI切下外源片段再將其克隆入pBI101的XhoI和SpeI位點(diǎn)間，得到的重組載體為pTA-GCR2-FLAG。
pTA-GCR2-FLAG通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dipasimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998，166，735-743)利用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥，對(duì)得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株用潮霉素(Hygromycin B，購(gòu)自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pTA-GCR2-FLAGT0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定上游引物5’-cctcgagatgccggagtttgtaccggaagatttata-3’下游5’-gactagtttactcgactttatcgtcatcgtctttgtagtccatgagttcataacctggaaacagag-3’得到1240bp的GCR2-FLAG片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pTA-GCR2-FLAG T0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。
平板上培養(yǎng)了14天的轉(zhuǎn)pTA-GCR2-FLAG T1代幼苗及野生型Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到液體MS培養(yǎng)基上(1×MS，1％蔗糖，pH5.8)22℃搖培36小時(shí)同時(shí)加入或不加入Dex(Sigma，30μM)誘導(dǎo)GCR2表達(dá)。樣品在液氮里研磨充分后轉(zhuǎn)移到4℃預(yù)冷研缽里在3倍體積的IP緩沖液(50mM Na3PO4pH7.5，200mMNaCl，10％甘油，0.1％ NP40，10mM NaF，2.5mM glycerolphosphate，1mMNa3VO4，0.5mM DTT，1mM PMSF，1×植物蛋白酶抑制劑cocktail)(該IP緩沖液購(gòu)自Roche公司)充分研磨。樣品轉(zhuǎn)移到EP管后15,000g 4℃離心15分鐘。上清液中加入40微升ANTI-FLAGM2 Affinity Gel(Sigma)4℃孵育4個(gè)小時(shí)。6000g 4℃離心2分鐘收集免疫沉淀復(fù)合體，沉淀用4.5毫升IP緩沖液洗三次后在SDS上樣緩沖液中煮樣10分鐘進(jìn)行8％SDS-PAGE電泳分離蛋白。用FLAG抗體(FLAG抗體購(gòu)自Sigma公司)和GPA1抗體(自制兔源多克隆抗體)檢測(cè)蛋白信號(hào)。
結(jié)果如圖4中C所示，野生型材料在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的情況下均沒有FLAG和GPA1特異信號(hào)出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)基因材料在誘導(dǎo)的情況下能夠得到FLAG(即GCR2)及GPA1的特異信號(hào)而在非誘導(dǎo)條件下沒有，表明GCR2和GPA1可以在植物體內(nèi)相互作用，且形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體，圖4中C的“+”表示加了Dex，“-”表示沒有加Dex，α-GPA1表示GPA1的抗體，α-FLAG表示FLAG的抗體，非特異性結(jié)合表示用FLAG抗體檢測(cè)時(shí)由于抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的非特異信號(hào)。
實(shí)施例4、GCR2參與ABA的調(diào)控過程一、Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥gcr2突變體的鑒定為了研究GCR2的生物學(xué)功能，鑒定了三個(gè)GCR2基因被敲除的Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3。gcr2-1、gcr2-2和gcr2-3種子來自Arabidopsis Biological Resource Center，分別為SALK_041449、SALK_073069和SALK_134030。
分別以gcr2-1、gcr2-2和gcr2-3的基因組DNA為模板，利用GCR2上游引物5’-GTGTTTGCTGCTGGTGCTTCCTTTG-3’、下游引物5’-GTTCACTGGTGTCACGGTGCTCCT-3’；T-DNA左臂特異引物5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACTC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定gcr2三個(gè)等位基因突變體T-DNA的插入位點(diǎn)。其中上下游引物擴(kuò)增的為野生型GCR2基因組序列，上游引物和T-DNA左臂特異引物擴(kuò)增的為T-DNA左臂和GCR2上特異序列。結(jié)果表明gcr2-1、gcr2-2和gcr2-3中只有一個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)。gcr2-1的T-DNA插入位點(diǎn)是自序列3的5′端第1470-1489位脫氧核糖核苷酸，gcr2-2的T-DNA插入位點(diǎn)是自序列3的5′端第1289-1339位脫氧核糖核苷酸，gcr2-3的T-DNA插入位點(diǎn)是自序列3的5′端第1361-1369位脫氧核糖核苷酸。
分別以gcr2-1、gcr2-2和gcr2-3的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，用上游引物p15’-ATGCCGGAGTTTGTACCGG-3’和下游引物p25’-TTAGAGTTCATAACCTGGAAACAGAGC-3’進(jìn)行PCR，檢測(cè)GCR2全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(自序列1的5′末端第1位到1206位的脫氧核糖核苷酸)；用上游引物p1
5’-ATGCCGGAGTTTGTACCGG-3’和下游引物p35’-CCCTCGGAAACGGGCTAAGTAACG-3’進(jìn)行PCR，檢測(cè)GCR2部分轉(zhuǎn)錄本(自序列1的5′末端第1位到435位的脫氧核糖核苷酸)。轉(zhuǎn)錄水平分析證實(shí)這三個(gè)突變體都沒有GCR2全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，但都有部分轉(zhuǎn)錄本存在(圖5)。圖5中，AGCR2基因結(jié)構(gòu)模式圖；B野生型和gcr2突變體基因表達(dá)檢測(cè)；Cgcr2三個(gè)等位基因突變體T-DNA插入位點(diǎn)模式圖。
二、GCR2參與ABA的調(diào)控的過程1、GCR2超表達(dá)植株的獲得全長(zhǎng)的GCR2 cDNA(自序列1的5′端第1位至1206位脫氧核糖核苷酸)通過RT-PCR用特異引物(上游5’-cctcgagatgccggagtttgtaccggaagatttata-3’；下游5’-gactagtttactcgactttatcgtcatcgtctttgtagtccatgagttcataacctggaaacagag-3’，引物中帶有一個(gè)FLAG標(biāo)簽序列)從Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥蓮座葉mRNA中獲得，并經(jīng)過測(cè)序鑒定正確，最后用XhoI和SpeI雙酶切后，克隆入pBI101質(zhì)粒的XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)，得到含有全長(zhǎng)的GCR2 cDNA(自序列1的5′端第1位至1206位脫氧核糖核苷酸)的重組載體pTA-GCR2-FLAG。
以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的基因組DNA為模板，利用引物上游5’-ACGCGTCGACACAGAAACAGAACTCAGATATAG-3’和下游引物5’-GCTCTAGACTCATTTCGGAAAAACCGTTCTCCC-3’擴(kuò)增從GCR2起始密碼子開始向上一段長(zhǎng)度為1223bp的基因組序列作為GCR2啟動(dòng)子，并經(jīng)過測(cè)序鑒定正確，用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI雙酶切后，克隆入pBIN121(CLONTECH)的SalI和XbaI酶切位點(diǎn)間，得到含有GCR2啟動(dòng)子的重組載體pBIN-GCR2p-GUS。用SalI和EcoRI從pBIN-GCR2p-GUS上切下GCR2啟動(dòng)子-GUS-NOS片段，克隆入pCAMBIA1300(CAMBIA)的SalI和EcoRI酶切位點(diǎn)間，得到重組載體pCAMBIA-GCR2p-GUS。
pTA-GCR2-FLAG通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dipasimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998，166，735-743)利用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥，對(duì)得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株用潮霉素(Hygromycin B，購(gòu)自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pTA-GCR2-FLAGT0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定上游引物5’-cctcgagatgccggagtttgtaccggaagatttata-3’下游5’-gactagtttactcgactttatcgtcatcgtctttgtagtccatgagttcataacctggaaacagag-3’，得到1240bp的GCR2-FLAG片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pTA-GCR2-FLAG T0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。
收獲T1代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T2代)，進(jìn)行種植，單株收取種子后鋪潮霉素抗性平板篩選，全部為抗性苗的單株為純合轉(zhuǎn)基因植株(T3代GCR2過表達(dá)植株)。將該T3代植株種子進(jìn)行下述種子休眠、種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)。
2、種子休眠、種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)用于種子休眠實(shí)驗(yàn)的種子來自野生型Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(WT)；Columbia(Co1-0)生態(tài)型擬南芥突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3；和T3代GCR2過表達(dá)植株(GCR20E)主苔上完全脫水成熟的長(zhǎng)角果向上第三和第四個(gè)種莢。種子收集后立刻經(jīng)過消毒處理鋪到平皿里事先浸濕水的濾紙上。在人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天(22℃，完全光照150μmol m-2s-1)后，觀察種子萌發(fā)同時(shí)拍照。種子的萌發(fā)定義為有可見的胚根伸出種皮。對(duì)于種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，相同條件培養(yǎng)同時(shí)收集的不同基因型的種子經(jīng)過消毒后鋪在濾紙上，下面為0.8％瓊脂(Sigma)包含1/2MS(Sigma，pH5.8)和10g/1000ml蔗糖同時(shí)添加不同濃度的±ABA(Sigma)，4℃暗中低溫處理48小時(shí)后，22℃下光照培養(yǎng)三天(150μmol m-2s-1)，種子萌發(fā)率按照上面標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)。
幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)野生型以及gcr2突變體，GCR2超表達(dá)的種子經(jīng)過表面消毒后鋪在MS平板上包含1×MS(Sigma，pH5.8)，30μM Dex(Sigma)，10g/1000ml蔗糖和0.3％瓊脂(Sigma)添加或不添加0.3μM±ABA(Sigma)，4℃暗中低溫處理48小時(shí)后。22℃連續(xù)光照下培養(yǎng)10天(150μmol m-2s-1)，幼苗表型用數(shù)碼相機(jī)拍照。
植物的種子在母體內(nèi)形成以后有一個(gè)休眠過程，從而防止種子在母體上萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新鮮成熟的野生型擬南芥植株(WT)中得到的種子直接種到培養(yǎng)基上種子不能萌發(fā)，而從GCR2的三個(gè)等位基因突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3上得到的相同發(fā)育時(shí)期的種子都可以萌發(fā)(圖6中A)，說明gcr2突變體種子休眠過程喪失。種子休眠過程主要是由植物激素ABA控制的，暗示gcr2突變體可能導(dǎo)致ABA信號(hào)途徑障礙，并降低了植物對(duì)ABA的敏感性。為了進(jìn)一步證實(shí)上述假設(shè)，本發(fā)明檢測(cè)了gcr2突變體對(duì)ABA控制的其它過程(種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、氣孔開度及葉片失水)的反應(yīng)。
種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型植物相比，gcr2突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3對(duì)ABA抑制的種子萌發(fā)不敏感，但GCR2超表達(dá)植株(GCR20E)對(duì)ABA抑制的種子萌發(fā)超敏感(圖6中B)，幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明gcr2突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3對(duì)ABA抑制的幼苗發(fā)育不敏感，而其超表達(dá)植株(GCR20E)對(duì)ABA控制的幼苗發(fā)育超敏感(圖6中C)。
3、GCR2突變體中ABA調(diào)控基因表達(dá)變化ABA調(diào)節(jié)植物發(fā)育是通過其調(diào)控一些基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，為此比較一些典型的受ABA調(diào)控的基因在野生型和gcr2突變體的表達(dá)情況。選取三種已知的ABA調(diào)控的基因啟動(dòng)子，包括RD29A，KIN1，和ABI5啟動(dòng)子，進(jìn)行表達(dá)模式檢測(cè)。
分別以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的基因組DNA為模板，利用如下引物PCR擴(kuò)增1526bp RD29A啟動(dòng)子上游5’-ctgcagttttgcttttgaatgtttgtgtttttgtat-3’，下游5’-tctagaattttccaaagatttttttctttccaatag-3’；利用如下引物PCR擴(kuò)增2184bpKIN1啟動(dòng)子上游5’-ctgcagtcaagtttttaattttcgttttcttgaataat-3’，下游5’-tctagatttttcagatatttatttcttgtaaaatcgtt-3’；利用如下引物PCR擴(kuò)增3034bp ABI5啟動(dòng)子5’-ctgcagttaaggttggctggagtaacgc-3’，下游5’-ggatccaccacctcctccattatgtctcg-3’。將RD29A啟動(dòng)子、KIN1啟動(dòng)子、ABI5啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序正確后，分別用限制性內(nèi)切酶PstI和XbaI雙酶切后，克隆入pCAMBIA-GCR2p-GUS的PstI和XbaI酶切位點(diǎn)間，得到含有RD29A啟動(dòng)子的重組載體pCAMBIA-RD29Ap-GUS，含有KIN1啟動(dòng)子的重組載體pCAMBIA-KIN1p-GUS，含有ABI5啟動(dòng)子的重組載體pCAMBIA-ABI5p-GUS。
pCAMBIA-RD29Ap-GUS、pCAMB IA-KIN1p-GUS和pCAMB IA-ABI5p-GUS分別通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，166，735-743)利用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥，對(duì)得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株用潮霉素(Hygromycin B，購(gòu)自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的陽(yáng)性T0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定所用引物分別為上游5’-ATGGTCCGTCCTGTAGAAACCCCAACCCG-3’，下游5’-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGG-3’得到1811bp的GUS基因片段的分別為轉(zhuǎn)pCAMBIA-RD29Ap-GUS、pCAMBIA-KIN1p-GUS和pCAMBIA-ABI5p-GUS的轉(zhuǎn)基因植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗，按照上述方法進(jìn)行PCR鑒定，收獲T1代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T2代)，進(jìn)行種植。將PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-RD29Ap-GUS T2代植株與gcr2突變體gcr2-2進(jìn)行雜交、將PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-KIN1p-GUS T2代植株與gcr2突變體gcr2-2進(jìn)行雜交、將PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-ABI5p-GUS T2代植株與gcr2突變體gcr2-2進(jìn)行雜交，分別收獲啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性植株所結(jié)種子的種子(F1代)，進(jìn)行種植，收獲F1代啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(F2代)，進(jìn)行種植，對(duì)得到的啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性的F2代幼苗和Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥進(jìn)行GUS基因定性和定量檢測(cè)。
其中，GUS定性檢測(cè)中所用緩沖液X-Gluc母液100mg X-Gluc溶于5ml DMF；X-Gluc基液50mM PBS pH7.0(NaH2PO450mM即0.78g/100ml，Na2HPO450mM即1.791g/100ml)溶解EDTA·2Na(10mM即372mg)，TritonX-100(0.1％，100μl)，鐵氫化鉀(0.5mM，16.5mg，)，亞鐵氫化鉀(0.5mM，21.1mg)定容至100ml。
X-Gluc使用液50ul母液+950μl基液。選取合適大小的轉(zhuǎn)基因抗性篩選苗浸入X-Gluc使用液中37℃染色1-48小時(shí)直到染出理想效果；吸去反應(yīng)液，70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％乙醇梯度脫色。顯微鏡觀察照相。
GUS定量檢測(cè)方法如下2周齡的擬南芥幼苗在液氮中充分研磨后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的研缽中加入GUS檢測(cè)緩沖液(50mM NaPO4，pH7.0，5mM DTT，1mM EDTA，0.1％ Triton X-100)后繼續(xù)研磨充分。4度12000g離心20分鐘。蛋白濃度用Bradford法精確定量。20微升的上清液加入到100微升MUG(Sigma，MUG溶于GUS檢測(cè)緩沖液，濃度為5mM)后與380微升GUS檢測(cè)緩沖液混合，37度孵育20分鐘后加入500微升終止反應(yīng)緩沖液(0.2M Na2CO3，pH9.5)。在激發(fā)波長(zhǎng)365納米和發(fā)射波長(zhǎng)455納米條件下檢測(cè)產(chǎn)物MU熒光值。制作4-MU(Sigma，10mM母液)標(biāo)準(zhǔn)曲線(100nM，250nM，500nM，及1μM)。GUS活性定義為nmolesMU min-1mg-1protein。
結(jié)果如圖7所示，A中GUS定性檢測(cè)的結(jié)果為在野生型背景下的轉(zhuǎn)基因植株中GUS的活性要高于突變體背景下GUS的活性，同時(shí)B中GUS定量分析的結(jié)果也有相同的結(jié)果。表明與野生型植株相比，這三個(gè)基因在GCR2突變體中的表達(dá)水平被顯著抑制(圖7)，表明GCR2突變也影響了受ABA調(diào)控基因的表達(dá)。圖7中A為基因表達(dá)染色結(jié)果；B為Gus表達(dá)活性測(cè)定；A和B中的野生型分別表示PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-RD29Ap-GUS T2代植株、PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-ABI5p GUS T2代植株或PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-KIN1p-GUS T2代植株；gcr2-2分別表示PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-RD29Ap-GUS T2代植株與gcr2-2進(jìn)行雜交得到的啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性的F2代幼苗，PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-ABI5p-GUS T2代植株與gcr2-2進(jìn)行雜交得到的啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性的F2代幼苗或PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAMBIA-KIN1p-GUS T2代植株與gcr2-2進(jìn)行雜交得到的啟動(dòng)子PCR鑒定陽(yáng)性的F2代幼苗。
4、氣孔開度及葉片失水實(shí)驗(yàn)植物的氣孔是植物與外界環(huán)境進(jìn)行水分和氣體交換的門戶。在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，植物通過氣孔交換水分和氣體，從而保證植物體內(nèi)的水分狀態(tài)平衡并進(jìn)行正常的光合作用。在逆境條件下，植物為了防止水分過度散失而關(guān)閉氣孔。目前已知調(diào)控氣孔開閉的主要激素是ABA，由ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和ABA抑制的氣孔開放是ABA的經(jīng)典反應(yīng)。下面通過氣孔開度及葉片失水實(shí)驗(yàn)來研究GCR2與ABA的關(guān)系。
對(duì)于ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)，5周左右下述植株的蓮座葉置于KCl-MES緩沖液中(50mM KCl，10mM MES，pH6.12)光下(250μmol m-2s-1)處理90分鐘以使氣孔打開Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(WT)，Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥突變體gcr2-1、gcr2-2、gcr2-3，GCR2過表達(dá)植株(GCR20E)。從葉片上撕下表皮條鏡檢氣孔開度，正常的置于KCl-CaCl2MES緩沖液中(50mM KCl，1mM CaCl2，10mM MES，pH6.12，25μM±ABA(Sigma)檢測(cè)其ABA敏感性，同時(shí)來自同一片葉子的表皮條置于同樣的反應(yīng)緩沖液(無ABA)中作為對(duì)照。光下(250μmol m-2s-1)反應(yīng)2個(gè)小時(shí)后氣孔的開度在顯微鏡下測(cè)量統(tǒng)計(jì)；對(duì)于ABA抑制的氣孔打開實(shí)驗(yàn)，5周左右下述植株的蓮座葉置于KCl-MES緩沖液中(50mM KCl，10mM MES，pH6.12)，暗中處理2個(gè)小時(shí)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(WT(Col-0))，Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥突變體gcr2-1、gcr2-2、gcr2-3，(WT(WS)表示W(wǎng)assilewskija生態(tài)型擬南芥，ABRC)，gap1-2(gap1突變體，ABRC)。隨后把葉片轉(zhuǎn)移到KCl-CaCl2MES緩沖液中(50mM KCl，1mM CaCl2，10mM MES，pH6.12)添加或不添加(作為對(duì)照)25μM±ABA(Sigma)，光下繼續(xù)處理2個(gè)小時(shí)，撕下葉子的表皮條后顯微鏡下測(cè)量統(tǒng)計(jì)氣孔的開度。對(duì)于葉片失水實(shí)驗(yàn)，剪取相同培養(yǎng)條件相同生長(zhǎng)時(shí)期的不同基因型植株的5-6片葉子，立刻放在干燥的培養(yǎng)皿上稱重后，置于培養(yǎng)箱中，每隔30分鐘稱重一次。葉片的失水定義為不同時(shí)間點(diǎn)失水占鮮重的百分比。
結(jié)果表明在外源ABA的處理下(模擬逆境條件)，野生型植物的氣孔很快關(guān)閉，而gcr2突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3的氣孔卻照常開放(圖6中D)。同時(shí)表明gcr2突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3的氣孔對(duì)ABA抑制的氣孔開放也不敏感(圖6中E)。ABA調(diào)控氣孔開放是通過調(diào)控植物氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的K+通道活性實(shí)現(xiàn)的，為此，用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)了野生型和gcr2突變體的保衛(wèi)細(xì)胞中的K+通道的活性，發(fā)現(xiàn)外源ABA可以抑制野生型植物的保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流的K+通道的活性，但gcr2突變體gcr2-1，gcr2-2，gcr2-3保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流K+通道活性卻對(duì)外源ABA處理沒有反應(yīng)(圖6中F)，表明GCR2參與調(diào)控由ABA控制的內(nèi)流K+通道的活性。結(jié)果還表明與野生型植株氣孔反應(yīng)相比，GCR2超表達(dá)植株氣孔關(guān)閉對(duì)ABA超敏感(圖6中G)，作為氣孔關(guān)閉的反應(yīng)，gcr2突變體gcr2-1、gcr2-2、gcr2-3葉片失水速率較野生型植株葉片要快，而GCR2超表達(dá)植株(圖8中以“GCR2超表達(dá)”表示)葉片失水速率比野生型葉片要慢(圖8)。綜合上述結(jié)果，表明GCR2參與調(diào)控了所有ABA的重要反應(yīng)。
圖6中，A為種子休眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C為幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D為氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)結(jié)果；E為氣孔開放實(shí)驗(yàn)結(jié)果；F為內(nèi)流K+通道實(shí)驗(yàn)結(jié)果；G為超表達(dá)GCR2導(dǎo)致氣孔對(duì)ABA的超敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5、GCR2和GPA1共同作用調(diào)控ABA反應(yīng)上述研究結(jié)果表明GCR2的突變體導(dǎo)致ABA反應(yīng)缺失。GPA1的突變體也會(huì)導(dǎo)致一些ABA反映的缺失(Wang，X-Q.，Ullah，H.，Jones，A.M.& Assmann，S.M.G proteinregulation of ion channels and abscisic acid signalling in Arabidopsis guardcells.Science 292，2070-2072(2001))，表明二者可能共同作用傳遞ABA信號(hào)。下面進(jìn)行GCR2和GPA1表達(dá)模式實(shí)驗(yàn)；(1)植株的獲得以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的基因組DNA為模板，利用引物上游5’-ACGCGTCGACACAGAAACAGAACTCAGATATAG-3’和下游5’-GCTCTAGACTCATTTCGGAAAAACCGTTCTCCC-3’擴(kuò)增從GCR2起始密碼子開始向上一段長(zhǎng)度為1223bp的基因組序列作為GCR2啟動(dòng)子，并經(jīng)過測(cè)序鑒定正確，用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI雙酶切后，克隆入pBIN121(CLONTECH)的SalI和XbaI酶切位點(diǎn)間，得到含有GCR2啟動(dòng)子的重組載體pBIN-GCR2p-GUS。用SalI和EcoRI從pBIN-GCR2p-GUS上切下GCR2啟動(dòng)子-GUS-NOS片段，克隆入pCAMBIA1300(CAMBIA)的SalI和EcoRI酶切位點(diǎn)間，得到重組載體pCAMBIA-GCR2p-GUS。以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥的基因組DNA為模板，利用引物上游5’-AACTGCAGATGTGATGTTTTTGTAGGTTGAAG-3’和下游5’-CGGGATCCGATTGTTTCTATATCCCCACAGG-3’擴(kuò)增從GPA1起始密碼子開始向上一段長(zhǎng)度為1353bp的GPA1的啟動(dòng)子并經(jīng)過測(cè)序鑒定正確，用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI克隆入pCAMBIA-GCR2p-GUS載體上替換下GCR2啟動(dòng)子，所得質(zhì)粒為pCAMBIA-GPA1p-GUS。
以pET28a-GPA1為模板，用上游引物5’-CCGCTCGAGATGGGCTTACTCTGCAGTAGAAGTCG-3’和下游引物5’-GACTAGTTCATAAAAGGCCAGCCTCCAG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR片段回收并克隆到pGEM-T(Promega)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的克隆用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI切下外源片段再將其克隆入pBI101的XhoI和SpeI位點(diǎn)間，得到含有GPA1的重組載體命名為pTA-wGαOE。
pCAMBIA-GCR2p-GUS、pCAMBIA-GPA1p-GUS或pTA-wGαOE通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，166，735-743)利用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥，對(duì)得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株用潮霉素(Hygromycin B，購(gòu)自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pTA-wGαOE T0代植株按照如下方法進(jìn)行PCR鑒定上游引物5’-CCGCTCGAGATGGGCTTACTCTGCAGTAGAAGTCG-3’和下游引物5’-GACTAGTTCATAAAAGGCCAGCCTCCAG-3’，PCR得到1152bp的GPA1片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pTA-wGαOET0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。收獲T1代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T2代)，進(jìn)行種植，單株收取種子后鋪潮霉素抗性平板篩選，全部為抗性苗的單株為純合轉(zhuǎn)基因植株(T3代)，該T3代植株為wGαOE植株。
對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pCAMBIA-GCR2p-GUS T0代植株利用上游引物5’-ACGCGTCGACACAGAAACAGAACTCAGATATAG-3’和下游引物5’-GCTCTAGACTCATTTCGGAAAAACCGTTCTCCC-3’行PCR鑒定，PCR得到1223bp的GCR2啟動(dòng)子片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pCAMBIA-GCR2p-GUS T0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。收獲T1代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T2代)，進(jìn)行種植，單株收取種子后鋪潮霉素抗性平板篩選，全部為抗性苗的單株為純合轉(zhuǎn)基因植株(T3代)，該T3代植株為轉(zhuǎn)pCAMBIA-GCR2p-GUS純合植株。對(duì)該轉(zhuǎn)pCAMBIA-GCR2p-GUS純合植株進(jìn)行GUS染色檢測(cè)。
對(duì)經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pCAMBIA-GPA1p-GUS T0代植株利用上游引物5’-AACTGCAGATGTGATGTTTTTGTAGGTTGAAG-3’和下游引物5’-CGGGATCCGATTGTTTCTATATCCCCACAGG-3’進(jìn)行PCR鑒定，PCR得到1353bp的GPA1啟動(dòng)子片段的植株為PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)pCAMBIA-GPA1p-GUST0代植株。收獲上述T0代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T1代)進(jìn)行種植，得到T1代幼苗。收獲T1代PCR陽(yáng)性植株的所結(jié)種子(T2代)，進(jìn)行種植，單株收取種子后鋪潮霉素抗性平板篩選，全部為抗性苗的單株為純合轉(zhuǎn)基因植株(T3代)，該T3代植株為轉(zhuǎn)pCAMBIA-GPA1p-GUS純合植株。對(duì)該轉(zhuǎn)pCAMBIA-GPA1p-GUS純合植株進(jìn)行GUS染色檢測(cè)。
將gcr2-1植株(父本)與gpa1-2(突變體，ABRC)植株(母本)進(jìn)行雜交得到的F1代為gcr2和gpa1的雙重突變體gcr2-1/gpa1-2。
將gpa1-2植株(母本)與GCR20E植株(父本)進(jìn)行雜交得到的F1代為GCR20E/gpa1-2植株。
將gcr2-1植株(母本)與wGαOE植株(父本)進(jìn)行雜交得到的F1代為wGαOE/gcr2-1植株。
圖A中轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)pCAMBIA-GCR2p-GUS純合植株)的GUS染色表明GCR2在剛剛萌發(fā)的種子，幼苗期的蓮座葉，以及氣孔細(xì)胞中都有表達(dá)，圖B中轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)pCAMBIA-GPA1p-GUS純合植株)的GUS染色表明GPA1在剛剛萌發(fā)的種子，幼苗期的蓮座葉，以及氣孔細(xì)胞中也都有表達(dá)，表明GCR2和GPA1有相同的表達(dá)模式(圖9中A和B)，進(jìn)而用氣孔關(guān)閉做為指標(biāo)觀察二者在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互關(guān)系。其中，氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)按照上述方法進(jìn)行。結(jié)果表明gcr2和gpa1的雙重突變體(gcr2-1/gpa1-2)對(duì)ABA的反應(yīng)與它們各自的單突變體(gcr2-1、gpa1-2)相似，超表達(dá)GCR2(GCR20E)或GPA1(wGαOE)能使植物對(duì)ABA信號(hào)超敏感，但GCR2的這種作用依賴于GPA1的存在，GPA1的作用也依賴于GCR2的存在(圖9中C和D)，表明是GCR2和GPA1共同作用傳遞ABA信號(hào)。
圖9中，A為GCR2的表達(dá)模式結(jié)果，B為GPA1的表達(dá)模式結(jié)果；C和D為氣孔關(guān)閉反應(yīng)的結(jié)果。
6、GCR2是ABA的質(zhì)膜受體上述結(jié)果表明GCR2參與調(diào)控所有ABA反應(yīng)，而且GCR2本身是一種膜受體，暗示GCR2可能就是ABA的受體。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，本發(fā)明首先檢測(cè)純化的GCR2重組蛋白是否可以結(jié)合ABA。具體方法如下純化的His6-GCR2按照實(shí)施例1中的方法制備、純化的His6-GPA1按照實(shí)施例3中的方法制備。
FCA按照如下方法制備以Columbia(Col-0)生態(tài)型擬南芥(ABRC)的蓮座葉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，用上游引物5’-CGGGATCCATGCAACATCCTCCTTCTGAGCTAGC-3’和下游引物5’-CCGCTCGAGTCAAGCTTTATTCTTCCACATGAG-3’PCR擴(kuò)增FCA的自氨基末端第500至747位氨基酸殘基的編碼序列，將得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI克隆到pGEX-6P-1(GE Healthcare)載體的BamHI和XhoI位點(diǎn)間，得到重組載體pGEX-FCA。將pGEX-FCA轉(zhuǎn)化BL21(Novagen)，挑選氨芐青霉素(Amp)抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，在含有Amp液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定。陽(yáng)性克隆液體搖培過夜，1∶50擴(kuò)培到1L含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)搖培1.5-2個(gè)小時(shí)到OD600＝0.6后加入IPTG至終濃度0.8mM，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)后，12000g，4度離心30分鐘收集菌體。蛋白純化用Glutathione Sepharose 4B(Amersham)按照說明書操作完成。GST標(biāo)簽用PreScission Protease(Pharmacia)酶切去除。
變性的GCR2通過把GCR2蛋白95度加熱10分鐘冰浴10分鐘獲得。
用于ABA結(jié)合實(shí)驗(yàn)的GCR2蛋白的表達(dá)、純化及ABA體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)參照Razem等，2004，Purification and characterization of a barley aleurone abscisicacid-binding protein.J.Biol.Chem.279，9922-9929和Zhang等，2002，Purification and identification of a 42-kilodalton abscisicacid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves.PlantPhysiol.128，714-725文獻(xiàn)進(jìn)行。步驟稍作修改His6-GCR2、His6-GPA1蛋白洗脫下來后，立刻用HiTrap脫鹽柱(Amersham)把洗脫緩沖液轉(zhuǎn)換成結(jié)合緩沖液(25mMTris-HCl緩沖液，pH7.3，250mM蔗糖，5mM MgCl2，1mM CaCl2)。50納克的純化蛋白按照Zhang等，2002，Purification and identification of a42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broadbean leaves.Plant Physiol.128，714-725文獻(xiàn)中DCC(Dextran T70-活性炭，Sigma)方法進(jìn)行ABA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)合緩沖液為25mM Tris-HCl緩沖液，pH7.3，250mM蔗糖，5mM MgCl2，1mM CaCl2，50nM3H-(±)ABA(Amersham，40Ci/mmol)。游離的ABA通過加入100μl的0.5g/100ml DCC冰浴10分鐘后4度下2000g離心5分鐘去除。上清液轉(zhuǎn)移到液閃管中加入2毫升液閃液在MicroBeta TriLux液體閃爍計(jì)數(shù)儀(PerKin Elmer)上檢測(cè)放射性活性，數(shù)據(jù)通過SigmaPlot 2000和DynaFit統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)以50納克的牛血清白蛋白BSA、50納克變性的GCR2和50納克FCA進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。
對(duì)于特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，包含50ng His6-GCR2的結(jié)合緩沖液中(100μl)中加入50nM3H-(+)ABA或其他四種ABA類似物((±)ABA，(+)ABA和(-)ABA來自Sigma，trans-ABA來自A.G.Scientific)濃度為50nM的1到1000倍[3H]-ABA。結(jié)合條件按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。
結(jié)果表明GCR2確實(shí)可以結(jié)合ABA，但變性的GCR2以及GPA1和BSA都不能結(jié)合ABA(圖10中A)。GCR2與ABA的結(jié)合是特異性的，因?yàn)锳BA的無生理活性的結(jié)構(gòu)同系物((-)ABA，trans-ABA)不能與GCR2結(jié)合(圖10中B)。ABA與GCR2的結(jié)合具有飽和性(圖10中C)，二者結(jié)合的解離常數(shù)為20.1nM，每一個(gè)GCR2蛋白可以結(jié)合一個(gè)ABA分子(圖10中D)。
用于GCR2-GPA1相互作用的免疫共沉淀的酵母克隆來自分裂泛素系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性克隆。30度搖培過夜的GCR2-NubG+GPA1-Cub或NubG-KAT1+KAT1-Cub酵母菌稀釋到OD＝0.2-0.3繼續(xù)培養(yǎng)到OD600＝0.5-0.8。酵母培養(yǎng)液5等分后分別加入四種ABA結(jié)構(gòu)同系物(10mM乙醇母液，(±)ABA，(+)ABA和(-)ABA來自Sigma，trans-ABA來自A.G.Scientific)終濃度為10μM對(duì)照加入0.1％乙醇。繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘后，離心收集菌體，按照說明書程序檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。對(duì)于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，酵母菌GCR2-NubG+GPA1-Cub或NubG-KAT1+KAT1-Cub在-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.6g/1000ml-Leu/-Trp/-His/-Ade合成氨基酸復(fù)合物)上搖培到OD600＝0.8。菌液按照上述處理20分鐘后離心收集菌體，沉淀重懸于IP緩沖液中(50mMNa3PO4pH7.5，200mM NaCl，10％甘油，0.1％ NP40，10mM NaF，2.5mMglycerolphosphate，1mM Na3VO4，0.5mM DTT，1mM PMSF，1×植物蛋白酶抑制劑cocktail；Roche) 同時(shí)加入100μl玻璃珠(Sigma)?？焖僬鹗?分鐘(每30秒在冰上放置1分鐘)，14,000rpm 4度離心10分鐘。2μg anti-HA抗體(Sigma，沉淀GCR2-NubG-HA融合蛋白)加在上清中4℃撫育4h，加入20μl protein A-Sepharose(Sigma)繼續(xù)撫育2小時(shí)后，6000g 4度離心2分鐘收集沉淀，沉淀用4.5毫升IP緩沖液洗三次后在SDS上樣緩沖液中煮樣10分鐘用8％SDS-PAGE電泳分離蛋白。分別用anti-HA抗體和anti-GPA1抗體檢測(cè)蛋白信號(hào)。相對(duì)的信號(hào)強(qiáng)度用MetaVue 6.2r4(Universal Imaging Corp)軟件分析。
GCR2-NubG+GPA1-Cub或NubG-KAT1+KAT1-Cub酵母菌在-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.6g/1000ml-Leu/-Trp/-His/-Ade合成氨基酸復(fù)合物)中搖培過夜后，1∶1000稀釋到新鮮培養(yǎng)基，分別滴加到添加或不添加10μM的ABA的-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上(購(gòu)自Clontech公司，其組成為0.67％ YNB DIFCO公司，2％葡萄糖，0.6g/1000ml-Leu/-Trp/-His/-Ade合成氨基酸復(fù)合物，20克/升瓊脂，1mM Met)，30度培養(yǎng)7天，觀察酵母生長(zhǎng)情況。進(jìn)一步在重組的酵母體系中證實(shí)了ABA與GCR2結(jié)合導(dǎo)致GCR2-GPA1復(fù)合體的解離，從而游離Gα和Gβγ亞基去激活下游的效應(yīng)器(圖10中E)。
圖10中，A為ABA結(jié)合GCR2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為ABA結(jié)合GCR2具有立體結(jié)構(gòu)特異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C為ABA結(jié)合GCR2具有飽和性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D為ABA與GCR2結(jié)合的解離常數(shù)；E為ABA結(jié)合GCR2導(dǎo)致GCR2-GPA1復(fù)合體解離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。E中，ABA列中的“+”表示添加了10μM(±)ABA，“-”表示未添加(±)ABA。
序列表<160>3<210>1<211>1206<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgccggagt ttgtaccgga agatttatcc ggagaagaag aaactgttac cgaatgtaaa 60gattcgttga cgaaactgct atcacttccg tacaaatcat tctcagagaa gcttcacaga120tatgctctaa gcatcaaaga taaagtagtc tgggagacat gggaacgatc tggaaaacgt180gttcgagatt ataacttgta tactggagtt cttgggacag cttatctctt gttcaaatct240tatcaggtta ctagaaatga agatgatctt aagctatgct tagagaatgt tgaagcttgt300gatgtagctt caagagattc tgagcgagtg acatttatat gtggctatgc tggtgtatgt360gctcttggtg ctgttgcagc gaagtgttta ggtgatgacc agttatatga tcgttactta420gcccgtttcc gagggattag gcttcctagt gacttgccat atgagttgct atatggtaga480gcaggatact tgtgggcgtg tttgttcttg aataagcata ttggtcagga gagtatatca540tctgaacgaa tgagatcagt ggttgaggaa atcttcaggg caggaagaca actcgggaat600aaaggaactt gtccattgat gtatgagtgg cacgggaaga ggtactgggg ggctgcacac660ggtttagctg ggatcatgaa tgttttgatg catacggaac ttgaaccaga tgaaatcaaa720gatgtcaaag gtacactaag ctatatgata caaaaccgtt ttcctagcgg gaattaccta780tctagtgaag gaagcaaatc agatcgcctt gttcactggt gtcacggtgc tcctggtgtt840gctctcacac ttgtaaaggc agctcaggtt tataacacta aggaatttgt agaggcagca900atggaggcag gagaagttgt gtggagccgt ggattgctta aacgagtagg aatctgtcac960ggtatcagcg gaaacacata cgtgtttctt tctctatacc ggttaacaag aaacccaaag 1020tatttgtacc gcgctaaagc tttcgcgtct ttcctactcg ataaatcaga gaagttaatc 1080tcagaaggtc aaatgcatgg aggagataga cccttctctc tctttgaagg tatcggagga 1140atggcctaca tgttactcga catgaatgat ccaacacaag ctctgtttcc aggttatgaa 1200ctctaa 1206<210>2<211>401<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2Met Pro Glu Phe Val Pro Glu Asp Leu Ser Gly Glu Glu Glu Thr Val1 5 10 15Thr Glu Cys Lys Asp Ser Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Pro Tyr Lys20 25 30Ser Phe Ser Glu Lys Leu His Arg Tyr Ala Leu Ser Ile Lys Asp Lys35 40 45Val Val Trp Glu Thr Trp Glu Arg Ser Gly Lys Arg Val Arg Asp Tyr50 55 60Asn Leu Tyr Thr Gly Val Leu Gly Thr Ala Tyr Leu Leu Phe Lys Ser65 70 75 80Tyr Gln Val Thr Arg Asn Glu Asp Asp Leu Lys Leu Cys Leu Glu Asn85 90 95Val Glu Ala Cys Asp Val Ala Ser Arg Asp Ser Glu Arg Val Thr Phe100 105 110Ile Cys Gly Tyr Ala Gly Val Cys Ala Leu Gly Ala Val Ala Ala Lys115 120 125Cys Leu Gly Asp Asp Gln Leu Tyr Asp Arg Tyr Leu Ala Arg Phe Arg130 135 140Gly Ile Arg Leu Pro Ser Asp Leu Pro Tyr Glu Leu Leu Tyr Gly Arg145 150 155 160Ala Gly Tyr Leu Trp Ala Cys Leu Phe Leu Asn Lys His Ile Gly Gln165 170 175Glu Ser Ile Ser Ser Glu Arg Met Arg Ser Val Val Glu Glu Ile Phe180 185 190Arg Ala Gly Arg Gln Leu Gly Asn Lys Gly Thr Cys Pro Leu Met Tyr195 200 205Glu Trp His Gly Lys Arg Tyr Trp Gly Ala Ala His Gly Leu Ala Gly210 215 220Ile Met Asn Val Leu Met His Thr Glu Leu Glu Pro Asp Glu Ile Lys225 230 235 240Asp Val Lys Gly Thr Leu Ser Tyr Met Ile Gln Asn Arg Phe Pro Ser
245 250 255Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Glu Gly Ser Lys Ser Asp Arg Leu Val His260 265 270Trp Cys His Gly Ala Pro Gly Val Ala Leu Thr Leu Val Lys Ala Ala275 280 285Gln Val Tyr Asn Thr Lys Glu Phe Val Glu Ala Ala Met Glu Ala Gly290 295 300Glu Val Val Trp Ser Arg Gly Leu Leu Lys Arg Val Gly Ile Cys His305 310 315 320Gly Ile Ser Gly Asn Thr Tyr Val Phe Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Thr325 330 335Arg Asn Pro Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Lys Ala Phe Ala Ser Phe Leu340 345 350Leu Asp Lys Ser Glu Lys Leu Ile Ser Glu Gly Gln Met His Gly Gly355 360 365Asp Arg Pro Phe Ser Leu Phe Glu Gly Ile Gly Gly Met Ala Tyr Met370 375 380Leu Leu Asp Met Asn Asp Pro Thr Gln Ala Leu Phe Pro Gly Tyr Glu385 390 395 400Leu<210>3<211>1662<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3atgccggagt ttgtaccgga agatttatcc ggagaagaag aaactgttac cgaatgtaaa 60gattcgttga cgaaactgct atcacttccg tacaaatcat tctcagagaa gcttcacaga120tatgctctaa gcatcaaaga taaagtaact cacttttcaa tttgattata tatgattttg180agttataatg aagttatgta gttataatga atttatgact tttctttagt ctagtgaagt240tgtgttttct cttgtttgtg tggtgattct gttttaggta gtctgggaga catgggaacg300atctggaaaa cgtgttcgag attataactt gtatactgga gttcttggga cagcttatct360cttgttcaaa tcttatcagg ttactagaaa tgaagatgat cttaagctat gcttagagaa420
tgttgaagct tgtgatgtag cttcaagaga ttctgagtaa gtgaattttc ttcaatgatc480caattttcat gaattcattt cggggtaatg attgtggttt ctatcaggcg agtgacattt540atatgtggct atgctggtgt atgtgctctt ggtgctgttg cagcgaagtg tttaggtgat600gaccagttat atgatcgtta cttagcccgt ttccgagggg taattactaa ttacagtttc660ttttgctcta gtgaaaatag ataacttgtt ctatactttg cttgagtgtt gcaactttga720tctgtttaac agattaggct tcctagtgac ttgccatatg agttgctata tggtagagca780ggatacttgt gggcgtgttt gttcttgaat aagcatattg gtcaggagag tatatcatct840gaacgaatgg tataataaag ttataaaatt tctttggtta attgacttac tcaagaaagt900tcaagatttt atgatatctc tatatcttca gagatcagtg gttgaggaaa tcttcagggc960aggaagacaa ctcgggaata aaggaacttg tccattgatg tatgagtggc acgggaagag 1020gtactggggg gctgcacacg gtttagctgg gatcatgaat gttttgatgc atacggaact 1080tgaaccagat gaaatcaaag atgtcaaagg tacactaagc tatatgatac aaaaccgttt 1140tcctagcggg aattacctat ctagtgaagg aagcaaatca gatcgccttg ttcactggtg 1200tcacggtgct cctggtgttg ctctcacact tgtaaaggca gctcaggtaa tcatttgttg 1260attgaagtac tcttatcagt aagtaaaacc acaatgcaaa actcattttc tggatatcgt 1320caggtttata acactaagga atttgtagag gcagcaatgg aggcaggaga agttgtgtgg 1380agccgtggat tgcttaaacg agtaggaatc tgtcacggta tcagcggaaa cacatacgtg 1440tttctttctc tataccggtt aacaagaaac ccaaagtatt tgtaccgcgc taaagctttc 1500gcgtctttcc tactcgataa atcagagaag ttaatctcag aaggtcaaat gcatggagga 1560gatagaccct tctctctctt tgaaggtatc ggaggaatgg cctacatgtt actcgacatg 1620aatgatccaa cacaagctct gtttccaggt tatgaactct aa 166權(quán)利要求
1.一種G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能與G蛋白相互作用并可與脫落酸結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的編碼基因，為如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體編碼基因的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體編碼基因的轉(zhuǎn)基因宿主菌。
7.權(quán)利要求2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體編碼基因在調(diào)節(jié)植物的抗逆性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體在調(diào)節(jié)植物的抗逆性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體和它的編碼基因與應(yīng)用。該G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能與G蛋白相互作用并可與脫落酸結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。通過調(diào)節(jié)該G蛋白偶聯(lián)受體及脫落酸受體的表達(dá)和活性來改變和影響植物對(duì)逆境(如干旱、低溫等)的反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101037474SQ20071006386
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日
發(fā)明者馬力耕, 劉西崗 申請(qǐng)人:北京生命科學(xué)研究所