專利名稱：高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及高羊茅基因槍高頻轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)又稱葦狀羊茅，是世界溫帶地區(qū)的多年生冷季型草種，原產(chǎn)歐洲西部，具有營養(yǎng)豐富、生長迅速、抗干旱、抗病、耐瘠薄、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特性，既可放牧又可建植草坪。是歐洲和北美重要的栽培牧草之一，并與草地早熟禾并列為最重要的草坪草種。我國20世紀70年代引進，之后成為北方暖溫帶地區(qū)建立人工草地和補播天然草場的重要草種。近年來，高羊茅作為草坪草在我國利用發(fā)展很快，黑龍江、北京、山東、江蘇、湖北、江西等地都已引種栽培，在我國的草地建設(shè)、改良、城市綠化和運動草坪建植中發(fā)揮著越來越大的作用。但草質(zhì)粗糙、適口性差、無匍匐莖、易遭雜草侵害以及不耐寒冷、耐鹽性差等缺點使高羊茅的栽培具有一定的局限性。長期以來，同其他牧草和草坪草一樣，高羊茅新品種培育基本上都是依靠常規(guī)育種方法，工作周期長，定向性不好。另外，高羊茅的遺傳學和生殖生物學研究工作薄弱以致遺傳改良的研究成功率不高。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為高羊茅的遺傳改良提供了一種很有潛力的手段，利用基因工程技術(shù)可有效改善特定性狀，為高羊茅耐鹽耐旱和耐寒育種開辟新途徑。
近年來，在傳統(tǒng)育種手段的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代生物技術(shù)如基因工程進行培育已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高羊茅的育種工作中?；驑尫ㄊ抢酶咚龠\動的金屬微粒將附著于表面的核酸分子引入到受體細胞中的一種遺傳物質(zhì)導入技術(shù)。其原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作為驅(qū)動力加速金屬粒子，并使其進入帶壁的細胞。在此過程中，攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA首先粘附在微彈表面，結(jié)合有DNA分子的微彈經(jīng)加速而獲足夠的動量，進而穿透植物細胞壁進入靶細胞。外源DNA分子也就隨之導入細胞，并隨機整合到寄主的基因組內(nèi)。基因槍法的受體可以是各種外植體、愈傷組織及胚性細胞或細胞器，突破了基因轉(zhuǎn)移的物種界限。實驗操作簡單易行，具有相當廣泛的應(yīng)用范圍，已成為研究植物細胞轉(zhuǎn)化和培育轉(zhuǎn)基因植物的最有效的手段之一?；驑屴D(zhuǎn)化法是目前質(zhì)體基因工程中最常用和最有效的DNA導入技術(shù)，它避開了原生質(zhì)體再生培養(yǎng)的困難，克服了當時所認為的農(nóng)桿菌的宿主限制，受體材料來源廣泛，且不受基因型限制。且具有高效表達、原核基因無需修飾改造、便于遺傳操作、可實現(xiàn)定點整合和易保持純系、后代不分離等優(yōu)點。
草高羊茅轉(zhuǎn)化過程中多采用這種方法，但是對其轉(zhuǎn)化過程研究較少，一般只簡單獲得植株；對高羊茅進行功能基因轉(zhuǎn)化的較少，抗旱、耐鹽等基因轉(zhuǎn)化尚屬空白。我們則對基因槍具體的轉(zhuǎn)化參數(shù)進行系統(tǒng)研究，并且把兩種與抗旱、耐鹽有關(guān)的功能基因轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織中，得到了再生植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法，以提高高羊茅的轉(zhuǎn)化效率。
本發(fā)明方法選擇高羊茅胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體通過調(diào)節(jié)基因槍轟擊過程中的各項影響因素，獲得適合高羊茅最佳轉(zhuǎn)化體系。
具體地說，本發(fā)明的待轟擊愈傷組織塊直徑在0.5-1mm，采用CaCl2+Sperm(亞精胺)包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊的高度選擇6cm，轟擊次數(shù)為2次；轟擊后愈傷組織在含有滲透劑(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈傷誘導培養(yǎng)基上過夜，次日轉(zhuǎn)入愈傷誘導培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)5d。經(jīng)恢復培養(yǎng)的愈傷組織，在篩選壓為80mg/L潮霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)40d，而后轉(zhuǎn)入篩選壓為40mg/L潮霉素再生培養(yǎng)基中續(xù)篩選的同時再生植株。
本發(fā)明成功地將DREB1A、BADH-CMO基因轉(zhuǎn)入‘千年盛世’、‘凌志’、‘交戰(zhàn)II號’和‘獵狗5號’4個品種高羊茅基因組中，從而獲得移栽成活的潮霉素抗性株系。
本發(fā)明對高羊茅基因槍轉(zhuǎn)化方法進行了系統(tǒng)的研究，獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。具體包括1)基因槍轉(zhuǎn)化過程中，在轟擊壓力一定的情況下，基因槍轉(zhuǎn)化受多個因素的綜合影響，本發(fā)明研究了金粉直徑、受體處理、受體狀態(tài)等因素的影響，并且綜合考慮了轟擊高度、轟擊次數(shù)和滲透處理的綜合效果。找到了最佳的基因槍轟擊參數(shù)，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系。
2)在含有潮霉素抗性標記的外源基因轉(zhuǎn)入愈傷組織后，要進行愈傷組織抗生素的篩選，本發(fā)明對不同抗生素濃度進行篩選，獲得了愈傷組織篩選的臨界濃度，可應(yīng)用于含有潮霉素抗性標記的外源基因轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織后，進行外源基因的初步篩選鑒定。
3)將2種功能基因通過此體系轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織中，經(jīng)過分化再生，獲得了轉(zhuǎn)基因的高羊茅植株，證明了這種方法的可行性。
本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化效率高達6％，并且育種時間僅需半年，與傳統(tǒng)育種相比大大縮短了高羊茅育種的時間。


圖1是GUS顯色示意圖，A、B是轉(zhuǎn)化的愈傷組織，C是未轉(zhuǎn)化的愈傷組織；圖2是PCR產(chǎn)物的電泳圖，圖中1是未轉(zhuǎn)基因的植株，M是marker，24是質(zhì)粒對照，2～23是轉(zhuǎn)基因植株；圖3是轉(zhuǎn)基因高羊茅植株。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1高羊茅的基因槍轉(zhuǎn)化1.受體材料準備供試高羊茅品種為獵狗5號(Houndog5，購自北京中種草業(yè)有限公司)，交戰(zhàn)II號(Crossfire II，購自北京中種草業(yè)有限公司)，凌志(Barlexas，購自百綠集團百綠草種公司)，千年盛世(Millennium，購自北京綠冠草業(yè)科技發(fā)展中心)誘導的胚性愈傷組織。經(jīng)誘導培養(yǎng)基誘導和繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的靶材料。挑取年齡3-5個月的胚性愈傷組織，用鑷子分成直徑約0.5-1mm的小塊，置于含有滲透劑的培養(yǎng)基中央，緊密排列出一個直徑2cm的圓。
2.篩選劑濃度和篩選時間的確定將愈傷接種到含有不同濃度的潮霉素的培養(yǎng)基上，稱取其質(zhì)量，20天后再稱取質(zhì)量，將愈傷轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，再過20天再稱取。根據(jù)質(zhì)量及愈傷狀態(tài)的變化判斷所用潮霉素的適宜濃度及確定適宜的篩選時間，得到潮霉素濃度為80mg/L，篩選時間為40天。
3.包裹DNA微彈(1)稱取30mg直徑1μm的金粉，置于1.5ml離心管中，加入1ml 70％乙醇，渦旋3-5min(混勻)，靜置15min，瞬時離心1-5s，棄上清。(2)重復以下步驟三次加入1ml無菌水洗滌金粉，渦旋1min，靜置1min，瞬時離心，棄上清。(3)加500μl 50％無菌甘油，金粉濃度約為60mg/ml，室溫下可保持兩周。(4)渦旋保存在甘油中的金粉5min。(5)吸取50μl(3mg)于1.5ml離心管中，吸取過程保持渦旋，冰上操作；(6)依次加入5μl攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M亞精胺，持續(xù)渦旋2-3min，靜置1min，瞬時離心2s；(7)棄上清，加入140μl 70％乙醇；(8)棄上清，加入140μl無水乙醇；(9)棄上清，加入48μl無水乙醇，輕輕敲擊離心管數(shù)次懸浮金粉，低速渦旋2-3s，此時金粉可以用于轟擊之用。
4.轟擊處理所用基因槍為Biorad公司PDS1000/He型，將其放置于一個較大型的超凈工作臺上，以利于操作。工作臺、真空室、微彈載體和阻擋網(wǎng)等均需用70％酒精消毒，然后吹干。將微彈載體裝入載體架上，取6μl包被質(zhì)粒DNA的金粉懸浮液，均勻涂抹于微彈載體膜中心，干燥10min。將載有包被質(zhì)粒DNA的金粉顆粒的微彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置中，將盛有欲轉(zhuǎn)化愈傷組織的培養(yǎng)皿置于基因槍樣品室內(nèi)，可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在6cm轟擊2次。
5.過渡培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)將轟擊后的愈傷組織在含有滲透劑(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈傷誘導培養(yǎng)基中過夜，次日進行g(shù)us基因化學組織染色，按照Jefferson(Jefferson Richard A，Tony A.Kanvanagh and MichaelW.Bevan.Gus fusionsβ-glucuronidaseand a sensitive and versatilegene[J].The EMBO Journal，1987，6(13)3901-3907)的方法進行。將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷誘導培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)5d，再轉(zhuǎn)入加有80mg/L潮霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)20d，25℃暗培養(yǎng)，連續(xù)篩選兩次，即篩選培養(yǎng)40d。
6.植株再生培養(yǎng)挑取存活愈傷轉(zhuǎn)入含有40mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基是指1/2MS+0.2mg/L KT(激動素)中續(xù)篩選30d，25℃光照16h培養(yǎng)。挑取部分愈傷組織進行g(shù)us基因化學組織染色。將長出的小芽轉(zhuǎn)入到不含篩選劑的分化培養(yǎng)基中待小苗長到3-4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基是指1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT)中，壯苗生根。
7.抗性植株的移栽將根葉完全的壯苗室溫下煉苗3d后，清洗掉基部的培養(yǎng)基，直接栽入到花盆(基質(zhì)為沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生長。(圖3)實施例2轉(zhuǎn)化植株的檢測通過實施例1的方法將DREB1A基因通過pCAMBIA1301(CAMBIA)載體(包含DREB1A和Gus基因，分別由ubi及CaMV35S啟動子驅(qū)動，篩選基因為hpt)轉(zhuǎn)入高羊茅胚性愈傷組織，并獲得抗性植株。轉(zhuǎn)化效率為6.12％。
1、GUS表達的檢測轉(zhuǎn)化后40h，對轉(zhuǎn)化的受體進行組織化學染色，觀測愈傷組織中GUS基因的瞬時表達，在Olympus體視顯微鏡下觀察染色情況；2個月后，對潮霉素抗性愈傷組織進行組織化學染色，觀測GUS基因的穩(wěn)定表達。染色方法參考Jefferson方法(Jefferson，1987)，以未轉(zhuǎn)化愈傷組織作對照，結(jié)果如圖1所示，圖1中A、B是轉(zhuǎn)化的愈傷組織，C是未轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
2、抗性植株的分子檢測提取抗性植株DNA進行PCR檢測，DREB1A引物序列為引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATGAAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACTCCA TAA CGA TAC G＜3’反應(yīng)體系采用25μl反應(yīng)體系，具體如下
10×Taq buffer2.5μLdNTP 2.0μL引物F+R 2×1.0μLTaq酶 0.5μL模板(質(zhì)粒和代測植物)DNA 1μLddH2O 17μL總體積25μL反應(yīng)條件熱蓋 105℃94℃預變性 4min 72℃延伸10min4℃保存PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，抗性植株中全部檢出DREB1A基因；將PCR產(chǎn)物克隆載體后測序，測序正確。
權(quán)利要求
1.高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl2+亞精胺包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊高度6cm，轟擊2次。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用DREB1A-GUS雙基因表達載體。
4.一種制備轉(zhuǎn)基因高羊茅的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl2+亞精胺包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊高度6cm，轟擊2次；2)轟擊后的愈傷組織在含有0.2M山梨醇和0.2M甘露醇的愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)4h，轉(zhuǎn)入愈傷誘導培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)5d。3)經(jīng)恢復培養(yǎng)的愈傷組織，在篩選壓為80mg/L潮霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)40d，而后轉(zhuǎn)入篩選壓為40mg/L潮霉素再生培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選培養(yǎng)直至再生出植株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用DREB1A-GUS雙基因表達載體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用含有潮霉素抗性標記的表達載體。
8.如權(quán)利要求4～7所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化受體為‘千年盛世’、‘凌志’、‘交戰(zhàn)II號’或‘獵狗5號’的胚性愈傷組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl
文檔編號C12N15/87GK101024844SQ20071006358
公開日2007年8月29日 申請日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日
發(fā)明者韓烈保, 王維飛, 曾會明, 齊春暉, 方文娟 申請人:北京林業(yè)大學, 韓烈保, 王維飛