專利名稱：大范圍核酸酶重組系統(tǒng)的制作方法
大范圍核酸酶重組系統(tǒng)本發(fā)明涉及一組基因構(gòu)建體，其使得可以在基因組的固定位置高效地并可重復(fù)性地引入特定的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及使用這些構(gòu)建體的方法和試劑盒形式的這些材料。自從25年多以前在酵母中首次進(jìn)行基因靶向?qū)嶒?yàn)以來(1，2)，同源重組已被用來插入、替換或刪除多種細(xì)胞中的基因組序列(3-5)。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶向事件的發(fā)生頻率非常低。同源重組的頻率可通過所靶向基因座中特異性DNA雙鏈斷裂 (doule-strand break, DSB)而顯著提高陽，7)?？刹捎么蠓秶怂崦?Meganuclease)產(chǎn)生這種DSB，所述大范圍核酸酶是識(shí)別大的DNA靶向位點(diǎn)(>12bp)的序列特異核酸內(nèi)切酶。這些蛋白質(zhì)可切割獨(dú)特的染色體序列而不影響基因組的整體完整性。天然的大范圍核酸酶主要由歸巢核酸內(nèi)切酶(homing endonuclease)所代表，所謂歸巢核酸內(nèi)切酶是在真核動(dòng)物、細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的廣泛存在的蛋白質(zhì)類別(8)。對(duì)HceI和HO歸巢核酸內(nèi)切酶的早期研究已表明這些蛋白質(zhì)的切割活性如何在活細(xì)胞中引發(fā)同源重組(homologous recombination, HR)事件，并證實(shí)染色體DSB的重組產(chǎn)生特性(9，10)。從那時(shí)起，已經(jīng)在細(xì)菌(11)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(6，7，12-14)、小鼠(15)和植物(16，17)中成功地將大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組用于基因組工程目的?；虿迦肟衫缬糜趯⒛康幕蛞胩囟ɑ蜃?，以用于產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。目前的重組治療蛋白質(zhì)大部分在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CH0、小鼠SP2/0和NSO 細(xì)胞或人PerC. 6細(xì)胞系)中產(chǎn)生(18)。在篩選高表達(dá)克隆的過程中，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和穩(wěn)定性是兩個(gè)主要的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于改善篩選工作來說，在各克隆之間獲得可重復(fù)性的結(jié)果是有利的。這些原則也適用于產(chǎn)生用于篩選特定藥物靶標(biāo)的細(xì)胞。同樣的原則也可適用于在相同基因組背景下表達(dá)的多種基因，以在所得細(xì)胞系之間進(jìn)行比較性研究和分析。這樣的細(xì)胞系還可在篩選程序中被化合物文庫作用。然而，目前沒有在異源序列插入/缺失可容易進(jìn)行確定的基因座處引發(fā)DSB的方法。本發(fā)明人開發(fā)了一組新的基因構(gòu)建體，其使得在其它相同遺傳背景的細(xì)胞系中可重復(fù)性地整合和表達(dá)目的基因(gene of interest, G0I)或一系列基因。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一組基因構(gòu)建體，其包括a)構(gòu)建體(i)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼A1-A2-A3-A4-A5 ⑴其中Al是第一啟動(dòng)子；A2是第一同源部分；A3是大范圍核酸酶切割位點(diǎn)；A4是第一標(biāo)記基因；A5是第二同源部分；并且其中構(gòu)建體(i)被設(shè)置成穩(wěn)定整合進(jìn)至少一個(gè)靶細(xì)胞的基因組中；b)構(gòu)建體(ii)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼A2，-B1-B2-B3-B4-A5，(ii)其中A2’包含所述第一同源部分A2的一部分；Bl為與所述第一標(biāo)記基因不同的第二標(biāo)記基因；B2是第二啟動(dòng)子；B3是多克隆位點(diǎn)；B4是第三啟動(dòng)子；A5’包含所述第二同源部分A5的一部分；c)至少一種構(gòu)建體，其選自包含以下的組構(gòu)建體(iii)或(iv)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼Cl-C2(iii)；C3(iv)；或構(gòu)建體(ν)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質(zhì)C4 (ν)；其中Cl是第四啟動(dòng)子；C2是大范圍核酸酶的開放閱讀框(ORF) ；C3是所述大范圍核酸酶的信使RNA(mRNA)形式；C4是所述大范圍核酸酶的分離或重組蛋白質(zhì)；其中來自構(gòu)建體(iii)、(iv)或(ν)的所述大范圍核酸酶識(shí)別并切割A(yù)3 ；并且其中構(gòu)建體(iii)、(iv) 或(ν)被設(shè)置成與構(gòu)建體(ii)共轉(zhuǎn)染進(jìn)所述至少一個(gè)靶細(xì)胞中。該基因構(gòu)建體系統(tǒng)使得可以在經(jīng)改造的細(xì)胞中的特定基因組位置整合和表達(dá) G0L·通過大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組將包含可被克隆入B3部分的GOI的構(gòu)建體(ii)在對(duì)應(yīng)于構(gòu)建體(i)之基因組整合位置的特定位點(diǎn)整合入基因組。所述整合事件以極高頻率發(fā)生并非常特異。每個(gè)基因構(gòu)建體由以上必需組分(Al至A5、A2’和A5’、B1至B4以及Cl至C2)組成，但在這些之間可存在其它核苷酸序列，前提是它們不影響本文定義的所請(qǐng)求保護(hù)之組分的特性。在本發(fā)明中，啟動(dòng)子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)將其與編碼開放閱讀框的第二核苷酸序列組合放置時(shí)引起所述開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄。此外，在RNA分子的情況下，啟動(dòng)子也可以指這樣的非編碼序列，其作用是提高所述RNA分子的翻譯水平。在本發(fā)明中，同源部分是指與另一核苷酸序列具有共有的核苷酸殘基從而引導(dǎo)這些序列之間發(fā)生同源重組的核苷酸序列，更特別地具有至少95%的同一性，優(yōu)選地97%的同一性，并且更優(yōu)選地99%的同一性。構(gòu)建體(i)的第一和第二同源部分以及構(gòu)建體(ii) 的第一和第二同源部分可為100 %相同，或如所指出的較低同一性。特別地，構(gòu)建體(i)的A2和A5部分以及構(gòu)建體(ii)的A2’和A5’部分之間的重疊為至少200bp，并且不多于6000bp。優(yōu)選地，所述重疊在IOOObp至2000bp之間。因此特別地，構(gòu)建體(ii)的組分A2’和A5’分別包含構(gòu)建體⑴之組分A2和A5 的至少200bp并且不多于6000bp。最特別地，構(gòu)建體(ii)的組分A2’和A5’分別包含構(gòu)建體⑴之組分A2和A5的至少IOOObp并且不多于2000bp。本領(lǐng)域已知發(fā)生有效水平的同源重組所需的重疊的量(49)，從這些已知的水平出發(fā)，本發(fā)明人鑒定出用于本發(fā)明構(gòu)建體組的最有效重疊范圍。在本發(fā)明中，大范圍核酸酶切割位點(diǎn)旨在表示22至Mbp的雙鏈回文、部分回文 (假回文)或非回文多核苷酸序列，其被LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割。這些術(shù)語是指大范圍核酸酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨(dú)特的DNA位置(優(yōu)選地為基因組位置)。所述大范圍核酸酶切割位點(diǎn)可以為由野生型大范圍核酸酶(如I-CreI或I-DmoI) 識(shí)別并切割的DNA序列?；蛘咚龃蠓秶怂崦盖懈钗稽c(diǎn)可以為由識(shí)別并切割不同DNA靶標(biāo)序列的經(jīng)改變之大范圍核酸酶識(shí)別并切割的DNA序列。
本發(fā)明人和其他人已經(jīng)證明可改造大范圍核酸酶以識(shí)別不同的DNA靶標(biāo)。尤其已經(jīng)詳細(xì)研究了 I-CreI酶，并且不同研究組已經(jīng)采用半理性方法局部改變I-CreI的特異性 (26-28)。此外，通過將半理性方法和高通量篩選組合已改造出上百個(gè)具有局部改變之特異性的I-CreI衍生物-將I-CreI的Q44、R68和R70或者Q44、R68、D75和177殘基突變并通過篩選鑒定出針對(duì)DNA靶標(biāo)士 3 5位(5NNN DNA靶標(biāo))具有改變之特異性的一組變體、2 ，28)。-將I-CreI 的 Κ28、Ν30 和 Q38 或者 Ν30、Υ33 和 Q38 或 Κ28、Υ33、Q38 和 S40 殘基突變并通過篩選鑒定出針對(duì)DNA靶標(biāo)士8 10位(10ΝΝΝ DNA靶標(biāo))具有改變之特異性的一組變體(29, 30) ο所有這些大范圍核酸酶變體和它們識(shí)別并切割的DNA靶標(biāo)變體均包括在本專利申請(qǐng)中，并且可將特定大范圍核酸酶及其靶標(biāo)的任何組合用作構(gòu)建體(i)的特征A3代表的大范圍核酸酶靶標(biāo)序列以及由構(gòu)建體(iii)、(iv)和(ν)以不同形式編碼的大范圍核酸酶。在本發(fā)明中，標(biāo)記基因是這樣的基因產(chǎn)物，當(dāng)其表達(dá)時(shí)能將表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞或細(xì)胞群與不表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞或細(xì)胞群進(jìn)行區(qū)分。在本發(fā)明中多克隆位點(diǎn)是短DNA區(qū)段，其包含幾個(gè)限制性位點(diǎn)以將目的片段亞克隆入含有多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。在本發(fā)明中，大范圍核酸酶旨在表示具有12至45bp之雙鏈DNA靶標(biāo)序列的核酸內(nèi)切酶。其可以是大范圍核酸酶(如I-CreI或I-DmoI)的野生型形式，或上述這些酶之一的改造形式，或含有一種或多種大范圍核酸酶之部分的融合蛋白(31-33)。本發(fā)明人已證明該系統(tǒng)可針對(duì)多種GOI與多種不同模式哺乳動(dòng)物細(xì)胞系一起使用。優(yōu)選地，組分A5包含標(biāo)記基因或其部分。按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，組分A5須編碼標(biāo)記基因或其部分，以能夠在同源重組事件以后檢出經(jīng)改變的細(xì)胞。或者，可將編碼標(biāo)記基因的DNA序列放置在組分A5之后，其中該另外的部分編碼標(biāo)記基因并使得能夠檢測(cè)經(jīng)過同源重組的細(xì)胞。優(yōu)選地，組分A5’包含所述組分A5的3’端缺失。優(yōu)選地，所述構(gòu)建體⑴、(ii)、(iii)、(iv)和(ν)的各個(gè)組分選自以下組
權(quán)利要求
1.一組基因構(gòu)建體，其包括a)構(gòu)建體(i)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼 A1-A2-A3-A4-A5⑴其中Al是第一啟動(dòng)子；A2是第一同源部分；A3是大范圍核酸酶切割位點(diǎn)；A4是第一標(biāo)記基因；A5是第二同源部分；并且其中構(gòu)建體(i)被設(shè)置成穩(wěn)定整合進(jìn)至少一個(gè)靶細(xì)胞的基因組中；b)構(gòu)建體(ii)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼 A2，-B1-B2-B3-B4-A5，(ii)其中A2’包含所述第一同源部分A2的一部分；Bl為與所述第一標(biāo)記基因不同的第二標(biāo)記基因；B2是第二啟動(dòng)子；B3是多克隆位點(diǎn)；B4是第三啟動(dòng)子；A5’包含所述第二同源部分A5的一部分；c)至少一種構(gòu)建體，其選自包含以下的組構(gòu)建體(iii)或(iv)，其由至少包含以下組分的核酸分子編碼 Cl-C2(iii)； C3(iv)；或構(gòu)建體(ν)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質(zhì) C4(v)；其中Cl是第四啟動(dòng)子；C2是大范圍核酸酶的開放閱讀框(ORF) ；C3是所述大范圍核酸酶的信使RNA(mRNA)形式；C4是所述大范圍核酸酶的分離或重組蛋白質(zhì)；其中來自構(gòu)建體 (iii)、(iv)或(ν)的所述大范圍核酸酶識(shí)別并切割A(yù)3 ；并且其中構(gòu)建體(iii)、(iv)或(ν) 被設(shè)置成與構(gòu)建體(ii)共轉(zhuǎn)染進(jìn)所述至少一個(gè)靶細(xì)胞中。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體組，其中所述構(gòu)建體(ii)之組分A2’和A5’分別包含所述構(gòu)建體(i)之組分A2和A5的至少200bp且不多于6000bp。
3.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建體組，其中所述構(gòu)建體(ii)之組分A2’和A5’分別包含所述構(gòu)建體(i)之組分A2和A5的至少IOOObp且不多于2000bp。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述組分A5編碼標(biāo)記基因或其部分。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中所述組分A5’包含3’端缺失的所述A5。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中所述構(gòu)建體(i)、(ii)、(iii)、(iv) 和(ν)中每一個(gè)的所述組分選自以下組
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體(i)包含SEQID NO :6。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體(ii)包含SEQID NO :22。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體(iii)包含SEQID NO :38或 SEQ ID NO :39。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體(iv)包含SEQID NO :14或 SEQ ID NO 15 或 SEQ ID NO 34 或 SEQ ID NO :35。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體(ν)包含細(xì)胞透過肽，特別是其中所述細(xì)胞透過肽選自包含以下的組SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57。
12.用于將編碼GOI的序列引入至少一個(gè)細(xì)胞的試劑盒，其包含權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體組；和采用所述基因構(gòu)建體組產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的說明。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其還包含由SEQID NO :17或SEQ ID NO力4組成的構(gòu)建體 (vi)。
14.權(quán)利要求12或13的試劑盒，其還包含穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了所述構(gòu)建體(i)的至少一個(gè)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞選自包含以下的組=CHO-Kl細(xì)胞； HEK293 細(xì)胞；Caco2 細(xì)胞；U2-0S 細(xì)胞；NIH 3T3 細(xì)胞；NSO 細(xì)胞；SP2 細(xì)胞；CHO-S 細(xì)胞；DG44 細(xì)胞。
16.通過同源重組轉(zhuǎn)化至少一個(gè)細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)通過將權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的構(gòu)建體(i)插入所述至少一個(gè)細(xì)胞的基因組來穩(wěn)定轉(zhuǎn)化至少一個(gè)細(xì)胞；b)將編碼目的基因的序列克隆入權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)之構(gòu)建體(ii)的位置B3；c)將步驟a)的所述細(xì)胞用步驟b)的所述構(gòu)建體(ii)以及權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的構(gòu)建體(iii)> (iv)或(ν)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染；d)在所述構(gòu)建體(ii)和所述穩(wěn)定插入的構(gòu)建體(i)之間進(jìn)行同源重組后，基于以下條件選擇得自步驟c)的至少一個(gè)細(xì)胞不存在由所述構(gòu)建體(i)的組分A4所編碼的第一標(biāo)記基因，具有由組分Bl所編碼的第二標(biāo)記基因的活性，并且具有由組分A5所編碼的第三標(biāo)記基因的活性。
17.權(quán)利要求16的方法，其中步驟d)中的選擇對(duì)所述第一標(biāo)記、所述第二標(biāo)記和所述第三標(biāo)記的每一個(gè)依次進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組基因構(gòu)建體，其通過采用大范圍核酸酶在基因組的特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂并因而刺激所述基因組位點(diǎn)與轉(zhuǎn)染供體序列之間在該基因座的同源重組事件，從而在基因組的固定位置高效地并可重復(fù)性地引入特定的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及使用這些構(gòu)建體的方法和試劑盒形式的這些材料。
文檔編號(hào)C12N15/90GK102203265SQ200980142217
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者克里斯托夫·德朗達(dá), 安德烈·舒利卡, 讓-皮埃爾·卡巴尼奧爾 申請(qǐng)人:賽萊克蒂斯公司