一種癌蛋白的原核表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種癌蛋白的原核表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大高發(fā)疾病之一，并已成為我國居民的第一位死因，我國科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要已將惡性腫瘤的基礎(chǔ)和應(yīng)用研宄列為公共衛(wèi)生與重要疾病防治的關(guān)鍵科學(xué)問題。因此，新穎抗腫瘤藥物的研宄不僅是臨床腫瘤治療和提高我國人民健康水平的迫使需要，而且對于我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和社會發(fā)展具有重要意義。研宄發(fā)現(xiàn)，P53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因，在DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長和增殖以及許多代謝過程中有重要作用，能夠有效地對抗組織增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有維持基因組穩(wěn)定、抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能.從而抑制腫瘤的發(fā)生。在p53基因下游眾多調(diào)節(jié)因子中，mdm2基因是P53的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)子，與p53之間保持著精細(xì)的平衡。mdm2基因是一種進(jìn)化保守基因，其表達(dá)產(chǎn)物MDM2蛋白與p53多肽(p53基因表達(dá)產(chǎn)生)是一對相互拮抗的蛋白質(zhì)，二者形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路(Negative Feedback Loop)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。該負(fù)反饋通路使得細(xì)胞內(nèi)的P53與MDM2蛋白比率保持恒定，然而，在人腫瘤細(xì)胞中，MDM2蛋白會由于各種原因產(chǎn)生過量表達(dá)累積，MDM2 一旦過量表達(dá)，p53和MDM2之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié)就會失調(diào)。在一些腫瘤細(xì)胞中，由于外界壓力造成的P53激活機(jī)制被認(rèn)為不足以克服MDM2的負(fù)反饋轉(zhuǎn)錄激活區(qū)下游調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致不充分的生長停滯和凋亡作用。因此抑制MDM2蛋白和p53相互作用是當(dāng)前國外腫瘤治療研宄中的一個(gè)熱點(diǎn)，而在P53.MDM2結(jié)合抑制劑研宄的過程中，體外表達(dá)MDM2蛋白與相關(guān)抑制劑相互作用成為一種較為有效的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種癌蛋白的原核表達(dá)方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0005]一種癌蛋白的原核表達(dá)方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0006]S1、在肝癌細(xì)胞H印G2中提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA pool ；
[0007]S2、設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物，上游引物引入Nco I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Xho I酶切位點(diǎn)，其序列分別為
[0008]上游引物:5，-3，CATGCCATGGAGACCCTGGTTAG；
[0009]下游引物:5，-3，CCGCTCGAGTACTACCAAGTTCCTG；
[0010]S3、以步驟SI中所得的cDNA為模版，利用步驟S2中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PGR擴(kuò)增，然后通過酶切和酶連將MDM2部分基因克隆到pET28a(+)表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；
[0011]S4、將步驟S3所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(入DE3)中，構(gòu)建含有重組表達(dá)載體的基因工程菌；
[0012]S5、將步驟S4所得基因工程菌置于37°C下培養(yǎng)至OD6tltl^ 0.6?0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mM，誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)，誘導(dǎo)重組MDM2基因在該基因工程菌中表達(dá)；
[0013]S6、將步驟S5所得的菌體3500r/min，4°C離心20分鐘離心收集菌體，將收集到的菌體用40mL生理鹽水洗滌2次后，3500r/min、4°C離心20分鐘，棄去上清，收集菌體；
[0014]S7、將步驟S6所得的菌體用40mL緩沖液A(0.02M PBS+0.5M NaGl，pH8.0)重懸后，利用超聲破碎法破碎，12000Xg、4°C離心20min，去上清，收集沉淀；沉淀用40mL的緩沖液B (0.02M PBS+0.5M NaCl+2M尿素，pH8.0)溶解，進(jìn)行超聲破碎，12000 X g、4°C離心 20min，并重復(fù)一次，收集沉淀；將得到的沉淀用緩沖液C(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH8.0)溶解過夜，12000\8、4°0離心201^11，取上清；
[0015]S7、利用鎳柱親和層析法純化包涵體蛋白；
[0016](I)以緩沖液 C 平衡 Ni Sepharose Fast Flowc 層析柱;
[0017](2)將步驟S36中的上清以0.8mL/min流速上樣至色譜柱，然后用起始緩沖液C洗滌不能吸附于柱上的雜蛋白；
[0018](3)去除非特異性吸附物質(zhì)。采用Buffer D(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH6.0)和Buffer E (0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，ρΗ5.0)階段洗脫，洗滌脂蛋白、非特異性吸附組分；
[0019](4)目的蛋白洗脫:用 Buffer F (0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，Ph4.0)洗脫目的蛋白；
[0020](5)色譜柱的再生與保護(hù):以Buffer F (0.05M EDTA)對色譜柱進(jìn)行洗脫，除去色譜柱所螯合的Ni2+以及與Ni2+牢固結(jié)合的蛋白，然后用蒸餾水在位清洗除去EDTA，最后用20%的乙醇保護(hù)色譜柱；
[0021]S8、利用透析法體外復(fù)性包涵體蛋白，透析后進(jìn)行超濾濃縮。
[0022]采用透析法進(jìn)行MDM2包涵體的復(fù)性，透析外液分別為A (0.02M PBS4.0+0.5MNaCl+4M 尿素，pH 4.0), B (0.02M PBS+0.5M NaCl+2M 尿素，pH 4.0), C (0.02M PBS+0.5MNaCl+lM 尿素，pH 4.0)、D (0.02M PBS+0.5M NaCl+OM 尿素，pH 4.0)，每次透析時(shí)間為 4 小時(shí)；將透析復(fù)性后的MDM2蛋白溶液通過超濾(采用截留分子量為3kDa的超濾濃縮離心管Merck Millipore)除鹽，5000 X g、4°C離心濃縮至 3mL 備用。
[0023]優(yōu)選的，所述步驟S7中超聲破碎的條件為:80%振幅，運(yùn)行4秒、間歇16秒，25次。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0025]極大的提高了基于MDM2蛋白的實(shí)驗(yàn)室研宄方面的實(shí)驗(yàn)的效率，同時(shí)極大的降低了實(shí)驗(yàn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語；本說明書中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；本說明書中所用的試驗(yàn)材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊中的操作。
[0028]實(shí)施例
[0029]S1、MDM2的部分序列的基因獲取
[0030]采用RT-PCR方法獲取MDM2基因，依據(jù)MDM2的成熟蛋白氨基酸序列，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物，以肝癌細(xì)胞H印G2總RNA逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA pool為模版獲取MDM2基因。該序列首先被克隆到pET28a(+)表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)區(qū)的Nco I (296)和Xho I (159)位點(diǎn)，利用載體的T7啟動子啟動基因的表達(dá)，起始密碼子ATG位于載體294位，其下游有一載體自帶的6組氨酸純化位點(diǎn)(具體可參見Novagen公司的質(zhì)粒圖譜)。組氨酸能提供配位電子和一些金屬離子如Ni2+鰲合，6個(gè)組氨酸能使蛋白吸附于含金屬如Ni 2+的層析填料上，因此可以利用金屬鰲合層析來純化目的蛋白。
[0031]S2、MDM2基因工程菌的構(gòu)建
[0032]用于構(gòu)建的宿主菌DH5a和BL21 (入DE3)均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)粒pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存，Nco I和xho I酶購于寶生物工程(大連)有限公司。
[0033]MDM2基因插入pET28a(+)質(zhì)粒:將PCR擴(kuò)增的MDM2基因片段用Nco 1、Xho I雙酶切后通過T4DNA連接酶連接到同樣經(jīng)酶切的pET28a(+)表達(dá)載體上，于16°C孵育過夜，構(gòu)建pET2