Lrk2基因或其編碼蛋白在促進(jìn)水稻分蘗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種LRK2基因或其編碼蛋白在促進(jìn)水稻分 蘗中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口的增長(zhǎng)，城市化進(jìn)程的加快，耕地面積大幅縮小，糧食短缺現(xiàn)象日益突 出。水稻是我國(guó)重要的糧食作物之一，其生產(chǎn)直接關(guān)系著國(guó)家安全。水稻高產(chǎn)是水稻育種 的重要目標(biāo)，也是目前研宄的熱點(diǎn)之一。20世紀(jì)50年代后期，利用矮桿水稻育成高產(chǎn)抗倒 伏品種，形成第一次水稻產(chǎn)量的"綠色革命"；70年代初，雜交秈稻三系配套成功，形成第二 次"綠色革命"。水稻產(chǎn)量的這兩次突破分別源于半矮桿基因和野敗雄性不育胞質(zhì)基因的發(fā) 掘和利用，90年代以來(lái)水稻單產(chǎn)處于徘徊不前的局面，提高水稻單產(chǎn)迫切需要拓寬遺傳資 源實(shí)現(xiàn)第三次突破。產(chǎn)量性狀屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，由單株有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒重 三因素組成。遺傳基礎(chǔ)上由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（Qualitative traitlocus,QTL)所控制， 在遺傳群體性狀分離中表現(xiàn)為連續(xù)的變化。因其作用機(jī)制的復(fù)雜性，目前僅有少數(shù)幾個(gè)水 稻產(chǎn)量相關(guān)的QTL得到克隆和功能鑒定，這些QTL所編碼的蛋白不同、行使的功能也各異。 與水稻產(chǎn)量相關(guān)的QTL主要有：Gnla，該區(qū)域編碼細(xì)胞分裂素氧化酶0sCKX2,通過(guò)降解細(xì)胞 分裂素（CK)調(diào)控水稻內(nèi)源CK的濃度，從而影響穗部細(xì)胞的分裂速度，決定穗的大小。林鴻 宣課題組分離了具有Ubiquitin E3連接酶活性的GW2基因，該基因通過(guò)抑制細(xì)胞分裂，影 響水稻的粒形。張啟發(fā)課題組分離了編碼CCT蛋白的Ghd7基因，該基因具有調(diào)控水稻的株 高，抽穗期，莖桿和每穗穎花數(shù)等功能。傅向東課題組分離了 DEP1基因，其蛋白中類(lèi)似磷酸 酰乙醇胺結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變后促進(jìn)細(xì)胞分裂，使稻穗變密、枝梗數(shù)增加和每穗粒數(shù)增多。調(diào)控 水稻產(chǎn)量除了這些功能基因外，還有部分是轉(zhuǎn)錄因子。如：李家洋課題組通過(guò)圖位克隆的方 法克隆了控制水稻分蘗的基因M0C1。水稻M0C1突變株系只有主莖，沒(méi)有分蘗，M0C1編碼的 蛋白為GRAS家族成員，定位于細(xì)胞核內(nèi)，行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。從已克隆的QTL或基因結(jié) 構(gòu)分析，目前還未見(jiàn)與產(chǎn)量相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶的報(bào)道。
[0003] 植物富亮氨酸類(lèi)受體蛋白激酶（leucine-rich-repeat receptor kinases, LRKs) 在真核生物中廣泛存在，擬南芥和水稻中分別鑒定出這個(gè)基因亞家族的216和300多個(gè)成 員。LRK在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性反應(yīng)中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，由信號(hào)肽、胞外富亮氨酸受體 結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶域4部分組成，這些激酶大多數(shù)居于各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的節(jié)點(diǎn)， 與它們的上下游蛋白組成復(fù)雜而有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。野生稻具有許多優(yōu)良特性，如抵御生物 或非生物脅迫、蛋白質(zhì)含量高等。申請(qǐng)工作人員構(gòu)建了以普通野生稻為供體親本，桂朝2號(hào) 為受體的高代回交群，從中定位的QTL(qGY2_l)可使秈稻桂朝2號(hào)單株產(chǎn)量增加16%。精 細(xì)定位表明該高產(chǎn)QTL候選基因?yàn)楦涣涟彼嶂貜?fù)受體蛋白激酶基因簇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于LRK2基因或其編碼蛋白或含有LRK2基因的重組載體的新用 途。
[0005] 本發(fā)明具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明提供了 LRK2基因或其編碼蛋白或含有LRK2基因的重組載體在促進(jìn)水稻分 蘗中的應(yīng)用。
[0007] 所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述的LRK2基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 所述的含有LRK2基因的重組載體為將所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S表達(dá) 載體中，以2倍的35S為啟動(dòng)子，以Kpnl與Sail為酶切位點(diǎn)所得到的表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明所述的應(yīng)用為將所述的LRK2基因?qū)肽康闹参镏?，得到分蘗數(shù)大于所述 目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 本發(fā)明所述的LRK2基因通過(guò)所述的含有LRK2基因的重組載體導(dǎo)入目的植物中。
[0012] 本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植 物具體為水稻。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0014] 本發(fā)明所述的方法為將所述的LRK2基因?qū)肽康闹参镏?，得到分蘗數(shù)大于所述 目的植物的轉(zhuǎn)基因植物中。
[0015] 本發(fā)明所述的方法中，所述的LRK2基因通過(guò)所述的含有LRK2基因的重組載體導(dǎo) 入目的植物中。
[0016] 本發(fā)明所述的方法中，所述的含有LRK2基因的重組載體為將所述的LRK2基因插 入PCAMBIA1300S表達(dá)載體中，以2倍的35S為啟動(dòng)子，以Kpnl與Sail為酶切位點(diǎn)所得到 的表達(dá)載體。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種重組載體。
[0018] 本發(fā)明提供的重組載體為將所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S表達(dá)載體中，以 2倍的35S為啟動(dòng)子，以Kpnl與Sail為酶切位點(diǎn)所得到的表達(dá)載體。
[0019] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，構(gòu)建含有LRK2基因的重組載體，將該表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo) 法轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，得到轉(zhuǎn)基因水稻株系，與野生型日本晴水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻株系得 到的分蘗數(shù)增加。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖 1 是載體 pCAMBIA1300-2X35S: :LRK2 的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖2是載體pBI121-LRK2::⑶S的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022] 圖3是載體卩041?從1300-2乂355:丄服2:66??的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023] 圖4是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定電泳圖；M :DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物；CK :陽(yáng)性對(duì)照；
[0024] 圖5是LRK2啟動(dòng)子⑶S染色結(jié)果示意圖；a.根莖基部的分蘗芽；b.節(jié)；c.根； d.花粉；
[0025] 圖6是亞細(xì)胞定位表達(dá)LRK2基因結(jié)構(gòu)模式圖；a. 430nm激發(fā)光下對(duì)照組細(xì)胞； b.明場(chǎng)下對(duì)照組細(xì)胞；c. a，b重合；d. 430nm激發(fā)光下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞；e.明場(chǎng)下對(duì)照組細(xì)胞； f. d, e重合；標(biāo)尺為50 y m ;
[0026] 圖7是灌漿期日本晴與轉(zhuǎn)基因植株對(duì)比；A為日本晴；B為轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0028] 實(shí)施例1構(gòu)建載體
[0029] 1、構(gòu)建載體所用的引物：
[0030] LRK2-1300-KpnI-F ：GTCGGTACCATGCAGCCACCTCATTCTTCATGCAAC ；
[0031] LRK2-1300-SalI-R ：CAGGTCGACTCAGTCGGAGCCTACACTGTCCAG ；
[0032] 2、重組載體
[0033] ①LRK2基因的獲得：
[0034] 提取水稻總DNA :
[0035] 1)取新鮮的水稻葉子放于1. 5ml離心管中，加入200 y 1裂解液。
[0036] 2)用研磨棒將葉子盡量磨成勻漿，利于裂解。
[0037] 3)將離心管放入65°C烘箱中溫育30min，每lOmin充分混勻一次。
[0038] 4)將離心管從烘箱取出，加入65 y 1 5M的KAC溶液，上下顛倒溫和混勾，然后放置 于-20°C 冰浴 5min。
[0039] 5)加入300 y 1氯仿，劇烈振蕩混勾，12000rpm，離心10min。
[0040] 6)取上清液約300 y 1，加至新的無(wú)菌1. 5ml離心管中，再加入180 y 1異丙醇，上 下顛倒溫和混勻，室溫下放置lOmin，12000rmp，離心5min，可見(jiàn)管底部的小塊沉淀物（含 DNA)，棄上清。
[0041] 7)加入800 y 1 70%乙醇，充分混勾，室溫下放置lOmin。
[0042] 8) 12000rmp，離心5min，棄上清，并用槍頭吸去殘留的乙醇，將離心管放在干燥處， 待管內(nèi)完全干燥后加入150-200 y 1的PCR H20,溶解DNA，保存于-20°C。
[0043] 以0嫩為模板，1^1(2-1300-邱111-?與1^1(2-1300-5&11-1?為引物，？〇?擴(kuò)增1^1(2基 因片斷。
[0044] PCR 體系：2XGC buffer 25ul，dNTPs 4ul，LRK2-1300-KpnI-F 1. 5ul， LRK2-1300_SalI-R 1.5ul， Template:rice DNA 2ul，高保真酶 primestar Taq(Takara)0.5ul，PCR H20 up to 50ul〇
[0045] 程序：94°C 4min，98°C 10s，6(TC 15s，72°C 2min 30X，72°C 10min，16°C 24h。
[0046] ②構(gòu)建過(guò)程如圖1~圖3所示，
[0047] 1)PCR擴(kuò)增基因片斷（同步驟①中LRK2基因擴(kuò)增）；
[0048] 2)PCR產(chǎn)物回收；
[0049] 3)pCAMBIA1300S載體與基因片斷酶切；
[0050] 酶切體系：10Xmultibuffer 4ul，Kpnl 1. 75ul，Sail 1. 75ul，BSA 0? 4ul，載體 / 基因片斷 6ul，PCR H20 26ul，合計(jì) 40ul，37°C酶切反應(yīng) 3hours。
[0051] 4)采用上海生工膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物切膠回收；
[0052] 5)連接；
[0053] 連接體系：10X連接buffer lul，載體片斷DNA 2ul，基因片斷DNA 6ul，T4連接酶 lul，16°C，過(guò)夜連接反應(yīng)。
[00M] 6)轉(zhuǎn)化：
[0055]