一種塔里木馬鹿茸c-fos基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種馬鹿茸基因及其應(yīng)用，具體涉及一種塔里木馬鹿茸c-fos基因及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鹿又名赤鹿，是體型較大的鹿種之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界有22個(gè)馬鹿亞種，在我國(guó) 有天山亞種、塔里木亞種、阿勒泰亞種、東北亞種、甘肅亞種、阿拉善亞種、四川亞種和西藏 亞種8個(gè)馬鹿亞種，主要分布在新疆、青海、甘肅、東北和內(nèi)蒙古等地區(qū)。塔里木馬鹿是中國(guó) 馬鹿種群的一個(gè)優(yōu)秀亞種，對(duì)塔里木盆地的荒漠區(qū)具有獨(dú)特的適應(yīng)性，可耐酷熱、耐干旱、 耐風(fēng)沙、耐高鹽堿，因世代在塔里木盆地繁衍生息而得名。塔里木馬鹿是名貴的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng) 物，以高產(chǎn)茸量且質(zhì)優(yōu)而著稱，并被國(guó)際市場(chǎng)譽(yù)為"亞洲之花"。公鹿鹿茸每天增重可達(dá)到 100g~180g，生長(zhǎng)75d~95d就可鋸茸，重量一般可在10kg以上。塔里木馬鹿每年都進(jìn)行 周期性替代，一般要經(jīng)過(guò)脫盤(pán)、生茸、骨化、脫落，再生茸循環(huán)過(guò)程，每個(gè)生長(zhǎng)周期可以采兩 次鹿茸，第一次在生長(zhǎng)開(kāi)始的第二個(gè)月末即每年的4月至6月末，短暫的恢復(fù)之后，鋸后的 茸角會(huì)再次萌發(fā)，可以再生長(zhǎng)一個(gè)半月到8月中旬再鋸第二次。塔里木馬鹿養(yǎng)殖業(yè)是當(dāng)?shù)?畜牧經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在新疆南部地區(qū)為農(nóng)民增產(chǎn)增收，生活致富起到了及其重要的 作用，同時(shí)作為一個(gè)品質(zhì)比較優(yōu)秀的鹿茸，塔里木馬鹿茸值得進(jìn)行大力開(kāi)發(fā)。
[0003]目前，人工養(yǎng)殖的鹿主要通過(guò)割后再生，提高產(chǎn)茸量，但是收割后的馬鹿不用藥物 處理，雖然馬鹿茸能夠再生，但產(chǎn)量非常低，即使注射藥物，也無(wú)法達(dá)到頭茬茸的生產(chǎn)能力。 因此，再生茸比頭茬茸生長(zhǎng)速度慢，骨化程度大，產(chǎn)量低。迫切需要研宄提高再生茸產(chǎn)量的 機(jī)制，為塔里木馬鹿茸大力開(kāi)發(fā)提供線索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種人工合成得到促茸塔里木馬鹿茸c-fos 基因及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，
[0006] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-fos基因，其核苷酸序列如SED ID N0 :1所示。
[0007] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-fos基因的克隆方法，包括以下步驟：
[0008] (1)馬鹿茸總RNA提取、純化；
[0009] (2)cDNA第一鏈的合成、純化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP1如SED ID NO :2所示，對(duì)馬鹿茸總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成、純化；
[0010] (3)馬鹿鸞c-fos基因保守序列的克?。河门-fos基因全長(zhǎng)序列 (NM001046074.2)設(shè)計(jì)引物如SED ID N0:3和SED ID N0:4所示，以馬鹿茸第一鏈cDNA為 模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂凝膠回收試劑盒回 收、純化，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物；
[0011] (4) 5'端序列RACE克?。翰捎肨dT酶和dCTP對(duì)純化后的第一鏈cDNA進(jìn)行末端加 上多聚C;接著采用引物GSP2如SED ID N0:5所示和橋連鉚釘引物AAP如SED ID N0:6所 示對(duì)已經(jīng)加dC尾的第一鏈cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增；然后采用引物GSP3如SED ID NO :7 所示和橋連通用擴(kuò)增引物AUAP如SED ID NO :8所示，進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增，將第二輪 PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化；
[0012] ⑶ 3' 端序列RACE克?。好子媚孓D(zhuǎn)錄酶SMARTScribe? Reverse Transcriptase 和引物3'CDS primer A，對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;接著采用引物3'端533-1如SED ID NO :9所示和UPM如SED ID NO: 10所示，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增；然后將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，用引物3'端533-2如SED ID NO : 11所示和 UPM，進(jìn)行巢式第二輪PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn) 物克隆測(cè)序。
[0013] (6)馬鹿茸c-f0S基因cDNA全長(zhǎng)克?。豪肈NASTAR將所得到的純化的保守序列、 5'端序列、3'端序列進(jìn)行序列拼接，得到馬鹿茸c-fos基因cDNA全長(zhǎng)序列。
[0014] 進(jìn)一步，對(duì)cDNA第一鏈擴(kuò)增，5'端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴(kuò)增，3' 端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴(kuò)增中PCR反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性lmin，94°C變 性 0? 5min，55°C 退火 0? 5min，72°C 延伸 2min，35 個(gè)循環(huán)，72°C 終延伸 7min。
[0015] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-fos基因在促茸生長(zhǎng)中的應(yīng)用，所述c-fos基因含 有一個(gè)單核苷酸多態(tài)點(diǎn)。
[0016] 進(jìn)一步，所述單核苷酸多態(tài)點(diǎn)的基因型為CG。
[0017] 本發(fā)明之塔里木馬鹿茸c-fos基因改變了鹿茸依賴自然或藥物處理的再生茸生 長(zhǎng)緩慢現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)了鹿茸產(chǎn)品的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的SNP基因分型CT可 使馬鹿茸重13. 11 ±0. 90kg。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以說(shuō)明。
[0019] 表1-馬鹿茸c-fos基因cDNA全長(zhǎng)克隆引物
[0020]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種塔里木馬鹿茸c-f0S基因，其特征在于，所述 c-f0S基因的核苷酸序列如SED ID NO : 1所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的塔里木馬鹿茸c-fos基因的克隆方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 馬鹿茸總RNA提取、純化； (2) cDNA第一鏈的合成、純化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSPl如SED ID NO : 2所示，對(duì)馬鹿茸總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成、純化； (3) 馬鹿茸c-fos基因保守序列的克隆：用牛c-fos基因全長(zhǎng)序列（NM001046074. 2)設(shè) 計(jì)引物如SED ID NO :3和SED ID NO :4所示，以馬鹿茸第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂凝膠回收試劑盒回收、純化，然后將擴(kuò) 增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物； (4) 5'端序列RACE克?。翰捎肨dT酶和dCTP對(duì)純化后的第一鏈cDNA進(jìn)行末端加上多 聚C ;接著采用引物GSP2如SED ID NO :5所示和橋連鉚釘引物AAP如SED ID NO :6所示對(duì) 已經(jīng)加 dC尾的第一鏈cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增；然后采用引物GSP3如SED ID NO :7所示 和橋連通用擴(kuò)增引物AUAP如SED ID NO :8所示，進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增，將第二輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化； (5) 3'端序列RACE克?。好子媚孓D(zhuǎn)錄酶SMARTScribe? Reverse Transcriptase和引物 3' CDS primer A，對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;接著采用引物3'端533-1如SED IDNO : 9所示和UPM如SED ID NO : 10所示，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；然 后將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，用引物3'端533-2如SED ID NO: 11所示和UPM，進(jìn) 行巢式第二輪PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物克隆 測(cè)序。 (6) 馬鹿茸c-fos基因 cDNA全長(zhǎng)克?。豪肈NASTAR將所得到的純化的保守序列、5' 端序列、3'端序列進(jìn)行序列拼接，得到馬鹿茸c-fos基因 cDNA全長(zhǎng)序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的塔里木馬鹿茸c-fos基因的克隆方法，其特征在于，對(duì)cDNA 第一鏈擴(kuò)增，5'端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴(kuò)增，3'端序列RACE克隆的PCR第一 輪、第二輪擴(kuò)增中PCR反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性lmin，94°C變性0. 5min，55°C退火0. 5min， 72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72°C終延伸7min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔里木馬鹿茸c-fos基因在促茸生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征在于， 所述c-fos基因含有一個(gè)單核苷酸多態(tài)點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的塔里木馬鹿茸c-fos基因在促茸生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征在于， 所述單核苷酸多態(tài)點(diǎn)的基因型為CT。
【專利摘要】一種塔里木馬鹿茸c-fos基因及其應(yīng)用，所述c-fos基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。本發(fā)明塔里木馬鹿茸c-fos基因還包括在促茸生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明之塔里木馬鹿茸c-fos基因改變了鹿茸依賴自然或藥物處理的再生茸生長(zhǎng)緩慢現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)了鹿茸產(chǎn)品的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的SNP基因分型CT可使馬鹿茸重13.11±0.90kg。
【IPC分類】C12N15-12, C12N15-10, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104830870
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510261490
【發(fā)明人】韓春梅, 高慶華, 王姍姍, 吳延風(fēng), 孟浩, 鄭永富, 馬夢(mèng)婷
【申請(qǐng)人】塔里木大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日