專利名稱：一種高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)。具體地說是一種以特定長度的山羊β-酪蛋白基因的調(diào)控區(qū)作為真核目的基因的主要調(diào)控元件，直接指導(dǎo)目的基因在處于穩(wěn)定泌乳期中的乳腺中高水平快速表達(dá)和生產(chǎn)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA和處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺兩部分。其中在山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA質(zhì)粒DNA上，于山羊β-酪蛋白基因的調(diào)控區(qū)下游依次克隆有接頭(linker)、牛生長激素poly(A)信號序列、pUC18 DNA序列；上游含有鼠免疫球蛋白(Ig)MAR序列。目的基因在克隆入表達(dá)載體pMRPA后，以生理鹽水溶液形式并以直接注入的方式導(dǎo)入山羊乳腺，目的基因即可在山羊奶中獲得高效快速表達(dá)。
背景技術(shù)：
目前用于目的基因表達(dá)的真核載體系統(tǒng)主要是以巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子或SV40病毒早、晚期啟動子序列等為調(diào)控元件，這些啟動子序列無明顯的組織和細(xì)胞特異性，適用于在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但這些表達(dá)載體需要通過磷酸鈣或脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染劑在嚴(yán)格無菌的條件下轉(zhuǎn)化細(xì)胞，表達(dá)水平也很低。因此，要獲得較高產(chǎn)量的基因表達(dá)產(chǎn)物，需較長的時間對細(xì)胞進(jìn)行克隆、篩選和加壓方能實現(xiàn)。這些以病毒啟動子等為調(diào)控元件的普通表達(dá)載體，也可在轉(zhuǎn)化的組織中表達(dá)，組織轉(zhuǎn)染通常采用基因槍、DNA-脂質(zhì)體包裹注射以及病毒載體轉(zhuǎn)染等技術(shù)，這些技術(shù)復(fù)雜且費(fèi)用較高，而且無論表達(dá)水平還是組織表達(dá)的特異性均不能滿足回收和鑒定的要求。在轉(zhuǎn)基因動物研究領(lǐng)域中，以乳腺組織特異性表達(dá)載體構(gòu)建動物乳腺生物反應(yīng)器，使目的蛋白表達(dá)到奶中，表達(dá)水平雖然較高，但其構(gòu)建過程復(fù)雜，獲得可高效表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因個體需要很長的周期，而且由于載體在基因組中的整合位點不同，表達(dá)水平和效果在不同個體之間也不盡相同。乳腺是天然高效的蛋白合成組織，乳蛋白合成在泌乳期極為旺盛，總蛋白含量雖然在不同動物間有所差異，但在奶牛和奶山羊乳汁中蛋白含量可達(dá)3.1％～4.0％。因此利用泌乳期乳腺組織表達(dá)外源性目的蛋白比普通的培養(yǎng)細(xì)胞和組織具有明顯的優(yōu)勢。但采用普通病毒啟動子等為主要調(diào)控元件的表達(dá)載體在乳腺組織中表達(dá)時，由于載體不具有組織特異性調(diào)控元件，也不能使目的基因得到高水平表達(dá)。乳蛋白中的主要成份包括乳清蛋白和乳酪蛋白。山羊乳汁中酪蛋白含量約占乳汁總重的2.6％，是比較高的蛋白成份之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)。乳腺在泌乳期具有極其旺盛的代謝功能，可以不需任何特殊的轉(zhuǎn)染劑或理化學(xué)方法，就可將注入其中的目的基因攝入腺泡細(xì)胞，并使其得到表達(dá)；而且表達(dá)是在質(zhì)粒DNA被攝入細(xì)胞后即開始了，時間可持續(xù)一周以上。通過該系統(tǒng)，目的基因可以在山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體指導(dǎo)下，快速高效地表達(dá)其產(chǎn)物到山羊奶中，因此不僅可用于目的基因的表達(dá)鑒定，而且可用于目的蛋白的快速生產(chǎn)。
本發(fā)明所建立的快速高效蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于第一，所構(gòu)建的乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA采用山羊β-酪蛋白基因中調(diào)節(jié)表達(dá)的特定長度的調(diào)控元件，堿基序列位置為-1051～+81，該元件保證了目的基因只在山羊乳腺組織中表達(dá)，并保證了在穩(wěn)定泌乳期高水平表達(dá)；第二，在表達(dá)調(diào)控區(qū)下游插入了含有多個單一克隆位點的接頭，其序列為5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′，其中包含有Apa I，Not I，Mlu I，Sal I，EcoR V，Cla I，Bam HI，Bst BI。限制性內(nèi)切酶識別序列，可適用于多種目的基因的插入；第三，目的基因表達(dá)的直接靶組織是處于穩(wěn)定泌乳期即產(chǎn)羔10-20天后的山羊乳腺。第四，目的基因的乳腺組織特異性表達(dá)載體僅以生理鹽水溶液的形式、并且僅以直接注射的方式導(dǎo)入乳腺組織，目的蛋白即可獲得表達(dá)。載體中乳腺組織特異性調(diào)控序列是保證目的基因在乳腺中直接、高效、快速表達(dá)的主要調(diào)控元件。除了它和接頭以外，其它的序列包括為了有效實現(xiàn)目的基因表達(dá)的必要元件和實現(xiàn)載體所載目的基因在大腸桿菌中擴(kuò)增所必需的克隆質(zhì)粒，不是本發(fā)明特有的序列。
一、山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA(見圖1)圖1是本發(fā)明中山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA的結(jié)構(gòu)。其基礎(chǔ)框架為含氨芐青霉素的pUC18。MAR為小鼠免疫球蛋白基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列，β-casein promoter為含山羊β-酪蛋白啟動子的乳腺組織特異性調(diào)控序列，MCS為多克隆位點，bGH poly A為牛生長激素poly A信號序列。
二、載體的制備1、各部分來源a.山羊β-酪蛋白調(diào)控序列(1132bp)在-1051～+81序列兩端合成一對引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)自莎能奶山羊基因組中擴(kuò)增出1132bp核酸片段，克隆于pGEM-T載體上。
b.多克隆位點(接頭)人工合成兩條互補(bǔ)但兩端突出的寡核苷酸5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′，5′-TTCGAAGGATCCATCGATGATATCGTCGACACGCGTGCGGCCGCGGGCC-3′其中含有Apa I，Not I，Mlu I，Sal I，Eco RV，Cla I，Bam HI，Bst BI位點。
c.小鼠免疫球蛋白基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)序列、牛生長激素poly A信號序列(bGH poly A)以及pUC18骨架序列均來源于本實驗室保存的商品質(zhì)粒中。
2、pMRPA的構(gòu)建過程1)根據(jù)山羊β-酪蛋白基因上游調(diào)控序列及cDNA非翻譯區(qū)序列設(shè)計并合成2條引物Primer15′TCAGACTCTATTGTAGTACT3′Primer25′CTCAGATATAATTTCAGTGTATCTG3′。
2)Primer1和Primer2各100pmoles，2.5mM 4種dNTPs 2μl，Taqplus DNA聚合酶1U，10×PCR緩沖液4μl，25mM MgCl24μl，加雙蒸水至40μl。95℃預(yù)變性3min；再進(jìn)入95℃ 30s，52℃ 1min，72℃1min，25 cycles PCR循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，回收1.132kb的核酸片段。
3)取1.132kb片段50ng，pGEM-T載體25ng，Ligation bufier 15μl，Ligase 1U，混勻后16℃過夜。取5μl轉(zhuǎn)化JM109。對重組子鑒定得到質(zhì)粒pT-gP。
4)對pT-gP進(jìn)行測序，結(jié)果為-1051gtctgg ctcagactct attgtagtacttagggtaag accctcctcc tgtatgggct ttcattttct ttcttgcttc cctcatttgc ccttccatgaatactagctg ataaacattg actataaaag atatgaggcc aaacttgagc tgtcccattt taataaatctgtataaataa tatttgttct acaaaagtat tatctaaata aatgttactt tctgtcttaa aatccctcaacaaatcccca ctatctagag aataagattg acattccctg gaatcacagc atgctttgtctgccattatc tgaccccttt ctctttctct cttctcacct ccatctactc ctttttcctt gcaattcatgacccagattc actgtttgat ttggcttgca tgtgtgtgtg ctgagttgcg tctgactgtt atcaaccccatgaatgatag tccaccaggc tctactgtcc atgaaatttt ccagtcaaga atactggagtggattgcatt tcctactcca tttgattaat ttagtgactt ttaaatttct ttttccatat tcgggagcctattcttcctt tttagtctat actctcttca ctcttcaggt ctaaggtatc atcgtgtgct tgttagcttgttactttctc cattatagct taagcactaa caactgttca ggttggcatg aaattgtgtt ctttgtgtggcctgtatatt tctgttgtgt attagaattt accccaagat ctcaaagacc cactgaatac taaagagacctcattgtggt tacaataatt tggggactgg gccaaaactt ccgtgcatcc cagccaagatctgtagctac tggacaattt catttccttt atcagattgt gagttattcc tgttgaaatg ctccccagaatttctgggga cagaaaaata ggaagaattc atttcctaat catgcagatt tctaggaattcaaatccact attggtttta tttcaaacca atgccattaa ctaaatcaga tcattatccattcagcttct ccttcacttc ttctcctcta
ctttggaaaa aaggtaagaa tctcagatat aatttcagtg tatctg(+81)其中 為CAT框， 為TATA框，下劃橫線部位為轉(zhuǎn)錄起始點。
5)取pcDNA3 1μg，NEB Buffer-4 10μl，加入Mlu I 20U，SmaI 10U，雙蒸水至100μl，37℃ 1.5h。瓊脂糖凝膠電泳回收1.931kb含牛生長激素poly(A)信號序列(bGHPA)的小片段。與經(jīng)Sma I酶切、脫磷的質(zhì)粒pMAR連接，轉(zhuǎn)化JM109，篩選鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMRA；6)取pT-gP 1μg，NEB Buffer-4 10μl，加入Mlu I 20U和Apa I10U，雙蒸水至100μl，37℃ 1.5h。瓊脂糖凝膠電泳回收1.144kb山羊β-酪蛋白啟動子，與經(jīng)同樣酶切、回收的pMRA大片段連接，轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，篩選獲得重組質(zhì)粒pMRPA2。
7)取pMRPA2 50ng，NEB Buffer-3 10μl，加入Mlu I 10U和NotI 10U，雙蒸水至100μl，37℃ 1.5h，瓊脂糖凝膠電泳回收大片段。取回收大片段30ng，加2.5μM dNTPs 1μl，Klenow 5U，37℃ 20min，70℃ 15min，取1/3體積，加ligase 1U，2μl連接物轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，篩選獲得重組質(zhì)粒pMRPA1。
8)將合成的5′帶磷的多克隆位點接頭5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′和5′-TTCGAAGGATCCATCGATGATATCGTCGACACGCGTGCGGCCGCGGGCC-3′各100pmol于95℃ 3min，室溫退火15min。取pMRPA1 1μg，加Apa I 10U，NEB buffer 5μl，雙蒸水至50μl，消化后回收線性化DNA。取經(jīng)退火的接頭100pmol，線性化DNA 50ng，ligase 1U，Ligation buffer 1μl，加雙蒸水至10μl，16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，小提質(zhì)粒經(jīng)鑒定、篩選，得到載體pMRPA(如圖2)。
3、山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA的酶切圖譜，如圖34、pMRAR各部分的功能圖1描述了山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA的總體結(jié)構(gòu)，圖2說明了各功能元件的來源和組裝各元件的方法，圖3顯示了pMRPA的酶切圖譜，通過所列舉的限制性內(nèi)切酶組合可將各元件切出或切斷，其酶切位點的位置及排列順序為本載體所特有。
本發(fā)明采用了山羊β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-1051～-1、β-酪蛋白mRNA 5′非翻譯區(qū)+1～+48(第一個外顯子)以及第一個內(nèi)含子部分序列+49～+81的區(qū)域。該區(qū)域首先保證了調(diào)控區(qū)主要調(diào)控元件(如TATA、CAAT盒等)的完整性，同時，由于含有β-酪蛋白mRNA5′非翻譯區(qū)+1～+48(第一個外顯子)以及第一個內(nèi)含子的部分序列+49～+81，有利于其在泌乳期保持較高的起始轉(zhuǎn)錄水平。本發(fā)明中用于將目的基因克隆到載體上的接頭為ApaI-NotI-MluI-SalI-EcoRI-ClaI-BamHI-BstBI，其位置是緊接在山羊β-酪蛋白基因第一個內(nèi)含子部分序列之后，在載體中的功能在于它適于多種外源性目的基因的插入。牛生長激素polyA信號序列是真核生物mRNA加尾信號中效率較高的一種，在真核表達(dá)載體中應(yīng)用較為普遍，其功能是保證mRNA加工后有效翻譯。本發(fā)明中的小鼠免疫球蛋白基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)序列位于山羊β-酪蛋白啟動子上游，其功能在于它可促進(jìn)下游雙鏈DNA的解鏈，從而有利于目的基因轉(zhuǎn)錄。pUC18部分骨架序列含有氨芐抗性(Amp+)、質(zhì)粒復(fù)制起始點(ori)等序列，分別用于轉(zhuǎn)化子的抗性選擇和啟動質(zhì)粒DNA在大腸桿菌中的復(fù)制。
三、pMRPA載體中目的基因的表達(dá)pMRPA載體中的接頭含有ApaI-NotI-MluI-SalI-EcoRI-ClaI-BamHI-BstBI多克隆位點，在該處可任意插入目的基因。
目的基因(如組織型纖溶酶原激活劑(tPA)突變體cDNA和蚓激酶(LK)cDNA)在通過多克隆位點克隆到表達(dá)載體中后，通過質(zhì)粒大規(guī)模制備方法，分別提純表達(dá)載體，溶于生理鹽水中，定量稀釋至100～800μg/ml，取0.5～1ml緩慢注入單側(cè)或雙側(cè)處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺組織內(nèi)(避免注入血管中)。2小時后至10天采集乳汁，即可用于目的基因產(chǎn)物的含量或活性測定。
本發(fā)明的積極效果在于1、目的基因克隆進(jìn)表達(dá)載體后，不需任何轉(zhuǎn)染劑，僅以生理鹽水溶液形式，并且僅以組織直接注射的方式導(dǎo)入乳腺組織，目的基因即可獲得表達(dá)，是一種更方便的表達(dá)系統(tǒng)；2、表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)物表達(dá)水平高、持續(xù)時間較長等優(yōu)點；3、本發(fā)明可用于①通過表達(dá)未知蛋白，可對未知蛋白進(jìn)行初步純化并進(jìn)行活性鑒定；②通過羊奶快速生產(chǎn)具有重要生物功能的藥物蛋白。


圖1為本發(fā)明得到的山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA；圖2為表達(dá)載體pMRPA的構(gòu)建過程圖3為表達(dá)載體pMRPA的酶切圖譜圖4、圖5為本發(fā)明得到的表達(dá)載體pMRPA-tPA；pMRPA-LK；圖6為本發(fā)明mFAPA檢測tPA突變體(B1-3，C1-3)和蚓激酶(B4-6，C4-6)在山羊乳腺中表達(dá)的部分結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實驗例11、取質(zhì)粒pMD-tPAm 1μg，在100μl總反應(yīng)體積中分別加有10×NEB buffer-2 10μl，Hind III 10U，Kpn I 10U，37℃酶切1小時后，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于43μl水中，加5μl 10×Klenowbuffer，1U(1μl)Klenow，室溫5min，補(bǔ)加1μl 2.5mM dNTPs，37℃20min，瓊脂糖凝膠電泳，采用玻璃奶回收試劑盒回收2.1kb片段，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取100ng用于連接。
2、取pMRPA 1μg，在100μl總反應(yīng)體積中分別含有10×NEBBuffer-3 10μl，100μg/ml BSA 1μl，EcoR V 10U，酶切后，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于44μl水中，加牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)Buffer 5μl，CIAP 1U，37℃ 15min，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取50ng于管中，加100ng步驟1中tPA cDNA片段，10×ligation buffer 1μl，ligase 1U，加水至10μl，21℃連接過夜。
3、取連接產(chǎn)物5μl，加入到100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴3min，37℃ 50min，涂布到含氨芐瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。
4、通過快速裂解液鑒定轉(zhuǎn)化子，挑取分子量約為7.9kb的重組子，小量培養(yǎng)，小提質(zhì)粒，經(jīng)Not I酶切鑒定，得到正向連接的載體pMRPA-tPA(如圖4)。
5、將pMRPA-tPA重組子劃線培養(yǎng)，挑單個菌落于含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日按1∶100比例接種到1000-5000ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24小時。冰浴后離心沉淀細(xì)菌，以1體積含20μg/ml RNAse的50mMTris.Cl(pH7.5)懸浮，2體積0.2N NaOH/1％SDS裂解，1.5體積3MNaAc(pH4.8)中和，離心棄沉淀，上清通過Qiagen DNA提取層吸柱，經(jīng)洗滌和洗脫后稀釋到生理鹽水中，使其終濃度達(dá)到100～800μg/ml，獲得注射用pMRPA-tPA溶液。
6、取0.5～1ml上述質(zhì)粒DNA溶液于注射器中。對穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺用碘酊和70％酒精消毒后，注射pMRPA-Tpa DNA溶液?？蓡蝹?cè)注射，也可雙側(cè)同時注射；可單點注射，也可多點注射。避免注射到血管中。
7、2小時后(至10天)即可開始采集乳汁用于目的產(chǎn)物檢測。
8、tPA突變體檢測采用改良的纖維蛋白溶圈法(mFAPA)。
9、以PBS緩沖液配制1％的瓊脂糖，溶化后待其溫度降至55～60℃時，取8ml置玻璃容器內(nèi)，加入10g/L纖維蛋白原1ml，1U/ml的凝血酶1ml，搖勻后倒入水平放置的5cm×10cm酶聯(lián)板蓋內(nèi)，凝固后打孔(直徑2～4mm)待用。
10、滴入20μl乳樣，放入濕盒內(nèi)37℃感作8小時以上；11、測定溶圈直徑(如圖6B1-3，C1-3)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算乳汁樣品中tPA突變體(表1)的含量。
表1注射800μg DNA時tPA突變體在山羊乳腺組織中表達(dá)結(jié)果(mg/L)注射材料PMRPA-tPAPMRPA 生理鹽水羊編號1 2 3 4 5 6 112第一天14.9 52.4 22.9 35.5 23.7 46.3 0.0 0.0 0.0第九天4.015.0 7.5 8.3 7.4 4.7 0.0 0.0 0.0實驗例21、取含蚓激酶(LK)cDNA片段的質(zhì)粒pT-LK 1μg置Eppendorf管中，加入10×NEB Buffer-4 10μl，100μg/ml BSA 1μl，Apa I 10U，37℃酶切1小時后，瓊脂糖凝膠電泳，采用玻璃奶回收試劑盒回收0.9kb片段，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中，取30ng用于連接。
2、取pMRPA 1μg，在100μl總反應(yīng)體積中分別加有10×NEBBuffer-4 10μl，100μg/ml BSA 1μl，Apa I 10U，酶切后，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于44μl水中，加牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)Buffer 5μl，CIAP 1U，37℃ 15min，酚/氯仿抽提兩次，加NaCl溶液至終濃度25mM，2.5倍體積無水乙醇，混勻，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取50ng于管中，加100ng步驟1中LK cDNA片段，10×ligation buffer 1μl，ligase 1U，加水至10μl，21℃連接過夜。
3、取連接產(chǎn)物5μl，加入到100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴3min，37℃ 50min，涂布到含氨芐瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。
4、通過快速裂解液鑒定轉(zhuǎn)化子，挑取分子量約為7.1kb的重組子，小量培養(yǎng)，小提質(zhì)粒，經(jīng)序列測定，得到正向連接的載體pMRPA-LK(如圖5)。
5、將pMRPA-LK重組子劃線培養(yǎng)，挑單個菌落于含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日按1∶100比例接種到1000-5000ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24小時。冰浴后離心沉淀細(xì)菌，以1體積含20μg/ml RNAse的50mM Tris.Cl(pH7.5)懸浮，2體積0.2N NaOH/1％SDS裂解，1.5體積3M NaAc(pH4.8)中和，離心棄沉淀，上清通過Qiagen DNA提取層吸柱，經(jīng)洗滌和洗脫后稀釋到生理鹽水中，使其終濃度達(dá)到100～800μg/ml，獲得注射用pMRPA-LK溶液。
6、取0.5～1ml上述質(zhì)粒DNA溶液于注射器中。對穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺用碘酊和70％酒精消毒后，注射pMRPA-LK DNA溶液。可單側(cè)注射，也可雙側(cè)同時注射；可單點注射，也可多點注射。避免注射到血管中。
7、2小時后(至10天)即可開始采集乳汁用于目的產(chǎn)物檢測。
8、LK檢測采用改良的纖維蛋白溶圈法(mFAPA)。
9、以PBS緩沖液配制1％的瓊脂糖，溶化后待其溫度降至55～60℃時，取8ml置玻璃容器內(nèi)，加入10g/L纖維蛋白原1ml，1U/ml的凝血酶1ml，搖勻后倒入水平放置的酶聯(lián)板蓋內(nèi)，凝固后打孔(直徑2～4mm)待用。
10、滴入20μl乳樣，放入濕盒內(nèi)37℃感作8小時以上；11、測定溶圈直徑(如圖6B4-6，C4-6)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算乳汁樣品中LK(表2)的含量。
表2注射800μg DNA時LK在山羊乳腺組織中表達(dá)結(jié)果(mg/L)注射材料 PMRPA-LK PMRPA 生理鹽水羊編號1 2 3 4 5 6 1 1 2第一天32.1 25.8 23.5 51.2 52.0 33.3 0.0 0.0 0.0第九天6.111.2 6.33.36.85.80.0 0.0 0.0
權(quán)利要求
1.一種高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，其特征在于由山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA和處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺兩部分組成；其中山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA，包含指導(dǎo)目的基因在奶中高效表達(dá)的具有特殊長度的山羊乳腺組織特異性表達(dá)調(diào)控序列、便于目的基因克隆于其中的人工合成的DNA接頭(多克隆位點)片段、有利于目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄后加工的牛生長激素poly(A)信號序列、促進(jìn)目的基因獨(dú)立表達(dá)的鼠免疫球蛋白(Ig)基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)序列，以及供載體和目的基因在大腸桿菌中復(fù)制的部分pUC18 DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體pMRPA，其特征在于所述具有特殊長度的山羊乳腺組織特異性表達(dá)調(diào)控序列，指的是包含山羊β-酪蛋白基因上游5’端啟動子調(diào)控區(qū)-1051～-1、β-酪蛋白mRNA 5′非翻譯區(qū)+1～+48以及第一個內(nèi)含子部分序列+49～+81的區(qū)域。其序列為gtctggctcagactct attgtagtac ttagggtaag accctcctcc tgtatgggct ttcattttct ttcttgcttccctcatttgc ccttccatga atactagctg ataaacattg actataaaag atatgaggccaaacttgagc tgtcccattt taataaatct gtataaataa tatttgttct acaaaagtat tatctaaataaatgttactt tctgtcttaa aatccctcaa caaatcccca ctatctagag aataagattg acattccctggaatcacagc atgctttgtc tgccattatc tgaccccttt ctctttctct cttctcacct ccatctactcctttttcctt gcaattcatg acccagattc actgtttgat ttggcttgca tgtgtgtgtg ctgagttgcgtctgactgtt atcaacccca tgaatgatag tccaccaggc tctactgtcc atgaaattttccagtcaaga atactggagt ggattgcatt tcctactcca tttgattaat ttagtgactt ttaaatttctttttccatat tcgggagcct attcttcctt tttagtctat actctcttca ctcttcaggt ctaaggtatcatcgtgtgct tgttagcttg ttactttctc cattatagct taagcactaa caactgttca ggttggcatgaaattgtgtt ctttgtgtgg cctgtatatt tctgttgtgt attagaattt accccaagat ctcaaagacccactgaatac taaagagacc tcattgtggt tacaataatt tggggactgg gccaaaacttccgtgcatcc cagccaagat ctgtagctac tggacaattt catttccttt atcagattgt gagttattcctgttgaaatg ctccccagaa tttctgggga cagaaaaata ggaagaattc atttcctaatcatgcagatt tctaggaatt caaatccact attggtttta tttcaaacca caaaattagc atgccattaaatactatata taaacagcca ctaaatcaga tcattatcca ttcagcttct ccttcacttcttctcctcta ctttggaaaa aaggtaagaa tctcagatat aatttcagtg tatctg
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，其特征在于所述的DNA接頭片段位于乳腺組織特異性表達(dá)調(diào)控序列下游，其堿基序列為5′CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC3′
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，其特征在于將所述的目的基因克隆入表達(dá)載體pMRPA后，目的基因表達(dá)載體以生理鹽水溶液直接注射到山羊乳腺，在注射后3小時～10天內(nèi)目的基因可于乳汁中高效表達(dá)出目的蛋白，產(chǎn)物表達(dá)量為～50mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，其特征在于所述的處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺為產(chǎn)羔10-20天后。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效快速的真核蛋白表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，由兩部分組成即山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體和處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺。其中山羊乳腺組織特異性表達(dá)載體質(zhì)粒pMRPA以特定長度的山羊β－酪蛋白啟動子序列為主要元件構(gòu)成；克隆在該載體中的目的基因，以生理鹽水溶液形式，并以直接注射的方式導(dǎo)入處于穩(wěn)定泌乳期的山羊乳腺后，目的基因產(chǎn)物即可在羊奶中表達(dá)，且具有表達(dá)快速、水平高、持續(xù)時間長的特點。
文檔編號C12N15/67GK1514001SQ0311129
公開日2004年7月21日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者扈榮良, 徐青, 張守峰 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所, 中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究