專利名稱：：改良的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的改良表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)重組多肽。另外，本發(fā)明通過(guò)改善的表達(dá)調(diào)節(jié)提供了宿主細(xì)胞中改善的重組蛋白生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：使用細(xì)菌細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)用于治療的蛋白在商業(yè)上越來(lái)越受到關(guān)注。發(fā)展細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的目的之一是為了快速、有效、和大量地產(chǎn)生高質(zhì)量目標(biāo)多肽。這種表達(dá)系統(tǒng)的理想宿主細(xì)胞應(yīng)該是可以有效使用碳源來(lái)產(chǎn)生目標(biāo)多肽，在發(fā)酵過(guò)程中快速地達(dá)到高細(xì)胞密度，僅僅在誘導(dǎo)的時(shí)候表達(dá)目標(biāo)多肽，并且可以在沒(méi)有進(jìn)行調(diào)整和環(huán)境控制的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在生產(chǎn)杰出宿主細(xì)胞的時(shí)候存在很多的障礙。首先，為了生產(chǎn)重組多肽，需要將編碼目標(biāo)蛋白的表達(dá)載體插入到宿主細(xì)胞中。許多細(xì)胞能夠回復(fù)到?jīng)]有轉(zhuǎn)染的狀態(tài)，在其中表達(dá)載體是從宿主中消除的。這種回復(fù)會(huì)降低產(chǎn)生所需重組多肽的發(fā)酵過(guò)程的效率。編碼目標(biāo)蛋白的表達(dá)載體典型地在載體中包括選擇標(biāo)記。通常，這種選擇標(biāo)記是基因其表達(dá)產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中是存活所需要的。缺乏選擇標(biāo)記的宿主細(xì)胞，例如回復(fù)體，是不能存活的。在發(fā)酵過(guò)程中選擇標(biāo)記的使用是為了保證只有含有表達(dá)載體的細(xì)菌可以存活，消除回復(fù)體和轉(zhuǎn)染體之間的競(jìng)爭(zhēng)并且降低發(fā)酵效率。最經(jīng)常使用的選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。細(xì)胞在添加了抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該抗生素可被選擇的抗生素抗性基因產(chǎn)品降解。那些不含有具有抗生素抗性基因的表達(dá)載體的細(xì)胞被抗生素殺死。典型的抗生素抗性基因包括四環(huán)素，新霉素，卡那霉素，和氨芐青霉素。但是細(xì)菌宿主細(xì)胞中抗生素抗性基因的存在帶來(lái)了環(huán)境的，調(diào)控的，和商業(yè)的問(wèn)題。例如，包含抗生素抗性基因的產(chǎn)品(通過(guò)使用抗生素抗性基因生產(chǎn)的產(chǎn)品)已經(jīng)被認(rèn)為對(duì)于環(huán)境、人類和動(dòng)物的健康具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。例如，參考M.Droge等人的，作為生物安全性課題的水平基因轉(zhuǎn)移公眾關(guān)心的一種自然現(xiàn)象(HorizontalGeneTransferasaBiosafetyissueAnaturalphenomenonofpublicconcern)，J.Biotechnology.64(1)75-90(9月17日.1998)；Gallagher，D.M.，和D.P.Sinn.1983，在低血壓感覺(jué)麻痹的情況下由青霉素引起的患者的過(guò)敏反應(yīng)(Penicillin-inducedanaphylaxisinapatientunderhypotensiveanaesthesia)，OralSurgOralMed.OralPathol.56361-364；Jorro，G.，C.Morales，J.V.Braso，和A.Pelaez.1996?？股氐倪^(guò)敏反應(yīng)(Anaphylaxistoerythromycin)。Ann.AllergyAstthmaImmunol.77456-458；F.Gebhard&K.Smalla，利用轉(zhuǎn)基因甜菜DNA對(duì)Acinetobactersp.strainBD413的轉(zhuǎn)染(TransformationofAcinetobactersp.strainBD413bytransgenicsugarbeetDNA)，Appl.&Environ.Microbiol.64(4)1550-54(Apr.1998)；T.Hoffmann等人，在與轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)菌株混合培養(yǎng)后野生黑曲霉菌獲得的外源DNA序列(ForeignDNAsequencesarereceivedbyawildtypestrainofAspergillusnigerafterco-culturewithtransgenichigherplants)，Curr.Genet.27(1)70-76(Dec.1994)；DKMercer等人，游離DNA的命運(yùn)以及由人類唾液質(zhì)粒DNA對(duì)鏈球菌gordonoiiDL1進(jìn)行的轉(zhuǎn)化(FateoffreeDNAandtransformationoftheoralbacteriumStreptococcusgordonoiiDL1byplasmidDNAinhumansaliva)，Appl.&Environ.Microbiol.65(1)6-10(Jan1999)；R.Schubbert等人，被小鼠吸收的外源(M13)DNA通過(guò)小腸壁粘膜到達(dá)了外周血、脾臟和肝臟并且可以與小鼠DNA共價(jià)結(jié)合(Foreign(M13)DNAingestedbymicereachesperipheralleukocytes，spleen，andliverviatheintestinalwallmucosaandcanbecovalentlylinkedtomouseDNA)，PNASUSA94961-66(Feb.4，1997)，和AASalyers，哺乳動(dòng)物腸道中的基因轉(zhuǎn)移(Genetransferinthemammalianintestinaltract)，Curr.Opin.inBiotechnol.4(3)294-98(Jun1993)。作為這些論題的結(jié)果，許多政府的食品、藥品、健康、和環(huán)境管理機(jī)構(gòu)，以及許多最后的使用者，要求抗生素抗性基因核酸從產(chǎn)品中除去或者在商業(yè)使用的有機(jī)體中不存在。另外，要求必須證明所選擇的抗生素從最終產(chǎn)品中的消除證據(jù)，以確保制消除調(diào)控。英國(guó)，加拿大，法國(guó)，歐共體，以及美國(guó)都已經(jīng)標(biāo)記了食品、動(dòng)物飼料、藥物和藥物產(chǎn)品中抗生素抗性基因的使用，包括重組藥物產(chǎn)品。這些物質(zhì)的消除，以及特別是證明這種消除，是非常昂貴的，費(fèi)時(shí)的，并且通常僅僅是最低限度地有效的。因?yàn)檫@些在使用的用于抗生素抗性基因來(lái)對(duì)重組多肽產(chǎn)品進(jìn)行選擇過(guò)程中，已經(jīng)研究出了可以替換的選擇方法。營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記已經(jīng)在一些系統(tǒng)中用來(lái)代替抗生素選擇標(biāo)記。例如，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記已經(jīng)在酵母中廣泛地使用，因?yàn)楹艽蟪潭壬峡股乜剐赃x擇標(biāo)記在這些宿主細(xì)胞中是無(wú)效的。參考，例如，JTPronk，(2002)“機(jī)理和應(yīng)用研究中的營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母菌株(Auxotrophicyeaststrainsinfundamentalandappliedresearch)，”App.&Envirn.Micro.68(5)2095-2100，Boeke等人，(1984)“在酵母種缺少orotodine-5′-磷酸脫羧酶活性的陽(yáng)性選擇突變株，5-fluoro-orotic酸抗性(Apositiveselectionformutantslackingorotodine-5′-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast；5-fluoro-oroticacidresistance)，”Mol.Gen.Genet.197345-346，Botstein&Davis，(1982)“利用酵母的重組DNA的原理和應(yīng)用(PrinciplesandpracticeofrecombinantDNAresearchwithyeast)，”p.607-636，inJNStrathem，EWJones。和JRBroach(ed.)，啤酒酵母細(xì)胞的分子生物學(xué)，代謝和基因表達(dá)(ThemolecularbiologyoftheyeastSaccharomycescerevisiae，Metabolismandgeneexpression)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，Cost&Boeke，(1996)“與酵母選擇的/相反地選擇的標(biāo)記MET15有關(guān)的有效克隆顯色(Ausefulcolonycolorphenotypeassociatedwiththeyeastselectable/counterselectablemarkerMET15)，”Yeast12939-941。但是，酵母表達(dá)系統(tǒng)沒(méi)有預(yù)期的為生產(chǎn)細(xì)菌系統(tǒng)產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白提供潛在的速度和效率。在細(xì)菌中營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇同樣也已經(jīng)公開(kāi)了。參考，例如，美國(guó)專利Nos.4,920,048；5,691,185；6,291,245；6,413,768；6,752,994，Struhl等人，(1976)PNASUSA73；1471-1475，MacCormick，C.A.等人，(1995)“基于乳糖操縱子的乳球菌食品級(jí)宿主/載體系統(tǒng)的構(gòu)建(Constructionofafood-gradehost/vectorsystemforLactococcuslactisbasedonthelactoseoperon)，”FEMSMicrobiol.Lett.127105-109，Dickely等人，(1995)，“乳球菌無(wú)效抑制物的分離和食品級(jí)克隆載體的構(gòu)建(IsolationofLactococcuslactisnonsensesuppressorsandconstructionofafood-gradecloningvector)，”Mol.Microbiol.15839-847，Srensen等人，(2000)“乳球菌工業(yè)菌株的食品級(jí)克隆系統(tǒng)(Afood-gradecloningsystemforindustrialstrainsofLactococcuslactis)，”Appl.Environ.Microbiol.661253-1258，F(xiàn)iedler&Skerra，(2001)“營(yíng)養(yǎng)學(xué)缺陷型大腸桿菌菌株的proBA互補(bǔ)體在重組抗體片段的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中改良了質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達(dá)產(chǎn)量(proBAcomplementationofanauxotrophicE.colistrainimprovesplasmidstabilityandexpressionyieldduringfermenterproductionofarecombinantantibodyfragment)，”Gene274111-118。在前面描述的商業(yè)領(lǐng)域的細(xì)菌發(fā)酵系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的使用具有缺陷因此限制了它們的使用。一個(gè)主要的缺陷，如在美國(guó)專利NO.6,413,768中所提到的，是營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記系統(tǒng)通常經(jīng)歷了交叉?zhèn)鬟f。術(shù)語(yǔ)交叉?zhèn)鬟f(cross-feeding)是指第一個(gè)細(xì)胞的能力，其對(duì)于一個(gè)特定的代謝物是有缺陷的，為了在缺乏這種代謝物的情況下存活就需要從它的環(huán)境中獲得那種代謝物的補(bǔ)償，特別是，來(lái)自培養(yǎng)基通過(guò)使用代謝物的分泌中間物，代謝物自身，或者一種由第二個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生原養(yǎng)型能力這種細(xì)胞對(duì)于其是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，其對(duì)于這種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中所缺乏的代謝物是原養(yǎng)型的。也可以參考GRBarker等人，Biochem.J.157(1)221-27(1976)(大腸桿菌中胸苷的交叉?zhèn)鬟f)(crossfeedingofthymineinE.coli)；TJKerr&GJTritz，J.Bact.115(3)982-86(Sep.1973)(對(duì)于NAD合成是營(yíng)養(yǎng)缺陷的大腸桿菌中NAD的交叉?zhèn)鬟f)(crossfeedingofNADinE.coliauxotrophicforNADsynthesis)；GASprenger等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.37(3)299-304(1986)(選擇萘啶酮酸來(lái)防止交叉?zhèn)鬟f問(wèn)題)(selectionofnalidixicacidtoavoidthecrossfeedingproblem)。因?yàn)榻徊鎮(zhèn)鬟f使回復(fù)的細(xì)菌可以存活，交叉?zhèn)鬟f降低了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程有效和最大水平產(chǎn)生所需產(chǎn)品的能力因?yàn)榭梢援a(chǎn)生目標(biāo)蛋白的宿主細(xì)胞很少。表達(dá)載體控制產(chǎn)生理想的宿主細(xì)胞的另一個(gè)障礙是發(fā)酵過(guò)程中多肽產(chǎn)生的低效率和低水平?？刂颇繕?biāo)蛋白的表達(dá)直到達(dá)到了理想的宿主細(xì)胞密度和發(fā)酵條件這樣可以實(shí)現(xiàn)多肽的更有效和更大產(chǎn)量的生產(chǎn)。這一現(xiàn)象的原因有幾個(gè)，包括對(duì)特定碳源的充足供應(yīng)和宿主細(xì)胞長(zhǎng)期代謝壓力的減輕。但是，在很多情況下，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中對(duì)于目標(biāo)蛋白表達(dá)的抑制是有缺點(diǎn)的，在特定的誘導(dǎo)階段之前就產(chǎn)生了大量的表達(dá)產(chǎn)物。這一“漏掉的”抑制源于宿主細(xì)胞壓力，碳源供應(yīng)不足因?yàn)榇x能量被從正常的細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因了，以及延遲到達(dá)理想的細(xì)胞密度誘導(dǎo)點(diǎn)，產(chǎn)生了更為冗長(zhǎng)的和昂貴的發(fā)酵運(yùn)行，并且通常，降低的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的改良表達(dá)系統(tǒng)，其中這種生產(chǎn)是高效的、可控制的，并且在一種將控制因素和環(huán)境因素最小化的培養(yǎng)基中進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的改良表達(dá)系統(tǒng)中用作宿主細(xì)胞的生物體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改良目標(biāo)蛋白生產(chǎn)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的改良表達(dá)系統(tǒng)中使用的新構(gòu)建體和核酸。
發(fā)明內(nèi)容已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌蛋白生產(chǎn)可以通過(guò)選擇假單胞菌作為宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行改良，該假單胞菌可以是非抗生素抗性的，營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇，和/或包含lacI基因或其衍生物的染色體插入片段。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)假單胞菌生物體熒光假單胞菌特別適合這一目的。對(duì)于這一結(jié)果，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌在重組多肽的高細(xì)胞密度發(fā)酵過(guò)程中使用營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記的情況下不表現(xiàn)出相反的交叉?zhèn)鬟f抑制。這一發(fā)現(xiàn)使得營(yíng)養(yǎng)缺陷型熒光假單胞菌作為宿主細(xì)胞可以在高水平重組多肽的高效生產(chǎn)中使用，克服了由于使用抗生素抗性選擇標(biāo)記的存在的缺陷以及出現(xiàn)在其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)缺陷交叉?zhèn)鬟f的問(wèn)題。還驚奇地發(fā)現(xiàn)在假單胞菌(Pseudomonas)中LacI-編碼基因的使用不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子驚奇地產(chǎn)生了對(duì)誘導(dǎo)前的重組蛋白表達(dá)的充分的改良抑制，商業(yè)領(lǐng)域發(fā)酵中更高的細(xì)胞密度，所需產(chǎn)品的更高的產(chǎn)率與先前教導(dǎo)的lacI-lacZYA假單胞菌染色體插入相比(美國(guó)專利No.5,169,760)。這一lacI插入可以有效地抑制Plac-Ptac家族啟動(dòng)子-控制的轉(zhuǎn)基因其作為多拷貝質(zhì)粒在熒光假單胞菌中編碼lacI抑制蛋白，從而消除了對(duì)細(xì)胞中編碼lacI抑制蛋白的單獨(dú)質(zhì)粒進(jìn)行維持的需要并且減少了由于這種維持而產(chǎn)生的潛在的生產(chǎn)的低效率。還發(fā)現(xiàn)雙lacI操縱基因序列的使用為誘導(dǎo)前的重組蛋白表達(dá)提供了更好的抑制作用而沒(méi)有相應(yīng)的引發(fā)后續(xù)的熒光假單胞菌誘導(dǎo)產(chǎn)量的降低。因此，本發(fā)明一方面，提供假單胞菌生物體作為宿主細(xì)胞用于改良的蛋白生產(chǎn)。一實(shí)施方案中，假單胞菌生物體已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)誘導(dǎo)一種營(yíng)養(yǎng)缺陷。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。一實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型是基因修飾的結(jié)果對(duì)于至少一種含氮堿基化合物(nitrogenousbasecompound)生物合成基因，或者至少一種氨基酸生物合成基因。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因修飾是對(duì)一種在尿嘧啶生物合成路徑中的，胸苷生物合成途徑的，或者脯氨酸生物合成途徑的具有活性的酶的編碼基因進(jìn)行的遺傳修飾。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因修飾是針對(duì)編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶的pyrF基因的，編碼胸苷酸合成酶的thyA基因的，或者編碼Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶的proC基因的。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了假單胞菌生物體，其已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)提供插入到染色體中的至少一個(gè)拷貝的LacI-編碼基因，與作為整體一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子不同。優(yōu)選實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。一實(shí)施方案中，假單胞菌包括天然的編碼lacI抑制蛋白的大腸桿菌lacZ基因。另一實(shí)施方案中，假單胞菌細(xì)胞含有l(wèi)acIQ基因。另一實(shí)施方案中，假單胞菌細(xì)胞包括lacIQI基因。另一實(shí)施方案中，提供的假單胞菌生物體包含核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含核酸，該核酸含有至少一個(gè)在轉(zhuǎn)基因表達(dá)抑制中應(yīng)用的lacO序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括多于一個(gè)的lacO序列。另一實(shí)施方中，核酸構(gòu)建體包括至少一個(gè)，并且優(yōu)選多于一個(gè)的，lacOid序列。一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)架體包括lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族啟動(dòng)子的3’端，以及l(fā)acO序列，或其衍生物，位于Plac家族啟動(dòng)子的5’端。一特定實(shí)施方案中，lacO的衍生物是lacOid序列。進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了假單胞菌生物體其進(jìn)行了基因修飾從而引起了一種營(yíng)養(yǎng)缺陷并且進(jìn)一步修飾來(lái)包含一種染色體插入一種天然的大腸桿菌lcaI基因，lcaIQ基因，或者lcaIQI基因而不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。另一實(shí)施方案中，假單胞菌生物體進(jìn)一步修飾包括一種核酸構(gòu)建體其包括至少一種與抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)有關(guān)的lacO序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。本發(fā)明的另一方面，為改良的蛋白生產(chǎn)提供了所使用的核酸序列。一實(shí)施方案中，給出了在營(yíng)養(yǎng)缺陷型假單胞菌宿主細(xì)胞中使用的編碼原養(yǎng)型回復(fù)酶(prototrophy-restoringenzyme)的核酸序列。特定實(shí)施方案中，給出了從熒光假單胞菌生物體中純化的編碼含氮堿基化合物生物合成酶的核酸序列。一實(shí)施方案中，給出了在熒光假單胞菌中編碼pyrF基因的核酸序列(SEQ.IDNo.s1和3)。另一實(shí)施方案中，給出了在熒光假單胞菌中編碼thyA基因的核酸序列(SEQ.ID.No.4)。另一實(shí)施方案中，給出了從熒光假單胞菌生物體中純化的編碼一種氨基酸生物合成化合物的核酸序列。特定實(shí)施方案中，給出了在熒光假單胞菌中編碼proC基因的核酸序列(SEQ.IDNo.s6和8)。另一方面，本發(fā)明產(chǎn)生了新的氨基酸序列其是由新的核酸表達(dá)的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面，給出了在改良的多肽生產(chǎn)中使用的核酸構(gòu)建體。一實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞的核酸構(gòu)建體包括a)編碼重組多肽的核酸序列，和b)給出了編碼原養(yǎng)型-啟動(dòng)酶(prototrophy-enablingenzyme)的核酸序列。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括c)一種Plac-ptac家族啟動(dòng)子。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括d)至少一種lacO序列，或其衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的3’端。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括e)至少一種lacO序列，或其衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的5’端。一實(shí)施方案中，衍生的lacO序列的可以是lacOid序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體為熒光假單胞菌。本發(fā)明的一實(shí)施方案中，給出的用作假單胞菌生物體表達(dá)載體的核酸構(gòu)建體包括a)編碼一種重組多肽的核酸序列，b)Plac-Ptac家族啟動(dòng)子，c)至少一種lacO序列，或衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的3’端，d)至少一種lacO序列，或者衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的5’端。一實(shí)施方案中，衍生的lacO序列可以是lacOid序列。一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括e)一種在營(yíng)養(yǎng)缺陷型假單胞菌細(xì)胞中使用的原養(yǎng)型能力(prototrophy-enabling)選擇標(biāo)記。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。在本發(fā)明的另一方面，給出了在改良的蛋白生產(chǎn)中使用的修飾的細(xì)胞。一實(shí)施方案中，給出的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的假單胞菌細(xì)胞其具有一個(gè)核酸構(gòu)建體包含i)一個(gè)重組的多肽，和ii)一個(gè)原養(yǎng)型能力核酸。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括iii)一個(gè)Plac-Ptac家族啟動(dòng)子。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括iv)多于一個(gè)lacO序列。一實(shí)施方案中，假單胞菌是一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型的熒光假單胞菌細(xì)胞。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型的假單胞菌生物體，包括熒光假單胞菌，其已經(jīng)進(jìn)一步基因修飾成包含一種在染色體插入天然的大腸桿菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因，其不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。另一實(shí)施方案中，給出的假單胞菌細(xì)胞包括一種lacI轉(zhuǎn)基因，或其衍生物，不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子，插入到染色體中，以及b)一種核酸構(gòu)建體包括i)重組的多肽，以及ii)Plac-Ptac家族啟動(dòng)子。另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括iii)至少一種lacO序列，并且優(yōu)選，多于一種lacO序列。一實(shí)施方案中，lacO序列是一種lacOid序列。一實(shí)施方案中，假單胞菌已經(jīng)進(jìn)一步修飾成為誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的。一實(shí)施方案中，假單胞菌細(xì)胞是熒光假單胞菌。在本發(fā)明的一個(gè)方面，給出了在改良的蛋白生產(chǎn)中使用的重組多肽表達(dá)方法。一實(shí)施方案中，方法給出了核酸構(gòu)建體的表達(dá)，該核酸構(gòu)建體包括的編碼a)一種重組多肽，和b)在假單胞菌中一種原養(yǎng)型-回復(fù)酶其對(duì)于至少一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的核酸?？商鎿Q實(shí)施方案中，假單胞菌對(duì)于多于一種的代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。一實(shí)施方案中，假單胞菌是熒光假單胞菌細(xì)胞。特定實(shí)施方案中，在假單胞菌中表達(dá)的重組的多肽是對(duì)于一種代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷，或者代謝物的組合，選自含氮堿基化合物或氨基酸。一更特定實(shí)施方案中，重組多肽在對(duì)于選自尿嘧啶，脯氨酸，或胸苷的代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌中表達(dá)。另一實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以是通過(guò)分別敲除宿主的pyrF，proC，或者thyA基因來(lái)實(shí)現(xiàn)?？商鎿Q實(shí)施方案中，重組的多肽是在一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)的，其已經(jīng)通過(guò)插入不同于作為PlacI-lacI-lacZYA操縱子的一部分，天然的大腸桿菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因，到宿主細(xì)胞的染色體中進(jìn)行了基因修飾。特定實(shí)施方案中，載體包含重組的多肽其在包括至少一種lacOid操縱基因序列的營(yíng)養(yǎng)缺陷型中表達(dá)。特定實(shí)施方案中，載體包含重組的多肽在包括至少兩種lacOid操縱基因序列或其衍生物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型中表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)施方案中，重組的多肽通過(guò)Plac家族啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)。另一實(shí)施方案中，方法包括使用假單胞菌宿主細(xì)胞，其已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)提供至少一個(gè)拷貝的LacI編碼基因插入到假單胞菌宿主細(xì)胞的染色體中，其中l(wèi)acI編碼基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子的部分。一實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因是天然的大腸桿菌的lacI基因。一實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因是lacIQ基因。另一實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因是lacIQI基因。特定實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。另一實(shí)施方案中，假單胞菌是進(jìn)一步基因修飾的來(lái)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。另一實(shí)施方案中，方法產(chǎn)生的重組多肽水平為至少大約3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L或至少大約10g/L。另一實(shí)施方案中，重組多肽的表達(dá)水平在3/L到100g/L之間。圖1是使用pyrF標(biāo)記的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的熒光假單胞菌的實(shí)施情況(△和□)和僅僅使用抗生素抗性標(biāo)記的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的熒光假單胞菌的實(shí)施情況(◆)的比較。給出的所有數(shù)據(jù)是9-平行樣的平均值，典型的20-L發(fā)酵，在中間-指數(shù)期加入了IPTG來(lái)誘導(dǎo)目標(biāo)酶的表達(dá)。上面一組的三條線表示相應(yīng)的細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)，其從左側(cè)豎直坐標(biāo)軸上讀出數(shù)據(jù)。下面一組的三條線表示在相關(guān)發(fā)酵中產(chǎn)生的目標(biāo)酶的相應(yīng)的酶活性數(shù)據(jù)，從右側(cè)豎直坐標(biāo)軸上讀出數(shù)據(jù)。◆-含有pMYC質(zhì)粒的熒光假單胞菌，具有一個(gè)tac啟動(dòng)子-控制的目標(biāo)酶表達(dá)盒以及一個(gè)四環(huán)素抗性標(biāo)記基因并包括一個(gè)具有l(wèi)acI抑制子表達(dá)盒和一個(gè)卡那霉素抗性標(biāo)記基因的pCN質(zhì)粒。所示的方差線(variancebar)對(duì)這些數(shù)據(jù)點(diǎn)(n＝4)，并且代表了在不同的發(fā)酵運(yùn)行過(guò)程中這種表達(dá)系統(tǒng)中所代表性地觀察到的常態(tài)方差(normalvariance)?！?具有非活性的基因組pyrF的熒光假單胞菌菌株包含pMYC質(zhì)粒，其具有一個(gè)tac啟動(dòng)子-控制的目標(biāo)酶表達(dá)盒和pyrF營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因和包含具有l(wèi)acI抑制表達(dá)盒和卡那霉素抗性標(biāo)記基因的pCN質(zhì)粒?！?具有非活性的基因組pyrF和proC的熒光假單胞菌菌株，包含pMYC質(zhì)粒其具有一個(gè)tac啟動(dòng)子-控制的目標(biāo)酶表達(dá)盒和pyrF營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因和包含具有l(wèi)acI抑制表達(dá)盒和proC營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因的pCN質(zhì)粒。圖2是質(zhì)粒pDOW1249-2的圖譜。圖3是質(zhì)粒pDOW1269-2的圖譜。圖4是lac操縱基因構(gòu)建體的示意圖。LacZ給出了天然的大腸桿菌lacO序列的位置。tacDC239，DC240給出了天然的大腸桿菌lac操縱基因在包括tac操縱基因和腈水解酶編碼核酸的構(gòu)建體上的位置。OptlacODC281是lacOid操縱基因序列在包括tac啟動(dòng)子和腈水解酶編碼核酸的構(gòu)建體上的位置。雙lacODC262給出了在構(gòu)建體上的tac啟動(dòng)子的lacOid操縱基因序列的5’端，以及野生型lac啟動(dòng)子序列3’端的位置該構(gòu)建體進(jìn)一步包括腈水解酶編碼核酸。圖5給出了含有l(wèi)acI整合體的菌株在搖瓶基因表達(dá)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)累積的LacI蛋白的Western印跡分析(UnBlot)。肉湯樣品在OD600進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)合LDSNuPAGE樣品緩沖液(Invitrogen)，50mMDTT并且在95℃加熱40分鐘，然后簡(jiǎn)單離心。取20μL樣品放入10％，1mmNuPAGEBis-Tris膠中在內(nèi)室中具有抗氧化劑的條件下在MOPS中走膠。LacI蛋白的檢測(cè)是通過(guò)原膠(in-gel)雜交方法(″UnBlot″，Pierce)完成的，對(duì)LacI使用1∶1000的多克隆兔子抗體(Stratagenecat.no.217449-51)以及第二種抗體，1∶500的穩(wěn)定山羊抗-兔子辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗體(Pierce)。按照UnBlot試劑盒用UnBlot穩(wěn)定過(guò)氧化物和UnBlot發(fā)光氨增強(qiáng)劑一起顯現(xiàn)辣根過(guò)氧化物酶。圖6給出了DC140，DC239和DC240的腈水解酶組合物的圖。數(shù)據(jù)是在從DC140(n＝5)，DC239(n＝5)到DC240(n＝4)的運(yùn)行進(jìn)行編輯的。DC140是■來(lái)表示。DC239以□來(lái)表示。DC240以□來(lái)表示。發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)行超過(guò)48小時(shí)。具體實(shí)施例方式一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌生物體已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)引起一種營(yíng)養(yǎng)缺陷。特定的實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。一個(gè)實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷是對(duì)于至少一種含氮堿基化合物的生物合成基因，或者至少一種氨基酸生物合成基因修飾的結(jié)果。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因修飾是對(duì)一種編碼在尿嘧啶生物合成途徑中的，胸苷生物合成途徑中的，或者脯氨酸生物合成途徑中的具有活性的酶的基因的修飾。更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因修飾是針對(duì)編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶的pyrF基因，編碼胸苷酸(thymidilate)合成酶的thyA基因，或者編碼Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶的proC的基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的假單胞菌生物體是已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾的以提供插入到染色體中的至少一個(gè)拷貝的LacI-編碼基因，不同于作為PlacI-lacI-lacZYA操縱子的一部分。特定的實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌包含一個(gè)天然的編碼lacI抑制蛋白的大腸桿菌lacI基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌細(xì)胞包含lacIQ基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌細(xì)胞包含lacIQI基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，提供的假單胞菌生物體包含一個(gè)核酸構(gòu)建體，其包括一個(gè)包含至少一個(gè)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)抑制有關(guān)的lacO序列的核酸其。特定的實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括多于一個(gè)的lacO序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包括至少一個(gè)，優(yōu)選多于一個(gè)，lacOid序列。一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族啟動(dòng)子的3’端，以及l(fā)acO序列，或其衍生物，位于Plac家族啟動(dòng)子的5’端。在特定的實(shí)施方案中，lacO的衍生物是lacOid序列。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的假單胞菌生物體已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)引起一種營(yíng)養(yǎng)缺陷并且進(jìn)一步修飾，以使染色體含有插入的不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子的天然的大腸桿菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌生物體進(jìn)一步修飾包含一種核酸構(gòu)建體其含有至少一個(gè)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)抑制有關(guān)的lacO序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。本發(fā)明所提供的用于生產(chǎn)重組多肽的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞可以選自“假單胞菌和接近的相關(guān)細(xì)菌”或者選自它們的亞群，如下面所說(shuō)明的。一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自假單胞菌的屬。特定實(shí)施方案中，特定的假單胞菌的種為熒光假單胞菌。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌生物型A或者生物變型I。定義術(shù)語(yǔ)“分離的”是指核酸、蛋白、或者多肽其與其它的物質(zhì)組分是充分地或者基本上地分開(kāi)的，例如，那些組分可以是細(xì)胞成分。術(shù)語(yǔ)“片段”是指一種核酸、蛋白、或者多肽的一部分或者部分的序列。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“總細(xì)胞蛋白百分比”是指宿主細(xì)胞中蛋白或者多肽的含量占細(xì)胞總蛋白的百分?jǐn)?shù)。術(shù)語(yǔ)“可操作的結(jié)合”，如這里所使用的，是指任意的結(jié)構(gòu)其中轉(zhuǎn)錄的和任意的翻譯的調(diào)控元件是以這樣的方式(insuchdisposition(s))共價(jià)地連接到編碼序列上，即對(duì)于編碼序列，按照或者通過(guò)宿主細(xì)胞的行為，調(diào)控元件可以指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)缺陷的”，如這里所使用的，是指對(duì)于一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了修飾來(lái)消除或者減少它的生產(chǎn)生長(zhǎng)和代謝所需要的特定物質(zhì)的能力。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“總細(xì)胞蛋白百分比”是指總細(xì)胞蛋白的一部分的測(cè)量，其代表了該細(xì)胞表達(dá)的給定蛋白的相對(duì)含量。術(shù)語(yǔ)“原養(yǎng)型”，如這里所使用的，是指一個(gè)細(xì)胞其可以生產(chǎn)一種生長(zhǎng)和代謝所需的特定的物質(zhì)。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“同源的”意味著i)一種蛋白或者肽，其具有與一種給定的原始的蛋白或者肽的序列基本相同的一個(gè)氨基酸序列(也就是說(shuō)，至少70，75，80，85，90，95，或者98％)并且保持原始的蛋白的或者肽的所需功能或者ii)一種核酸其具有與一種給定的核酸序列基本相同的一個(gè)核酸序列(也就是說(shuō)，至少70，75，80，85，90，95，或者98％)并且保持原始的核酸序列所需的功能。在本發(fā)明和公開(kāi)內(nèi)容的所有實(shí)施方案中，任意的所公開(kāi)的蛋白，肽或者核酸可以被保持所需的功能的同源的或者基本相同的蛋白，肽或者核酸所代替。在本發(fā)明和公開(kāi)內(nèi)容的所有實(shí)施方案中，當(dāng)公開(kāi)任意一種核酸的時(shí)候，應(yīng)該認(rèn)為這種發(fā)明也包括與公開(kāi)的核酸雜交的所有核酸。一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，同源的多肽的不同的氨基酸序列可以是表1中所示的15種保守或者半保守組中的任意一種氨基酸。表1.相似氨基酸替代組這里給出的氨基酸序列使用下面的縮寫形式表示。I.選擇假單胞菌和相關(guān)的細(xì)菌作為宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了假單胞菌和相關(guān)細(xì)菌作為蛋白改良生產(chǎn)中宿主細(xì)胞的用途。營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇效率已經(jīng)發(fā)現(xiàn)假單胞菌具有利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記來(lái)保持蛋白表達(dá)質(zhì)粒而沒(méi)有其它系統(tǒng)所具有的顯著缺陷例如質(zhì)粒的不穩(wěn)定性和交叉?zhèn)鬟f的能力。營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，在其它的的宿主細(xì)胞系統(tǒng)中，通常不足以保持所有細(xì)胞中的質(zhì)粒，特別是在發(fā)酵過(guò)程中丟失質(zhì)粒會(huì)帶給質(zhì)粒-減少細(xì)胞一種選擇優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致了非生產(chǎn)性細(xì)胞大量的聚集，減少了產(chǎn)品的形成。這種回復(fù)的菌株如果具有從原養(yǎng)型能力細(xì)菌交叉?zhèn)鬟f營(yíng)養(yǎng)缺陷代謝物的能力就會(huì)非常的麻煩。例如，在一個(gè)大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷體中的質(zhì)粒上使用trp操縱子就不足以防止大量質(zhì)粒-減少細(xì)胞的累積，直到在valSts宿主中與valS基因(編碼纈氨酰t-RNA合成酶)結(jié)合(Skogman，S.G.；Nilsson，J.，(大腸桿菌中色氨酸-操縱子-承受質(zhì)粒的溫度-依賴保持力)Temperature-dependentretentionofatryptophan-operon-bearingplasmidinEscherichiacoli.Gene1984，31，(1-3)，117-22)。大概，含有質(zhì)粒上包含trp操縱子的細(xì)胞分泌了足夠的色氨酸或者相關(guān)的分子從而允許質(zhì)粒減少的細(xì)胞存活。同樣，在leu2變異酵母中的木糖醇還原酶生產(chǎn)質(zhì)粒上使用LEU2基因產(chǎn)生了質(zhì)粒的丟失，批次發(fā)酵培養(yǎng)中高達(dá)80％是由沒(méi)有生產(chǎn)質(zhì)粒的細(xì)胞組成的，因?yàn)榱涟彼崾怯少|(zhì)粒-含有細(xì)胞分泌到發(fā)酵液中的(Meinander，N.Q.；Hahn-Haegerdal，B.，使用葡萄糖作為輔助底物，具有不同XYL1表達(dá)水平的兩種重組酵母菌株的批次木糖醇生產(chǎn)生產(chǎn)數(shù)據(jù)和菌株能力的比較(Fed-batchxylitolproductionwithtworecombinantSaccharomycescerevisiaestrainsexpressingXYL1atdifferentlevels，usingglucoseasacosubstrateacomparisonofproductionparametersandstrainstability.)BiotechnologyandBioengineering1997，54，(4)，391-399)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pf)不表現(xiàn)出在其它宿主細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的與交叉?zhèn)鬟f有關(guān)的內(nèi)在問(wèn)題，例如，在大腸桿菌和酵母中發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)不能被任意特定的原理進(jìn)行解釋的時(shí)候，營(yíng)養(yǎng)缺陷的熒光假單胞菌被認(rèn)為是特別適合用作宿主細(xì)胞的生物體因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了在一種包含了營(yíng)養(yǎng)缺陷的代謝物的培養(yǎng)基上，熒光假單胞菌營(yíng)養(yǎng)缺陷體細(xì)胞不能與含有原養(yǎng)型能力質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)缺陷的細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)，表示了熒光假單胞菌營(yíng)養(yǎng)缺陷體不能輸入這種需要的代謝物的先天的缺陷。因此，丟失了選擇標(biāo)記的質(zhì)粒的熒光假單胞菌細(xì)胞不能獲得具有這種選擇標(biāo)記的熒光假單胞菌細(xì)胞的選擇優(yōu)勢(shì)，即使在提供了附加的代謝物的情況下，很大程度上減少了交叉?zhèn)鬟f的潛在作用。因?yàn)檫@種交叉?zhèn)鬟f減少的影響，在發(fā)酵運(yùn)行過(guò)程中重組多肽的產(chǎn)率就不會(huì)因?yàn)榉侵亟M多肽生產(chǎn)細(xì)胞的存在而降低。LacI插入片段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)假單胞菌可以使用一種不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子單拷貝的lacI轉(zhuǎn)基因，，染色體插入來(lái)有效地抑制蛋白的表達(dá)直到被誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始來(lái)自于通過(guò)RNA聚合酶被激活或者通過(guò)結(jié)合或者釋放出一種調(diào)控蛋白而失活從而調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。因此，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括那些參與負(fù)調(diào)控作用的部分(也就是說(shuō)可抑制的啟動(dòng)子)，這里編碼所需目標(biāo)蛋白的基因只有在啟動(dòng)子不含有調(diào)控蛋白(也就是說(shuō)一種“抑制”蛋白)的時(shí)候才被表達(dá)，和那些參與正調(diào)控的部分，這里只有這種啟動(dòng)子被調(diào)控蛋白(也就是說(shuō)一種“激活”蛋白)結(jié)合的時(shí)候基因才進(jìn)行表達(dá)。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中使用的可抑制啟動(dòng)子種類中一種最常用的是Plac基礎(chǔ)(Plac-based)的啟動(dòng)子家族。Plac基礎(chǔ)的啟動(dòng)子家族開(kāi)始于天然的大腸桿菌乳糖操縱子，表示為“l(fā)ac”操縱子，也表示為“l(fā)acZYA”，其調(diào)控是通過(guò)表達(dá)lacI基因來(lái)調(diào)控的。天然的大腸桿菌操縱子是“PlacI-lacI-PlacZ-lacZYA”，其中天然的大腸桿菌Plac啟動(dòng)子是由“PlacZ”來(lái)表示的(也稱為“PlacZYA”)?！癙lacI”表示對(duì)于lacI基因天然的啟動(dòng)子，并且“l(fā)acI”表示編碼lac抑制劑，也就是說(shuō)LacI蛋白的基因。“l(fā)acZYA”表示編碼乳糖利用途徑的操縱子。LacI調(diào)控啟動(dòng)子包括，在其它情況中，天然的大腸桿菌乳糖操縱子啟動(dòng)子(“Plac”)。另外，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了改良的變異，也具有Plac內(nèi)部的啟動(dòng)子(ashaveintrapromoterhybridsofPlac)，例如“Ptac”啟動(dòng)子，“Ptrc”啟動(dòng)子，以及“PtacII”啟動(dòng)子。例如，在大腸桿菌中的Ptac啟動(dòng)子當(dāng)完全抑制的時(shí)候比Plac啟動(dòng)子強(qiáng)3倍。因此，它經(jīng)常用于促進(jìn)大腸桿菌中高水平的調(diào)控基因表達(dá)。但是，當(dāng)Plac啟動(dòng)子被LacI1000倍抑制的時(shí)候，Ptac啟動(dòng)子在相同條件下被僅50倍的抑制(Lanzer，M.&H.Bujard.1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.858973)。大腸桿菌Ptac啟動(dòng)子或者其它的lac相關(guān)啟動(dòng)子的抑制，取決于抑制劑LacI的濃度(DeBoer，etal.，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.7821-25)。如上所述，從抑制中釋放可以通過(guò)加入一種誘導(dǎo)物而出現(xiàn)，其可以減弱抑制劑和它的特定DNA結(jié)合位點(diǎn)的親和力，在這種情況下，是lac操縱基因(lacO)。可以選擇的，降低相應(yīng)于質(zhì)粒上特定DNA結(jié)合位點(diǎn)的摩爾濃度的抑制劑的濃度也可以解除對(duì)于啟動(dòng)子的阻遏。如果lacI基因位于一個(gè)高拷貝數(shù)的克隆質(zhì)粒上，需要大量的誘導(dǎo)物來(lái)啟動(dòng)表達(dá)，因?yàn)樵谶@系統(tǒng)中產(chǎn)生了大量的抑制劑。在商業(yè)的生產(chǎn)系統(tǒng)中，lac抑制劑由特定的基因編碼，其表達(dá)是組成型的，也就是說(shuō)非調(diào)控的，因此提供一種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，在其中編碼所需的目標(biāo)蛋白所需的轉(zhuǎn)基因，是被抑制的直到達(dá)到所需的宿主細(xì)胞生物量或者細(xì)胞濃度。在那時(shí)，被認(rèn)為是誘導(dǎo)物的可以有效地從轉(zhuǎn)基因中分離抑制劑的大量的小分子加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中并且被細(xì)胞所吸收，因此允許轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。在使用lac抑制蛋白的情況下，誘導(dǎo)物可以是乳糖或者一種非代謝的誘導(dǎo)物例如異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(“IPTG”)。所選擇的加入誘導(dǎo)物的時(shí)間點(diǎn)被認(rèn)為是“誘導(dǎo)期”。已經(jīng)確認(rèn)了大量的lac抑制劑基因用于抑制出現(xiàn)在重組多肽表達(dá)載體上的Plac家族啟動(dòng)子。這些包括天然的大腸桿菌lacI基因和/或通過(guò)它們的變體，包括lacIQ和lacIQI基因其編碼相同的lacI蛋白，但是處于一個(gè)更高的表達(dá)水平。例如，lacIQ突變是一個(gè)簡(jiǎn)單的在lacI啟動(dòng)子區(qū)域的-35位點(diǎn)的CG到TA的改變(Calos，M.1978.Nature274762)其導(dǎo)致了大腸桿菌中LacI表達(dá)的10倍的增長(zhǎng)(Mueller-Hill，B.，etal.1968.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.591259)。野生型大腸桿菌細(xì)胞具有10-8M的LacI濃度或者大約每個(gè)細(xì)胞10個(gè)分子，其中99％的蛋白為一種四聚物(Fickert，R.&B.Mueller-Hill1992.J.Mol.Biol.22659)。而含有l(wèi)acIQ突變的細(xì)胞其每個(gè)細(xì)胞包含大約100個(gè)分子或者10-7MLacI。作為結(jié)論，已經(jīng)發(fā)展的大量細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)其中含有Plac家族啟動(dòng)子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因，位于質(zhì)粒中，被維持在宿主細(xì)胞中不同水平地表達(dá)LacI蛋白，因此抑制了所需的轉(zhuǎn)基因直到一種選定的細(xì)胞生長(zhǎng)的“誘導(dǎo)期”。但是，在許多情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中目標(biāo)蛋白的表達(dá)抑制是有缺陷的，因此在特定的誘導(dǎo)期之前就有了大量的表達(dá)。這種“滲漏”導(dǎo)致宿主細(xì)胞的壓力，由于代謝能量已經(jīng)從正常的細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因過(guò)程而不能有效利用碳源，并且延遲達(dá)到理想的細(xì)胞密度誘導(dǎo)點(diǎn)，產(chǎn)生了更為冗長(zhǎng)和昂貴的發(fā)酵運(yùn)行，并且通常，目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量降低了。一個(gè)常用的對(duì)Plac-家族啟動(dòng)子-啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因的改進(jìn)抑制的策略是通過(guò)放置一個(gè)lacI或者lacIQ基因到含有Plac-家族啟動(dòng)子-啟動(dòng)目標(biāo)基因的質(zhì)粒上(例如，參考MJRStarkinGene51255-67(1987)和EAmannetal.inGene301-15(1988))。但是，這通常導(dǎo)致了Lac抑制蛋白的過(guò)度生產(chǎn)，其隨后需要使用更高的誘導(dǎo)物濃度從而回復(fù)轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)水平來(lái)克服重組蛋白生產(chǎn)的降低。此外，使用包含lacI基因的第二個(gè)質(zhì)粒，從包含Plac家族啟動(dòng)子啟動(dòng)目標(biāo)基因的質(zhì)粒分離，需要使用兩個(gè)不同的選擇標(biāo)記基因來(lái)在表達(dá)宿主細(xì)胞中維持兩個(gè)質(zhì)粒一個(gè)選擇標(biāo)記對(duì)應(yīng)于兩個(gè)不同質(zhì)粒中的一個(gè)。第二個(gè)選擇標(biāo)記基因的出現(xiàn)，也就是說(shuō)第二個(gè)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記基因，依次需要使用或者1)在抗生素抗性選擇標(biāo)記基因的情況下一種單獨(dú)的抗生素，其是昂貴的并且從健康/安全調(diào)控的角度來(lái)看是不利的；或者2)一種單獨(dú)的在宿主細(xì)胞染色體中的代謝物缺陷，在營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記基因的情況下，其需要附加的變異宿主細(xì)胞的工作。已經(jīng)驚奇的發(fā)現(xiàn)lacI的插入，不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacl-lacZYA操縱子，可以有效的抑制Plac-Ptac家族啟動(dòng)子-調(diào)控的轉(zhuǎn)基因作為一種在熒光假單胞菌中多拷貝編碼LacI抑制蛋白質(zhì)粒。這一驚奇的發(fā)現(xiàn)消除了對(duì)于細(xì)胞中單獨(dú)的編碼LacI抑制蛋白的質(zhì)粒進(jìn)行維持的需要，或者消除了對(duì)于一種附加的營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記進(jìn)行限制的需要，并且進(jìn)一步減少了潛在的由于維持這種包含lacI質(zhì)粒所造成的生產(chǎn)的低效性。在一個(gè)先前的試圖調(diào)控假單胞菌表達(dá)的轉(zhuǎn)基因中，一個(gè)被刪除lacZ啟動(dòng)子區(qū)域，但是保留了組成型的PlacI啟動(dòng)子的大腸桿菌PlacI-lacI-lacZYA操縱子，被插入到染色體中的(參考美國(guó)專利NO.5,169,760)。這種刪除允許了這種lac操縱子的基因產(chǎn)品的組成表達(dá)。但是，插入的操縱子包含大腸桿菌lacY基因，其編碼乳糖運(yùn)送蛋白乳糖透酶。乳糖透酶可以從培養(yǎng)基到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖，或者相似的衍生物，。乳糖透酶的存在可以導(dǎo)致從培養(yǎng)基中增加輸入類似乳糖的污染物，最后產(chǎn)生了在誘導(dǎo)之前就抑制了Plac家族啟動(dòng)子。此外，lac操縱子lacZ，lacY，和lacA基因產(chǎn)品的表達(dá)可以產(chǎn)生所使用的碳源對(duì)這些產(chǎn)品的低效貢獻(xiàn)，導(dǎo)致了在細(xì)胞上增加的代謝壓力，并且延遲了誘導(dǎo)的高細(xì)胞濃度的建立。另外，更大的lacI-lacZYA融合操縱子相比于宿主細(xì)胞中單獨(dú)的lacI插入可以產(chǎn)生更多的不穩(wěn)定性信息。驚奇的發(fā)現(xiàn)不同于作為整體的一部分或者截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA操縱子在假單胞菌中LacI-編碼基因的使用驚奇地對(duì)于誘導(dǎo)前的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)生了充分地改良的抑制，與以前教導(dǎo)的lacI-lacZYA假單胞菌染色體插入相比在商業(yè)領(lǐng)域發(fā)酵中更高的細(xì)胞濃度，以及更高的所需產(chǎn)品的產(chǎn)量(美國(guó)專利No.5,169,760)。另外的使用lacI基因衍生物的試圖，例如lacIQ和lacIQI，由于這種啟動(dòng)子修飾其與lacI相比可以更高水平地表達(dá)，已經(jīng)進(jìn)行了描述。CGGlascock和MJWeickert提到宿主細(xì)胞染色體中具有單獨(dú)的LacI蛋白編碼基因的大腸桿菌菌株用來(lái)測(cè)定質(zhì)粒-產(chǎn)生的Ptac-啟動(dòng)目標(biāo)基因的控制水平。參考CGGlascock&MJWeickert，“使用染色體laclQI來(lái)調(diào)控大腸桿菌中高拷貝數(shù)質(zhì)?；虻谋磉_(dá)”(″UsingchromosomallacIQItocontrolexpressionofgenesonhigh-copynumberplasmidsinEscherichiacoli，″)Gene223(1-2)221-31(1998)；也可以參考WO97/04110。在這里測(cè)試的LacI-蛋白編碼基因?yàn)閘acI，lacIQ和lacIQI。對(duì)于lacI基因和lacIQ基因得到的結(jié)果證明了當(dāng)存在于一個(gè)高拷貝數(shù)質(zhì)粒的時(shí)候Ptac-啟動(dòng)目標(biāo)基因的更差水平的抑制，產(chǎn)生了充分水平的誘導(dǎo)前目標(biāo)基因的表達(dá)。只有高水平表達(dá)的lacIQI基因在那個(gè)系統(tǒng)中提供了充足的抑制。但是，這種策略，具有潛在的增加成本的問(wèn)題因?yàn)樾枰黾诱T導(dǎo)物的用量來(lái)在誘導(dǎo)時(shí)充分解除啟動(dòng)子的抑制作用，并且降低了產(chǎn)量，因?yàn)檎T導(dǎo)物不能充分地結(jié)合全部組成型的抑制蛋白的表達(dá)。比較地，驚奇地發(fā)現(xiàn)單拷貝lacI染色體插入可以充分抑制Plac-Ptac家族啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這種發(fā)現(xiàn)提供了在誘導(dǎo)物使用量上的潛在的節(jié)約成本的方法，并且提供了額外的靈活性在假單胞菌作為宿主細(xì)胞改進(jìn)蛋白生產(chǎn)的發(fā)展中。假單胞菌生物體假單胞菌和緊密相關(guān)的微生物，如這里所使用的，是延伸到這里限定為“革蘭氏(-)變形桿菌綱(Proteobacteria)亞群1”的群體?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群1”進(jìn)一步特殊限定為屬于描述為落入名為“革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌”的分類學(xué)“部分”的科和/或?qū)伲ㄟ^(guò)R.E.BuchananandN.E.Gibbons(eds.)，伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology)，pp.217-289(8thed.，1974)(TheWilliams&WilkinsCo.，Baltimore，MD，USA)(下文中稱為″Bergey(1974)″)。表4給出了在這分類學(xué)“部分(part)”中的微生物的科和屬。表1.“革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌”部分中列出的科和屬(Bergey(1974))“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”包含所有的變形桿菌綱分類下的，以及所有的變形桿菌綱其可以按照形成這一分類學(xué)“部分”時(shí)所使用的規(guī)則進(jìn)行分類。作為結(jié)果，“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”排除了，例如所有的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，那些革蘭氏陰性細(xì)菌，例如腸細(xì)菌，其落入Bergey(1974)分類手冊(cè)的其它的19個(gè)“部分”，這本Bergey(1974)的完整的“科V.鹽桿菌科(Halobacteriaceae)”“部分”其已經(jīng)被公認(rèn)為古菌(Archaea)的非細(xì)菌科；并且屬，棲熱菌屬(Thermus)，列于這本Bergey(1974)的“部分”中這個(gè)屬其已經(jīng)被公認(rèn)為是非變形桿菌綱屬中的細(xì)菌。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”進(jìn)一步包括那些變形桿菌綱，屬于(和先前所稱作的種)在這本的Bergey(1974)的“部分”中所限定的屬和科以及那些已經(jīng)被給出的其它的變形桿菌綱分類學(xué)名稱。在這些情況下，這些再次命名導(dǎo)致產(chǎn)生了完全新的變形桿菌屬。例如，噬酸菌屬(Acidovorax)，短波單胞菌屬(Brevundimonas)，伯克氏菌屬(Burkholderia)，噬氫菌屬(Hydrogenophaga)，海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)，勞爾氏菌屬(Ralstonia)，和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，由于重新分組產(chǎn)生的生物體屬于(和先前所稱作的種)假單胞菌屬，如Bergey(1974)所限定的。同樣，例如，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)屬(和芽生單胞菌(Blastomonas)屬，源自它們的)是由于重新分組生物體產(chǎn)生的屬于(和先前所稱作的種)黃單胞菌(Xanthomonas)屬如Bergey(1974)所限定的。相似地，例如，酸單胞菌(Acidomonas)屬是由于重新分組生物體產(chǎn)生的屬于(和先前所稱作的種)醋菌(Acetobacter)屬如Bergey(1974)所限定的。這種進(jìn)一步再分配的種如這里所限定的也包括在“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”中。在其它的情況中，落入這本Bergey(1974)“部分”中的屬和科中所限定的變形桿菌綱種的被簡(jiǎn)單地再次分離到其它種下，已經(jīng)存在的變形桿菌綱的屬。例如，在假單胞菌屬的情況下，Pseudomonasenalia(ATCC14393)，生黑假單胞菌(Pseudomonasnigrifaciens)(ATCC19375)，和腐敗假單胞菌(Pseudomonasputrefaciens)(ATCC8071)曾經(jīng)被分別重新分類為假交替單胞菌(Alteromonashaloplanktis)，生黑交替單胞菌(Alteromonasnigrifaciens)，和腐敗交替單胞菌(Alteromonasputrefaciens)。相似地，例如，噬酸假單胞菌(Pseudomonasacidovorans)(ATCC15668)和睪丸酮假單胞菌(Pseudomonastestosteroni)(ATCC11996)曾經(jīng)被分別重新分類為叢毛酸單胞菌(Comanonasacidovorans)和睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)；以及生黑假單胞菌(Pseudomonasnigrifaciens)(ATCC19375)和殺魚假單胞菌(Pseudomonaspiscicida)(ATCC15057)曾經(jīng)被分別重新分類為生黑交替假單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)和殺魚交替假單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。這種隨后的再分配的變形桿菌(Proteobacterial)種如這里所限定的也包括在“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”中?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群1”還包括已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)或者曾經(jīng)被重新分類為屬于這本Bergey(1974)“部分”中的變形桿菌科和/或種中的變形桿菌種?？紤]到變形桿菌科，“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”還包括分類為屬于任意的科的變形桿菌(Proteobacteria)，假單胞菌(Pseudomonadaceae)，固氮菌科(Azotobacteraceae)(目前通常稱為同義的，假單胞菌(Pseudomonadaceae)的“固氮菌群”)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，和甲基單胞菌科(Methylomonadaceae)(目前通常稱為同義的，“甲基球菌科(Methylococcaceae)”)。因此，除了這里所提到的那些屬，進(jìn)一步變形桿菌屬落入“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”中的包括1)固氮菌群細(xì)菌中的固氮根瘤菌(Azorhizophilus)屬；2)假單胞菌科的纖維弧菌屬(Cellvibrio)，Oligella和Teredinibacter屬的細(xì)菌；3)根瘤菌科的Chelatobacter屬，劍菌屬(Ensifer)，Liberibacter屬(也稱為″CandidatusLiberibacter″)，和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的細(xì)菌；和4)甲基球菌科的甲基桿菌屬(Methylobacter)，甲基暖菌屬(Methylocaldum)，甲基微菌屬(Methylomicrobium)，甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)和甲基球形菌屬(Methylosphaera)屬的細(xì)菌。一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自如前面描述的“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”。另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群2”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群2”被定義成下面的屬的變形桿菌群(group)(這里在括號(hào)中給出了保藏的菌株的目錄號(hào)的總數(shù)，公眾可以獲得的，除非另外說(shuō)明，都保藏在ATCC)酸單胞菌(Acidomonas)(2)；醋菌(Acetobacter)(93)；葡糖桿菌(Gluconobacter)(37)；短波單胞菌(Brevundimonas)(23)；拜葉林克氏菌(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌(Derxia)(2)；布魯氏菌(Brucella)(4)；土壤桿菌(Agrobacterium)(79)；Chelatobacter(2)；劍菌屬(Ensifer)(3)；根瘤菌(Rhizobium)(144)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)(24)；芽生單胞菌(Blastomonas)(1)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)(27)；產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌(Bordetella)(43)；伯克氏菌(Burkholderia)(73)；勞爾氏菌(Ralstonia)(33)；噬酸菌(Acidovorax)(20)；噬氫菌(Hydrogenophaga)(9)；動(dòng)膠菌(Zoogloea)(9)；甲基桿菌屬(Methylobacter)(2)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)(1在NCIMB)；甲基球菌屬(Methylococcus)(2)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)(2)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)(9)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌(Azomonas)(9)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)(5)；固氮菌(Azotobacter)(64)；纖維弧菌(Cellvibrio)(3)；Oligella(5)；假單胞桿菌(Pseudomonas)(1139)；弗蘭西氏菌屬(Francisella)(4)；黃單胞菌(Xanthomonas)(229)；寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)(50)；和海洋假單胞菌(Oceanimonas)(4)?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群2”中的典型的宿主細(xì)胞種類包括，但是不限于下面的細(xì)菌(在括號(hào)中顯示的ATCC或者其它機(jī)構(gòu)的典型菌株的保藏號(hào))甲醇酸單胞菌(Acidomonasmethanolica)(ATCC43581)；紋膜醋酸桿菌(Acetobacteraceti)(ATCC15973)；Gluconobacteroxydans(ATCC19357)；短波單胞菌(Brevundimonasdiminua)(ATCC11568)；印度貝氏固氮菌(Beijerinckiaindica)(ATCC9039和ATCC19361)；Derxiagummosa(ATCC15994)；Brucellamelitensis(ATCC23456)，牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)(ATCC23448)；根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)(ATCC23308)，放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)(ATCC19358)，發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)(ATCC11325)；Chelatobacterheintzii(ATCC29600)；Ensiferadhaerens(ATCC33212)；根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(ATCC10004)；Sinorhizobiumfredii(ATCC35423)；Blastomonasnatatoria(ATCC35951)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)(ATCC29837)；糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)(ATCC8750)；百日咳桿菌(Bordetellapertussis)(ATCC9797)；洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)(ATCC25416)；Ralstoniapickettii(ATCC27511)；敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)(ATCC11228)；氫噬胞菌(Hydrogenophagaflava)(ATCC33667)；生枝動(dòng)膠菌(Zoogloearamigera)(ATCC19544)；甲基細(xì)菌(Methylobacterluteus)(ATCC49878)；Methylocaldumgracile(NCIMB1912)；甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(ATCC19069)；Methylomicrobiumagile(ATCC35068)；甲烷甲基單胞菌(Methylononasmethanica)(ATCC35067)；Methylosarcinafibrata(ATCC700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM549)；氮單胞菌(Azomonasagilis)(ATCC7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC23833)；圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)(ATCC9043)；對(duì)褐纖維弧菌(Cellvibriomixtus)(UQM2601)；尿道寡源桿菌(Oligellaurethralis)(ATCC17960)；綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC10145)；熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(ATCC35858)；土拉熱弗朗西絲菌(Francisellatularensis)(ATCC6223)；嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC13637)；Xanthomonascampestris(ATCC33913)；和Oceanimonasdoudoroffii(ATCC27123)。另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群3”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群3”被定義為下面屬中的變形桿菌的群短波單胞菌屬(Brevundimonas)；土壤桿菌屬(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；酸單胞菌(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌屬(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群4”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群4”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群5”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群5”被定義為下面屬中的變形桿菌的組甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Celivibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群6”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群6”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群7”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群7”被定義為下面屬中的變形桿菌的組氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群8”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群8”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群9”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群9”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群10”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群10”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和黃單胞菌(Xanthomonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群11”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群11”被定義為下面屬中的變形桿菌的組假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和黃單胞菌(Xanthomonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群12”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群12”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群13”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群13”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)和黃單胞菌(Xanthomonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群14”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群14”被定義為下面屬中的變形桿菌的組假單胞桿菌(Pseudomonas)和黃單胞菌(Xanthomonas)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群15”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群15”被定義為假單胞桿菌(Pseudomonas)屬中的變形桿菌的組。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群16”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群16”被定義為下面假單胞桿菌(Pseudomonas)種的變形桿菌的組(括號(hào)中顯示的ATCC或其它機(jī)構(gòu)中的典型菌株的保藏號(hào))Pseudomonasabietaniphila(ATCC700689)；綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC10145)；產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)(ATCC14909)；Pseudomonasanguilliseptica(ATCC33660)；Pseudomonascitronellolis(ATCC13674)；Pseudomonasflavescens(ATCC51555)；門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)(ATCC25411)；Pseudomonasnitroreducens(ATCC33634)；解油極毛桿菌(Pseudomonasoleovorans)(ATCC8062)；假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)(ATCC17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC14235)；Pseudomonasstraminea(ATCC33636)；蘑菇假單胞菌(Pseudomonasagarici)(ATCC25941)；Pseudomonasalcaliphila；Pseudomonasalginovora；Pseudomonasandersonii；Pseudomonasasplenii(ATCC23835)；Pseudomonasazelaica(ATCC27162)；Pseudomofaasbeijerinckii(ATCC19372)；Pseudomonasborealis；Pseudomonasboreopolis(ATCC33662)；Pseudomonasbrassicacearum；Pseudomonasbutanovora(ATCC43655)；Pseudomonascellulosa(ATCC55703)；Pseudomonasaurantiaca(ATCC33663)；綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)(ATCC9446，ATCC13985，ATCC17418，ATCC17461)；草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)(ATCC4973)；Pseudomonaslundensis(ATCC49968)；腐臭假單胞菌(Pseudomonastaetrolens)(ATCC4683)；Pseudomonascissicola(ATCC33616)；Pseudomonascoronfaciens；Pseudomonasditerpeniphila；Pseudomonaselongata(ATCC10144)；Pseudomonasflectens(ATCC12775)；氮芽孢桿菌(Pseudomonasazotoformans)；Pseudomonasbrenneri；Pseudomonascedrella；Pseudomonascorrugata(ATCC29736)；Pseudomonasextremorientalis；Pseudomonasfluorescens(ATCC35858)；Pseudomonasgessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonasmandelii(ATCC700871)；邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginalis)(ATCC10844)；Pseudomonasmigulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC4685)；Pseudomonasorientais；Pseudomonasrhodesiae；Pseudomonassynxantha(ATCC9890)；托拉斯假單胞桿(Pseudomonastolaasii)(ATCC33618)；威隆氣單胞菌(Pseudomonasveronii)(ATCC700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；Pseudomonasgeniculata(ATCC19374)；Pseudomonasgingers；Pseudomonasgraminis；Pseudomonasgrimontii；Pseudomonashalodenitrificans；Pseudomonashalophila；Pseudornonashibiscicola(ATCC19867)；Pseudomonashuttiensis(ATCC14670)；噬氫假單胞菌(Pseudomonashydrogenovora)；Pseudomonasjessenii(ATCC700870)；Pseudomonaskilonensis；Pseudomonaslanceolata(ATCC14669)；Pseudomonaslini；Pseudomonasmarginata(ATCC25417)；Pseudomonasmephitica(ATCC33665)；脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrificans)(ATCC19244)；Pseudomonaspertucinogena(ATCC190)；Pseudomonaspictorum(ATCC23328)；Pseudomonaspsychrophila；Pseudomonasfulva(ATCC31418)；Pseudomonasmonteilii(ATCC700476)；Pseudomonasmosselii；Pseudomonasoryzihabitans(ATCC43272)；Pseudomonasplecoglossicida(ATCC700383)；惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(ATCC12633)；Pseudomonasreactants；Pseudomonasspinosa(ATCC14606)；巴利阿里假單胞菌(Pseudomonasbalearica)；Pseudomonasluteola(ATCC43273)；斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)(ATCC17588)；Pseudomonasamygdali(ATCC33614)；Pseudomonasavellanae(ATCC700331)；Pseudomonascaricapapayae(ATCC33615)；菊苣假單孢菌(Pseudomonascichorii)(ATCC10857)；Pseudomonasficuserectae(ATCC35104)；Pseudomonasfuscovaginae；Pseudomonasmeliae(ATCC33050)；丁香假單胞菌(Pseudomonassyringe)(ATCC19310)；Pseudoinoizasviridiflava(ATCC13223)；Pseudomonasthermocarboxydovorans(ATCC35961)；Pseudomonasthermotolerans；Pseudomonasthivervalensis；Pseudomonasvancouverensis(ATCC700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonasxiamenensis。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群17”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群17”被定義為現(xiàn)有技術(shù)中被認(rèn)為是“熒光假單胞菌”的變形桿菌的組包括那些屬于例如下面的假單胞菌的種Pseudomonasazotoformans；Pseudomonasbrenneri；Pseudomonascedrella；皺紋假單胞菌(Pseudomonascorrugata)；Pseudomonasextremorientalis；熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)；Pseudomonasgessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonasmandelii；邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginalis)；Pseudomonasmigulae；Pseudomonasmucidolens；Pseudomonasorientalis；Pseudomonasrhodesiae；產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonassynxantha)；抗假單胞菌(Pseudomonastolaasii)和威隆氣單胞菌(Pseudomonasveronii)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群18”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群18”被定義為熒光假單胞菌種的所有亞種，變體，菌株，和其它的亞種單元，包括那些屬于例如下面的(括號(hào)中顯示的是ATCC或其它機(jī)構(gòu)中的典型菌株的保藏號(hào))熒光假單胞菌生物型A，也稱為生物變體(biovar)1或者生物變體I(ATCC13525)；熒光假單胞菌生物型B，也稱為生物變體2或者生物變體II(ATCC17816)；熒光假單胞菌生物型C，也稱為生物變體3或者生物變體III(ATCC17400)；熒光假單胞菌生物型F，也稱為生物變體4或者生物變體IV(ATCC12983)；熒光假單胞菌生物型G，也稱為生物變體5或者生物變體V(ATCC17518)；熒光假單胞菌生物變體VI；熒光假單胞菌PfO-1；熒光假單胞菌Pf-5(ATCCBAA-477)；熒光假單胞菌SBW25和熒光假單胞菌subsp.cellulosa(NCIMB10462)。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群19”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群19”被定義為熒光假單胞菌生物型A的所有菌株的組。這種生物型的特別優(yōu)選的菌株是熒光假單胞菌菌株MB101(參考美國(guó)專利No.5,169,760(seeUSPatentNo.5,169,760toWilcox))，及其衍生物。一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是假單胞菌的目(order)的任意的變形桿菌。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是假單胞菌科的任意的變形桿菌。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群2”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群3”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群5”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群7”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群12”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群15”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群17”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群18”。特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群19”。另外的可以在本發(fā)明中使用的熒光假單胞菌菌株包括熒光假單胞菌Migula和熒光假單胞菌Loitokitok，具有下面的ATCC編號(hào)[NCIB8286]；NRRLB-1244；NCIB8865菌株CO1；NCIB8866菌株C02；1291[ATCC17458；IFO15837；NCIB8917；LA；NRRLB-1864；吡咯烷；PW2[ICMP3966；NCPPB967；NRRLB-899]；13475；NCTC10038；NRRLB-1603[6；IFO15840]；52-1C；CCEB488-A[BU140]；CCEB553[IEM15/47]；IAM1008[AHH-27]；IAM1055[AHH-23]；1[IFO15842]；12[ATCC25323；NIH11；denDoorendeJong216]；18[IFO15833；WRRLP-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO15832]；143[IFO15836；PL]；149[2-40-40；IFO15838]；182[IFO3081；PJ73]；184[IFO15830]；185[W2L-1]；186[IFO15829；PJ79]；187[NCPPB263]；188[NCPPB316]；189[PJ227；1208]；191[IFO15834；PJ236；22/1]；194[KlingeR-60；PJ253]；196[PJ288]；197[PJ290]；198[PJ302]；201[PJ368]；202[PJ372]；203[PJ376]；204[IFO15835；PJ682]；205[PJ686]；206[PJ692]；207[PJ693]；208[PJ722]；212[PJ832]；215[PJ849]；216[PJ885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO15831；PJ187]；NRRLB-3178[4；IFO15841]；KY8521；3081；30-21；[IFO3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU2183；FERM-P3328]；P-2563[FERM-P2894；IFO13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRLB-4290；PMW6[NCIB11615]；SC12936；A1[IFO15839]；F1847[CDC-EB]；F1848[CDC93]；NCIB10586；P17；F-12；AmMS257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC2583[NCIB8194]；H13；1013[ATCC11251；CCEB295]；IFO3903；1062；或Pf-5。II.營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記本發(fā)明提供了假單胞菌和相應(yīng)的細(xì)胞其已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾從而對(duì)至少一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。這種基因修飾可以是對(duì)于一個(gè)基因或者對(duì)于在一個(gè)編碼例如一種合成代謝的生物合成途徑或者分解代謝的利用途徑的代謝途徑中工作的酶的幾個(gè)基因的修飾。優(yōu)選的，這種宿主細(xì)胞所有的給定生物催化活性的編碼基因都被刪除了或者失活，從而保證消除這種生物催化活性。特定實(shí)施方案中，假單胞菌是熒光假單胞菌細(xì)胞。一個(gè)或多于一個(gè)的代謝活性可以被選擇敲除或者代替。在天然的營(yíng)養(yǎng)缺陷的情況下，可以提供另外的代謝敲除或者代替。這里選擇了多個(gè)活性，營(yíng)養(yǎng)缺陷-回復(fù)選擇標(biāo)記可以是一種生物合成類型(合成代謝的)，或是一種利用型(分解代謝的)，或者可以選擇兩種類型。例如，對(duì)于選擇的化合物在給定的生物合成路徑中的一種或多于一種的活性可以被敲除；或者多于一種的活性可以被敲除，每一個(gè)來(lái)自不同的生物合成路徑。相關(guān)的活性或者多個(gè)活性隨后被至少一種重組載體所提供，其在轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中時(shí)，回復(fù)了細(xì)胞的原養(yǎng)特性。生物合成或者利用的化合物和分子它們可以成為生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)缺陷性宿主細(xì)胞的目標(biāo)，它們包括脂質(zhì)，包括，例如，脂肪酸；單糖和二糖以及其取代的衍生物，包括，例如，葡萄糖，果糖，蔗糖，葡萄糖-6-磷酸，和葡萄糖醛酸，以及Entner-Doudoroff途徑和戊糖磷酸途徑中間物和產(chǎn)物；核苷，核苷酸，二核苷酸，包括，例如，ATP，dCTP，F(xiàn)MN，F(xiàn)AD，NAD，NADP，含氮堿基，包括，例如，吡啶，嘌呤，嘧啶，蝶呤，和氫化-，脫氫-，和/或取代的含氮堿基的衍生物，例如輔助因子，例如，生物素，腺苷鈷胺，核黃素，硫胺素，有機(jī)酸和糖酵解和檸檬酸循環(huán)中間體和產(chǎn)物，包括，例如，羥基酸(hydroxyacids)和氨基酸；儲(chǔ)藏碳水化合物和儲(chǔ)藏聚合(羥基鏈烷酸)聚合物，包括，例如，纖維素，淀粉，多糖，膠淀粉，糖原，聚羥基丁酸，和聚酯。一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞所敲除的生物催化活性選自脂質(zhì)；核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮堿基，和含氮堿基的衍生物；以及有機(jī)酸或糖酵解和檸檬酸循環(huán)的中間物和產(chǎn)物。優(yōu)選地，敲除的生物催化活性選自核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮堿基，和含氮堿基衍生物；以及有機(jī)酸和糖酵解和檸檬酸循環(huán)的中間物和產(chǎn)物。更優(yōu)選，敲除的生物催化活性選自嘧啶核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮堿基，和含氮堿基衍生物或氨基酸。給定的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞可以使用一種或者多于一種的選擇標(biāo)記或選擇標(biāo)記系統(tǒng)。例如，按照本發(fā)明的一種或者多種生物合成選擇標(biāo)記或者選擇標(biāo)記系統(tǒng)可以互相聯(lián)合使用，和/或與按照本發(fā)明的利用型的選擇標(biāo)記或選擇標(biāo)記系統(tǒng)聯(lián)合使用。這些原養(yǎng)能力實(shí)施方案中的任意一種，宿者細(xì)胞還可以包括一種或多種非營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記或選擇標(biāo)記系統(tǒng)。非營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記和系統(tǒng)的例子包括，例如毒素-抗性標(biāo)記基因例如抗生素-抗性基因其編碼降解一種抗生素的酶活性；毒素-抗性標(biāo)記基因，比如，例如，乙酰乳酸合成酶的抗咪唑啉酮-抗性突變(“ALS”；EC2.2.1.6)其中表達(dá)的突變體使得酶對(duì)于其不包含這種突變體的酶表現(xiàn)的毒素-抑制劑的不敏感。這種化合物可以直接表現(xiàn)這種作用；或者化合物不直接表現(xiàn)這種作用，例如，結(jié)果是將這種化合物轉(zhuǎn)變成了毒素的細(xì)胞代謝行為或者結(jié)果是與至少一種更多的化合物形成的化合物的結(jié)合。編碼這種標(biāo)記酶的細(xì)菌-宿主-操作基因可以通過(guò)選擇構(gòu)建敲除細(xì)胞的細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株來(lái)獲得，從其它的細(xì)菌，或者從其它的生物體，并且可以用天然的形式或修飾的(例如，突變的或者序列重組的)形式。例如，表現(xiàn)為敲除生物催化活性的酶的DNA編碼序列可以從一種或多種生物體來(lái)獲得并且隨后可操作地連接到宿主細(xì)胞中DNA調(diào)控元件上。特別是，所有的選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)基因其編碼一種選擇的被破壞的酶活性；選擇的被破壞的酶活性編碼基因上；破壞的細(xì)菌宿主隨后被一種包括至少一種可操作的天然的或非天然的基因拷貝其編碼一種由于細(xì)菌破壞作用而活性丟失的酶的載體轉(zhuǎn)化該載體。編碼這種酶的細(xì)菌和其它的基因可以通過(guò)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的不同的方法來(lái)選擇或獲得。這些包括酶編碼序列的核苷酸序列和種內(nèi)-可操作(species-operative)的DNA調(diào)控序列。有用的在線網(wǎng)絡(luò)資源包括，例如，(1)來(lái)自瑞士生物信息學(xué)院(BatimentEcoledePharmacie，Room3041；UniversitédeLausanne；1015Lausanne-Dorigny；瑞士)的ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白工具(參考酶(ENZYME)和生化途徑圖(BIOCHEMICALPATHWAYSMAPS)的內(nèi)容)已知位于，例如，http//us.expasy.org/；和(2)GenBank工具和其它的網(wǎng)絡(luò)資源(參考PUBMED，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PROTEIN)，核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NUCLEOTIDE)，分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(STRUCTURE)，基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GENOME)，等內(nèi)容)，其由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心提供(NCBI，國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，美國(guó)健康和公共事業(yè)部，Building38A；Bethesda，馬里蘭州，美國(guó))已知位于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi。選擇的編碼序列可以通過(guò)修改其基因編碼來(lái)進(jìn)行修飾從而滿足選擇的細(xì)菌宿主細(xì)胞的需要，以及提高它的密碼子序列來(lái)更好的接近于宿主細(xì)胞所使用的。基因密碼選擇和密碼子頻率提高可以按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的的不同的方法來(lái)進(jìn)行，例如，寡核苷酸定點(diǎn)突變。在這種方法中輔助使用的在線的網(wǎng)絡(luò)資源包括，例如(1)KazusaDNA研究所的密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)(2-6-7Kazusa-kamatari，Kisarazu，Chiba292-0818Japan)并且位于http//www.kazusa.or.jp/codon/；和(2)可以從NCBI分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的基因密碼子表，其可以從http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi？mode＝c獲得。例如，假單胞菌種被報(bào)道為使用NCBI分類學(xué)站點(diǎn)的基因編碼轉(zhuǎn)換表11，以及位于Kazusa站點(diǎn)中的表現(xiàn)密碼子使用頻率的表格位于http//www.kazusa.or.ip/codon/cgibin/。特定實(shí)施方案中，熒光假單胞菌可以用作宿主細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方案中，熒光假單胞菌提供了至少一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記基因?？商鎿Q實(shí)施方案中，熒光假單胞菌提供了所有的營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記基因。特定實(shí)施方案中，熒光假單胞菌可以既是宿主細(xì)胞并且也提供了至少一種，優(yōu)選所有的營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記基因。生物合成的核苷和含氮堿基選擇標(biāo)記一個(gè)實(shí)施方案中，一種合成代謝中的生物合成酶可以被選擇作為營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記。特別是，生物合成酶可以選自那些包含在核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮堿基，和含氮堿基衍生物的生物合成中。特定實(shí)施方案中，至少一種嘌呤型生物合成酶可以被選擇作為一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記。這種嘌呤生物合成酶包括，例如，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(adeninephosphoribosyltransferases)，腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinatelyases)，腺苷酸琥珀酸合成酶(adenylosuccinatesynthases)，GMP合成酶(GMPsynthases)，IMP環(huán)水解酶(IMPcyclohydrolases)，IMP脫氫酶(IMPdehydrogenases)，磷酸核糖胺-氨基乙酸連接酶(phosphoribosylamine-glycineligases)，磷酸核糖-氨基咪唑羧基酰胺核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶(phosphoribosyl-aminoimidazolecarboxamideformyltransferases)，磷酸核糖氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazolecarboxylases)，磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧基酰胺合成酶(phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamidesynthases)，磷酸核糖-甲酰基甘氨脒環(huán)連接酶(phosphoribosyl-formylglycinamidinecycloligases)，磷酸核糖-甲酰基甘氨脒合成酶(phosphoribosyl-formylglycinamidinesynthases)，磷酸核糖-甘氨脒甲酰基轉(zhuǎn)移酶(phosphoribosyl-glycinamideformyltransferases)，核糖-磷酸二磷酸核苷激酶(ribose-phosphatediphosphokinases)，和核糖-5-磷酸-氨基連接酶(ribose-5-phosphate-ammonialigases)。另一特定實(shí)施方案中，一種嘧啶型生物合成酶可以被選擇用作營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記。這種嘧啶型的生物合成包括在UMP生物合成中使用的酶，例如氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)，氨基甲酰-磷酸合成酶(EC6.3.5.5)，天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.3.2)，二氫乳清酸酶(EC3.5.2.3)，二氫乳清酸脫氫酶(EC1.3.3.1)，或者乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(“OPRT”；EC2.4.2.10)，和乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(“ODCase”；EC4.1.1.23)。編碼嘧啶型生物合成酶的基因的例子是公知的。在UMP細(xì)菌合成的情況下，有用的基因的例子包括arcC基因，編碼氨基甲酸激酶；carA和carB基因，共同的編碼氨甲酰-磷酸合成酶；pyrB基因，編碼天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶；pyrC基因，編碼二氫乳清酸酶；pyrD基因，單獨(dú)或者共同編碼二氫乳清酸脫氫酶；pyrE基因編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；和pyrF基因，編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶。特定實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)可以利用pyrF營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記基因。PyrF基因編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶，是細(xì)菌嘧啶核苷酸生物合成途徑中所需要的，通過(guò)其細(xì)胞表現(xiàn)出從頭合成適當(dāng)?shù)泥奏ず塑账?UTP，CTP)，以及嘧啶脫氧核苷酸(dTTP，dCTP)。路徑的最初反應(yīng)物是ATP，一種氨基基團(tuán)來(lái)源(也就是銨基離子或者L-谷氨酰胺)，以及一種羧基基團(tuán)來(lái)源(也就是二氧化碳或者重碳酸鹽離子)；路徑的最終產(chǎn)物是dTTP，以及dCTP，UTP，和CTP也可以在這個(gè)過(guò)程中形成。特別地，細(xì)菌嘧啶核苷酸從頭生物合成途徑從形成氨甲酰磷酸開(kāi)始。氨甲酰磷酸是或者(a)通過(guò)氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)的作用，被arcC基因所編碼；或者，更普遍地，(b)被谷氨酰胺水解的作用，氨甲酰磷酸合成酶(EC6.3.5.5)，其小的和大的亞基分別被carA和carB基因編碼合成的。氨甲酰磷酸隨后通過(guò)下面六個(gè)步驟的路線而被轉(zhuǎn)化成UDP1)氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)變成N-氨甲酰-L-天冬氨酸，通過(guò)天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.3.2)，由pyrB所編碼；2)再將其轉(zhuǎn)化成(S)-二氫乳清酸，通過(guò)二氫乳清酸酶(EC3.5.2.3)，由pyrC所編碼；隨后3)再將其轉(zhuǎn)化成乳清酸，通過(guò)二氫乳清酸脫氫酶(EC1.3.3.1)，由pyrD基因所編碼；隨后4)在將其轉(zhuǎn)化成乳清酸核苷-5’-一磷酸鹽(“OMP”)，通過(guò)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(“OPRT”；EC2.4.2.10)，由pyrE所編碼；以及隨后5)再將其轉(zhuǎn)化成尿苷-5’-一磷酸鹽(“UMP”)，通過(guò)乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(“ODCase”；EC4.1.1.23)，由pyrF所編碼。隨后UMP被大量的途徑利用來(lái)合成嘧啶核苷酸(UTP，CTP，dTTP，dCTP)，核酸，核蛋白，以及其它的細(xì)胞代謝物。在細(xì)菌中其中一種或多種carA，carB，或pyrB-pyrF基因已經(jīng)成為失去活性的或者丟失的，或者變異而編碼一種沒(méi)有功能的酶，如果培養(yǎng)基中添加了尿嘧啶則這種細(xì)胞還可以存活，如果這種細(xì)胞包括一種功能性的尿嘧啶救助途徑。大多數(shù)細(xì)胞包含一種天然的尿嘧啶救助途徑，這包括假單胞菌和相關(guān)的菌種。在尿嘧啶救助途徑中，細(xì)胞誘導(dǎo)并且轉(zhuǎn)化外源的尿嘧啶成為UMP，來(lái)合成這種需要的嘧啶核苷酸。在這里，尿嘧啶與5-磷酸核糖-1-焦磷酸進(jìn)行反應(yīng)來(lái)形成UMP，或者通過(guò)尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.2.9)的作用，由upp基因編碼，或者通過(guò)兩種功能的，嘧啶操縱子調(diào)控蛋白(“pyrR雙功能蛋白”)，由pyrR編碼。產(chǎn)生的UMP隨后轉(zhuǎn)化成UDP，并且隨后轉(zhuǎn)化成嘧啶核苷酸，如前面所描述的。因此，pyrF(-)假單胞菌或者相關(guān)的細(xì)胞可以被供養(yǎng)在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上。在含有pyrF基因的DNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染到pyrF(-)細(xì)胞中并且表達(dá)來(lái)形成一種有功能的ODCase酶后，結(jié)果是組合的pyrF(+)質(zhì)粒-宿主細(xì)胞系統(tǒng)可以被供養(yǎng)在一種缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中。在假單胞菌或者相關(guān)的細(xì)胞中使用的pyrF基因的編碼序列可以通過(guò)編碼乳清核苷酸-5’-磷酸脫羧酶(“ODCase”)的任意基因來(lái)獲得，前提是編碼序列可以被選擇的假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，翻譯，以及其它的處理方法來(lái)形成一種有功能的ODCase。PyrF編碼序列可以是一種天然的序列，或者它可以是一種工程化的序列來(lái)自于，例如，應(yīng)用一種或者多種本領(lǐng)域中已知的序列-修改，序列-結(jié)合，和/或序列生產(chǎn)技術(shù)。在作為pyrF選擇標(biāo)記基因的部分使用之前，選擇的編碼序列首先可以按照選擇的假單胞菌或相關(guān)宿主細(xì)胞的基因密碼和/或密碼子使用頻率進(jìn)行改良或優(yōu)化?？杀磉_(dá)的密碼子序列可以操作性地連接到一種可以在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上，以及所有其它的所需轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。如前所述的一種pyrF基因的原始編碼序列可以來(lái)自符合上面所述的要求的細(xì)菌或者來(lái)自于任意其它的生物體。一個(gè)實(shí)施方案中，pyrF編碼序列可以分離自假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞其中它被試圖用作一種選擇標(biāo)記。完整的pyrF基因(包括編碼序列和周圍的調(diào)控區(qū)域)可以從那里分離得到。特定實(shí)施方案中，提供pyrF基因或編碼序列的細(xì)菌可以選自假單胞菌目中的一個(gè)，假單胞菌亞目中的一個(gè)，假單胞菌科中的一個(gè)，假單胞菌族中的一個(gè)，假單胞菌屬中的一個(gè)，以及熒光假單胞菌種中的一個(gè)(也就是“熒光假單胞菌”)。特定實(shí)施方案中，細(xì)菌將屬于熒光假單胞菌種。特定實(shí)施方案中，pyrF基因包含SEQIDNO1(表2)的核酸序列，或者它的變體?？蛇x擇地，由pyrF基因編碼的ODCase包含SEQIDNO2(表3)的氨基酸序列，它的一個(gè)變體，或者一個(gè)與之相比具有冗余的密碼子序列的變體，按照本發(fā)明所述的一個(gè)給定的宿主細(xì)胞所使用的基因密碼?？蛇x擇地，包含一種編碼ODCase酶核酸序列的pyrF基因選自一種與SEQIDNo1有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％和95％同源性的核酸序列。同樣，編碼一種ODCase的pyrF基因選自一種與SEQIDNo2有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％和95％同源性的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，pyrF基因含有一種編碼序列其具有的核酸序列與SEQIDNO1的974-1669的核酸序列具有至少90％，93％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性。一特定實(shí)施方案中，pyrF基因可以包含一種編碼序列其具有可以與SEQIDNO3(表4)的反密碼子序列雜交的一個(gè)密碼子序列，當(dāng)在高度嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交的時(shí)候，或者可以具有與之相比冗余的密碼子序列。特定實(shí)施方案中，pyrF基因可以含有SEQIDNO3的核苷酸序列。表2-熒光假單胞菌pryF核酸序列表3-熒光假單胞菌ODCase氨基酸序列表4-熒光假單胞菌pryF核酸序列可替換實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的一種表達(dá)系統(tǒng)可以使用一種thyA營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇性標(biāo)記。ThyA基因編碼胸腺嘧啶核苷合成酶(EC2.1.1.45)，細(xì)菌嘧啶核苷酸生物合成途徑中所需要的一種酶。因?yàn)镈NA包含胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)作為主要的堿基代替尿嘧啶，胸苷單磷酸酯的合成(dTMP或胸腺嘧啶核苷)對(duì)于提供dTTP(胸苷三磷酸酯)是必要的，dTTP與dATP，dGTP和dCTP一起是DNA復(fù)制所必需的。通過(guò)胸腺嘧啶核苷合成酶的作用對(duì)dUMP進(jìn)行甲基化使用5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶作為甲基基團(tuán)的來(lái)源產(chǎn)生胸腺嘧啶核苷。胸腺嘧啶核苷的合成可以通過(guò)除去，抑制，或者分解胸腺嘧啶核苷合成酶來(lái)中斷，并且因此DNA的合成被限制。在細(xì)菌中其中這種thyA基因已經(jīng)成為失去活性的或者丟失的，或者變異為編碼一種非功能的酶，如果向培養(yǎng)基中加入了外源的胸腺嘧啶則這種細(xì)胞還可以生長(zhǎng)。在熒光假單胞菌中，加入編碼胸苷激酶大腸桿菌tdk基因，，是必需的以在外源的胸苷上生存。因此，在選擇之前，包含一種tdk基因的質(zhì)粒可以用于轉(zhuǎn)化thyA(-)假單胞菌宿主細(xì)胞，來(lái)生產(chǎn)thyA(-)/ptdk細(xì)胞，允許在含有胸苷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)?？梢赃x擇地，產(chǎn)生一種使用外源胸苷的功能性胸腺嘧啶核苷合成酶的tdk基因可以插入到熒光假單胞菌的基因組中，生產(chǎn)一種thyA(-)/ptdk(+)宿主細(xì)胞。在含有thyA基因的DNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染到thyA(-)/ptdk細(xì)胞中并且表達(dá)形成一種功能性的胸腺嘧啶核苷合成酶后，獲得結(jié)合了thyA(+)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞系統(tǒng)可以在一種缺乏胸苷的培養(yǎng)基上供養(yǎng)。在假單胞菌或相關(guān)的宿主細(xì)胞中使用的thyA基因的編碼序列可以通過(guò)任意的編碼胸腺嘧啶核苷合成酶(“TS”)的基因來(lái)提供，假如這種編碼序列可以在選擇的假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄，翻譯，和其它的過(guò)程來(lái)形成一種功能性的TS。這種thyA基因可以是一種天然的序列，或者它可以是一種工程序列，例如，來(lái)自于使用本領(lǐng)域中已知的序列-改變，序列-聯(lián)合，和/或序列產(chǎn)生技術(shù)。在使用thyA選擇標(biāo)記基因的部分之前，這種選擇的編碼基因可以首先按照選擇的假單胞菌或者相關(guān)宿主細(xì)胞的遺傳密碼和/或密碼子使用頻率進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。表達(dá)的密碼序列可以可操作地連接到在宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄子調(diào)控子上，以及其它需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。如上所述的原始編碼序列可以從細(xì)菌或者從任意的生物體獲得，如果它符合上面提到的需要。一個(gè)實(shí)施方案中，thyA編碼序列分離自假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞在其中它將被作為一種選擇標(biāo)記。完整的thyA基因(包括編碼的序列和周圍的調(diào)控區(qū)域)可以從中分離得到。特定實(shí)施方案中，提供thyA基因或者編碼序列的細(xì)菌可以選自假單胞菌目中的一員，假單胞菌亞目中的一員，假單胞菌科中的一員，假單胞菌族中的一員，假單胞菌屬中的一員，以及熒光假單胞菌種中的一員(也就是，“熒光假單胞菌”)。特定實(shí)施方案中，細(xì)菌可以屬于熒光假單胞菌種。特定實(shí)施方案中，thyA基因包含SEQIDNO.4(表5)的核酸序列?？梢赃x擇地，這種被thyA基因編碼的TS包含SEQIDNO.5(表6)的氨基酸序列，其突變體，或者一種與之相比具有一個(gè)冗余密碼子序列的突變體，按照本發(fā)明所述的給定宿主細(xì)胞中所使用的遺傳密碼。表5.-熒光假單胞菌thyA核酸序列表6.-熒光假單胞菌TS氨基酸序列生物合成的氨基酸選擇標(biāo)記在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，選擇作為營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記的合成代謝中的生物合成酶可以選擇自那些氨基酸生物合成中的酶。特定實(shí)施方案中，生物合成的氨基酸酶選自的組包括以下氨基酸的生物合成活性中的酶谷氨酸家族(Glu；Gln，Pro，和Arg)；天冬氨酸家族(Asp；Asn，Met，Thr，Lys和Ile)；絲氨酸家族(Ser，Gly和Cys)；丙酮酸家族(Ala，Val，和Leu)；芳香家族(Trp，Phe，和Tyr)；和組氨酸家族(His)。在這些生物合成路徑中的基因和酶的例子包括谷氨酸家族成員arg，gdh，gln，和pro基因，包括，例如，argA-argH，gdhA，glnA，proA，proC；天冬氨酸家族成員asd，asn，asp，dap，lys，met，和thr基因，包括，例如，asnA，asnB，aspC，dapA，dapB，dapD-dapF，lysA，lysC，metA-metC，metE，rnetH，metL，thrA-thrC；絲氨酸家族成員cys，gly和ser基因，包括，例如，cysE，cysK，glyA，serA-serC；芳香家族成員aro，phe，trp，和tyr基因，包括，例如，aroA-aroH，aroK，aroL，trpAtrpE，tyrA，和tyrB；以及組氨酸家族成員his基因，包括hisA-hisD，hisF-hisH。進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記可以選自谷氨酸族成員的生物合成中的酶。所使用的谷氨酸族營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記的例子包括下面的，列舉的有代表性的它們的編碼基因argA，編碼N-乙?；劝彼岷铣擅?，氨基酸乙?；D(zhuǎn)移酶；argB，編碼乙酰化谷氨酸激酶；argC，編碼N-乙?；?γ谷氨酸磷酸還原酶；argD，編碼乙酰鳥氨酸Δ-氨基轉(zhuǎn)移酶；argE，編碼乙酰鳥氨酸脫?；?；argF和argI，編碼鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶；argG，編碼精氨酸代琥珀酸合成酶；argH，編碼精氨酸代琥珀酸裂解酶；gdhA，編碼谷氨酸脫氫酶；glnA，編碼谷氨酸合成酶；proA，編碼γ-谷氨酸磷酸還原酶；proB，編碼γ-谷氨酸激酶；和proC，編碼吡咯啉-5-羧化物還原酶。一個(gè)實(shí)施方案中，一種氨基酸生物合成選擇標(biāo)記基因可以是脯氨酸生物合成族的至少一個(gè)成員，特別是proA，proB，或proC。特定實(shí)施方案中，這種脯氨酸生物合成選擇標(biāo)記基因可以包括一種proC基因。proC基因編碼一種酶催化脯氨酸生物合成途徑的最后一步。在細(xì)菌中，脯氨酸(也就是，L-脯氨酸)生物合成途徑包含一個(gè)三-酶步驟，起始于L-谷氨酸。這一過(guò)程的步驟為1)L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸-5-磷酸，通過(guò)谷氨酸-5-激酶(“GK”；EC2.7.2.11)，由proB編碼；隨后2a)轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸-5-半醛，通過(guò)谷氨酸-5-半醛脫氫酶(EC1.2.1.41)，也稱為谷氨酸-5-磷酸還原酶(“GPR”)，由proA編碼，進(jìn)而進(jìn)行2b)它們的自發(fā)的環(huán)化作用形成1-吡咯啉-5-羧酸酯；并且隨后3)轉(zhuǎn)化成L-脯氨酸，通過(guò)Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶(“P5CR”；EC1.5.1.2)，由proC編碼。在大多數(shù)細(xì)菌中，編碼P5CR亞基的proC，具有活性的它的人類-多聚體形式的P5CR酶。在細(xì)菌中其中一種或者多種proA，proB，或proC基因已經(jīng)失去活性或者丟失，或者突變成為編碼一種非功能的酶，如果向培養(yǎng)基中添加脯氨酸則這種細(xì)胞也可以生長(zhǎng)。因此，一種proC(-)假單胞菌或者相關(guān)的細(xì)胞可以維持在一種含有脯氨酸的培養(yǎng)基上。在將含有proC基因的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到proC(-)細(xì)胞并且表達(dá)形成一種功能的P5CR酶，得到的結(jié)合的proC(+)質(zhì)粒宿主細(xì)胞系統(tǒng)可以在一種缺少脯氨酸的培養(yǎng)基上供養(yǎng)。在假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞中使用的ProC基因的編碼序列可以通過(guò)任意的編碼Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶(P5CR)的基因來(lái)提供，如果這種編碼序列可以被選擇的宿主細(xì)胞或者相關(guān)的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，翻譯，和其它的過(guò)程來(lái)形成功能性的P5CR。這種proC編碼序列可以是天然的序列，或者它可以是一種工程化的序列來(lái)自于，例如，使用本領(lǐng)域已知的一種或者多種序列-修改，序列-結(jié)合，和/或序列生成技術(shù)。在使用作為proC選擇標(biāo)記基因一部分之前，這種選擇的編碼序列可以按照所選擇的假單胞菌或者相關(guān)的宿主細(xì)胞的遺傳密碼和/或密碼子使用頻率進(jìn)行改良或優(yōu)化?？梢员磉_(dá)的密碼組列可以操作性地連接到可以在選擇的細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以及所有其它的需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。一種前面描述的天然的proC基因密碼子序列可以從一種細(xì)菌或者任意的其它生物體中獲得，如果它符合上面描述的條件。一個(gè)實(shí)施方案中，這種proC編碼序列分離自假單胞菌或相關(guān)的宿主細(xì)胞其中它可以被用作一種選擇標(biāo)記。完整的proC基因(包括編碼序列和周圍的調(diào)控區(qū)域)可以從它們中分離出來(lái)。特定實(shí)施方案中，一種提供proC基因或編碼序列的細(xì)菌可以選自的組包括假單胞菌目中的一員，假單胞菌亞目中的一員，假單胞菌科中的一員，假單胞菌族中的一員，假單胞菌屬中的一員，和熒光假單胞菌種組中的一員(也就是，“熒光假單胞菌”)。特定實(shí)施方案中，這種細(xì)菌屬于這種品種，熒光假單胞菌。特定實(shí)施方案中，proC基因包含SEQIDNO.6(表7)的核酸序列，或者它的突變體?？梢赃x擇地，由proC基因編碼的P5CR包含SEQIDNO.7(表8)的氨基酸序列，它的突變體，或者一種與其相比具有冗余密碼子序列的突變體，按照本發(fā)明所述的指定宿主細(xì)胞中使用的遺傳密碼?？梢赃x擇地，這種proC基因包含編碼一種P5CR酶的核酸序列，其與SEQIDNo.6具有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％，和95％的同源性。同樣地，編碼ODCase的proC基因與SEQIDNo.7具有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％，和95％的同源性。另一個(gè)實(shí)施方案中，proC基因可以包含一種編碼序列其與SEQ.IDNO.8(表9)的核酸序列具有至少90％，93％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性。特定實(shí)施方案中，proC可以包含一種編碼序列，其具有可以與SEQIDNO.8的反密碼子序列雜交的密碼子序列，當(dāng)在高嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交的時(shí)候，或者可以具有一種與之相比冗余的密碼子序列。特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，proC基因可以包含SEQIDNO.8的核酸序列。表.7-熒光假單胞菌proC核酸序列表.8-熒光假單胞菌P5CR氨基酸序列表.9-熒光假單胞菌proC核酸序列使用選擇標(biāo)記一個(gè)實(shí)施方案中，一種包含在代謝物中的分解利用的酶可以選擇作為營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記。特別是，這種酶可以選自那些碳源的利用中的酶。這種酶的例子包括，例如，蔗糖酶，乳糖酶，麥芽糖酶，淀粉分解代謝酶，糖元分解代謝酶，纖維素酶，和聚合(羥基鏈烷酸酯(hydroxyalkanoate))解聚酶。如果這種細(xì)菌宿主細(xì)胞表現(xiàn)出選擇的類型的天然的分解代謝活性，它可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷-回復(fù)載體的轉(zhuǎn)化之前被敲除。對(duì)這些化合物表現(xiàn)出天然的營(yíng)養(yǎng)缺陷的細(xì)菌也可以按照它們的原始形態(tài)來(lái)用作這種轉(zhuǎn)化。在那些實(shí)施方案中其中不能被引進(jìn)或者不能擴(kuò)散到細(xì)胞中的化合物可以被選擇和提供給培養(yǎng)基，原養(yǎng)回復(fù)(prototrophyrestoring)或者原養(yǎng)能力(prototrophy-enabling)的酶可以被分泌來(lái)使用。在這種情況下，選擇的酶可以在細(xì)胞外降解這種化合物來(lái)生產(chǎn)更小的化合物，例如葡萄糖，其可以散播或者進(jìn)口到細(xì)胞中，通過(guò)選擇或者設(shè)計(jì)這種酶的密碼子序列來(lái)包括一種可以在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的分泌信號(hào)肽的編碼序列。在這些實(shí)施方案中，這種原養(yǎng)回復(fù)基因可以被選擇或著被設(shè)計(jì)成包括一種可以在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的分泌信號(hào)肽的編碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)這種酶在細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)移。在這些實(shí)施方案中的另一個(gè)中，或者那些其中所選擇的化合物可以在引進(jìn)或者擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞中，這種細(xì)胞可以在不提供除選擇的化合物外沒(méi)有其它的碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在碳源-利用-基礎(chǔ)的標(biāo)記系統(tǒng)中，每一種原養(yǎng)回復(fù)或者原養(yǎng)能力的碳源利用酶可以包含在單一碳源的利用中。例如，來(lái)自同一分解代謝途徑的兩種基因可以在一種載體上一起進(jìn)行表達(dá)或者可以分別在不同的載體上進(jìn)行共表達(dá)從而提供原養(yǎng)。這種多基因碳源利用基礎(chǔ)的標(biāo)記系統(tǒng)的特定的實(shí)施例包括，例如，使用糖元作為單一的碳源，具有糖元磷酸化酶和(α-1，4)葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；并且使用淀粉作為單一的碳源，具有α-淀粉酶，和α(1-＞6)-葡萄糖苷酶兩種酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。但是，選擇的單一-或多-基因碳源標(biāo)記系統(tǒng)可以在宿主細(xì)胞中與其它的標(biāo)記系統(tǒng)一起使用，如果提供給細(xì)胞的單一碳源是選擇的在碳源分解代謝選擇標(biāo)記系統(tǒng)中的使用的化合物。生化-利用-型活性的有用的酶的其它的實(shí)施例是本領(lǐng)域所公知的，并且可以包括消旋酶和差向異構(gòu)酶，其可以轉(zhuǎn)化提供給細(xì)胞的非-利用的D-碳源為營(yíng)養(yǎng)的L-碳源。這些系統(tǒng)的實(shí)施例包括，例如D-酸或D-?；衔锱c相關(guān)的消旋酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)一起使用；并且乳酸鹽和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的乳酸消旋酶一起使用。相似地，其中氨基酸生物合成活性被選擇在標(biāo)記系統(tǒng)中使用，這種營(yíng)養(yǎng)缺陷體也可以通過(guò)向這種細(xì)胞提供一種不可利用的R-氨基酸和一種R-氨基酸消旋酶或者差向異構(gòu)酶(EC5.1.1)而被克服，消旋酶或者差向異構(gòu)酶可以為這種營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)胞將R-氨基酸轉(zhuǎn)化成相關(guān)的L-氨基酸在。特性堆積按照本發(fā)明也可以對(duì)一種宿主細(xì)胞進(jìn)行大量的表型的改變，在插入一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記基因之前或之后，來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的表達(dá)。例如，這種細(xì)胞可以是遺傳工程化的，或者是同時(shí)進(jìn)行地或者按次序地，來(lái)表現(xiàn)大量的增強(qiáng)的表型特點(diǎn)，這一過(guò)程被稱為“特性堆積”(traitstacking)。pryF刪除可以作為這種表型的特性之一。在這樣一個(gè)菌株中，pyrF基因，按照本發(fā)明，可以被用作一種自毀的載體，即可作為選擇的標(biāo)記又可作為反向選擇的標(biāo)記(在提供5’-氟乳清酸下)從而實(shí)現(xiàn)與其它的所需特性插入/刪除的等位基因交換，因此，按照本發(fā)明pyrF基因可以在宿主細(xì)胞中的“特性堆積”過(guò)程中進(jìn)行使用。在這種過(guò)程中，包含這種pyrF基因的自毀載體可以在這種宿主細(xì)胞菌株中在大量的分離轉(zhuǎn)化中進(jìn)行轉(zhuǎn)化；在每一個(gè)這種程序中所重新建立的pyrF顯型可以用于生產(chǎn)，無(wú)限地，進(jìn)一步遺傳地提高的表型改變。因此，不僅pyrF基因自身可以提供一種特性，它可以在特性-堆積過(guò)程中用作獲得另外的顯型特性。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌和相關(guān)的細(xì)菌其已經(jīng)進(jìn)一步地基因修飾來(lái)引起額外的營(yíng)養(yǎng)缺陷。例如，pyrF(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷可以進(jìn)一步修飾來(lái)使在合成代謝或者分解代謝途徑中的另一種生物合成酶失去活性，例如通過(guò)將proC基因或thyA基因失去活性。在這種方法中，在宿主細(xì)胞中可以產(chǎn)生多個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷。另一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因改變來(lái)對(duì)宿主細(xì)胞中的重組多肽表達(dá)進(jìn)行改善。進(jìn)一步修飾可以包括遺傳改變其允許更有效的利用一種特定的碳源，因此優(yōu)化這種整個(gè)的發(fā)酵的全功效。特定實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞可以通過(guò)向宿主染色體中插入一種包含lacI轉(zhuǎn)基因來(lái)進(jìn)一步修飾。優(yōu)選地，這種lacI轉(zhuǎn)基因，或者它的突變體，不同于整體的一部分或者截?cái)嗟暮蠵lacI-lacI-lacZYA構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)基因。誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)缺陷的修飾選擇作為本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)中使用的假單胞菌或相關(guān)的宿主細(xì)胞在它的能力上不能表達(dá)任意的表現(xiàn)選擇的營(yíng)養(yǎng)缺陷活性的功能性生物催化劑。例如，這里選擇的是乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(orotodine-5’-phosphatedecarboxylase)活性，宿主細(xì)胞在它的能力上不能表達(dá)a)任意的pyrF基因產(chǎn)物(也就是任意的功能性O(shè)DCase酶)，和b)任意的有效的替換(也就是任意的其它具有ODCase活性的生物催化劑)。一個(gè)實(shí)施方案中，這種宿主細(xì)胞通過(guò)改變它的染色體基因而制成對(duì)于選擇的活性生物催化-無(wú)效的，因此這種細(xì)胞不能從它的染色體表達(dá)在目標(biāo)的營(yíng)養(yǎng)缺陷體(也就是ODCase)中使用一種功能性的酶的。換句話，這種原養(yǎng)型的細(xì)胞(活性(+)細(xì)胞)將通過(guò)“敲除”目標(biāo)的原養(yǎng)型的途徑(也就是一種活性(-)細(xì)胞)中的功能性酶的編碼基因來(lái)實(shí)現(xiàn)成為營(yíng)養(yǎng)缺陷。這種改變可以通過(guò)改變細(xì)胞中的編碼所選擇活性的基因的染色體編碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案中，這種編碼序列改變可以通過(guò)誘導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)插入或刪除突變，其改變編碼序列的閱讀框；替換或者倒置突變其改變密碼子的足夠數(shù)量；和/或刪除突變，其從可以生產(chǎn)一種無(wú)功能性的酶中刪除了足夠大組(sufficientlylargegroup)的連續(xù)密碼子。一個(gè)實(shí)施方案中其中這種宿主細(xì)胞菌株也已經(jīng)提供了營(yíng)養(yǎng)缺陷基因來(lái)作為選擇標(biāo)記使用，優(yōu)選地選擇的基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列中的每一個(gè)也可以通過(guò)誘導(dǎo)突變而失去活性，包括刪除突變。例如，除了上面所述的編碼序列改變外轉(zhuǎn)錄序列失活可以隨意地進(jìn)行。一個(gè)實(shí)施方案中，其中宿主細(xì)胞菌株也可以提供營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記基因，所有的選擇基因的DNA可以從宿主細(xì)胞染色體中刪除。這種敲除的菌株可以按照本領(lǐng)域中已知的認(rèn)為有效的任意不同的方法來(lái)制備。例如，含有同源的目標(biāo)基因序列所需的的5′和3′端刪除的核酸序列的同源編碼載體可以被轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。理想地，一旦同源重組體，可以生產(chǎn)一種所需的目標(biāo)酶基因敲除?；蚯贸椒ǖ奶囟▽?shí)施例包括，例如通過(guò)前面已經(jīng)描述的一種多聚核苷酸的插入來(lái)使基因失活。參考，例如，DLRoeder和AColler，Marker-exchangemutagenesisofapectatelyaseisozymegeneinErwiniachrysanthemi，JBacteriol.164(1)51-56(1985)。可以選擇地，對(duì)于所需的顯型(例如不能代謝安息香酸鹽或氨基苯甲酸鹽)的轉(zhuǎn)位子突變形成和選擇可以被用于分離細(xì)菌菌株其中目標(biāo)基因已經(jīng)通過(guò)插入而失活。參考，例如，KNida和PPCleary，InsertionalinactivationofstreptolysinSexpressioninStreptococcuspyogenes，JBacteriol.155(3)1156-61(1983)。在特定的基因中特定的突變或刪除可以使用盒突變來(lái)進(jìn)行構(gòu)建，例如，如JAWells等人所描述的，Cassettemutagenesisanefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites，Gene34(2-3)315-23(1985)；在一種基因的選擇的部分上進(jìn)行定點(diǎn)的或者隨意的突變，并且隨后通過(guò)同源性重組體組合到基因的染色體拷貝中。一個(gè)實(shí)施方案中，得到選擇標(biāo)記基因的生物體或者使用這種選擇標(biāo)記基因的宿主細(xì)胞可以選自一種原核生物。特定實(shí)施方案中，得到選擇標(biāo)記基因的生物體或者使用這種選擇標(biāo)記基因的宿主細(xì)胞可以選自一種細(xì)菌。另一個(gè)實(shí)施方案中，得到選擇標(biāo)記基因的細(xì)菌或者使用這種選擇標(biāo)記基因的細(xì)菌宿主細(xì)胞，將可以選自變形桿菌。另一個(gè)實(shí)施方案中，得到選擇標(biāo)記基因的細(xì)菌或者使用這種選擇標(biāo)記基因的細(xì)菌宿主細(xì)胞，可以選自假單胞菌和緊密相關(guān)的細(xì)菌或者來(lái)自于它的亞群，如下面所描述的。特定實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因來(lái)源的生物體和宿主細(xì)胞可以選自相同的種。優(yōu)選地，該種可以是原核生物；更優(yōu)選是一種細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選一種變形桿菌。在另一特定實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因來(lái)源的生物體或者宿主細(xì)胞可以選自假單胞菌和緊密相關(guān)的細(xì)菌或者來(lái)自于它的亞群的屬相同的種，如下面定義的。一個(gè)實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因來(lái)源的生物體或者宿主細(xì)胞可以選自一個(gè)假單胞菌屬的種，特別是熒光假單胞菌的種，并且優(yōu)選是熒光假單胞菌生物型A的種。III.LACI插入本發(fā)明提供了假單胞菌和相關(guān)的細(xì)胞其已經(jīng)進(jìn)行了基因修飾來(lái)包含不同于整體的一部分或者截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA操縱子的lacI轉(zhuǎn)基因或者衍生物的染色體插入。一個(gè)實(shí)施方案中，lacI插入提供了嚴(yán)緊的表達(dá)載體調(diào)控，通過(guò)LacI抑制蛋白的表達(dá)其在這個(gè)載體上結(jié)合了lacO序列或衍生物，并且抑制了載體上的Plac-Ptac家族啟動(dòng)子。結(jié)果是在誘導(dǎo)前重組多肽表達(dá)的基礎(chǔ)水平降低了。一個(gè)實(shí)施方案中，提供含有一種天然的大腸桿菌lacI基因的染色體插入，或者lacI基因衍生物例如lacIQ或lacIQI假單胞菌宿主細(xì)胞，其中這種lacI插入不是作為整體的一部分或者截?cái)嗟暮蠵lacI-lacI-lacZYA構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明中使用的其它lacI轉(zhuǎn)基因的衍生物包括已經(jīng)改變了密碼子序列不同于天然的lacI基因的lacI衍生物(例如，含有一種“gtg”起始密碼子的天然的大腸桿菌lacI基因，并且這可以被一種可以替換的在所選擇表達(dá)載體細(xì)胞中可以有效的起始翻譯的起始密碼子替換，例如“atg”)；lacI衍生物，其編碼具有突變的氨基酸序列的LacI蛋白，包括溫度-敏感性lacI突變體，例如其被lacIts(或“l(fā)acI(Ts)”)編碼，其對(duì)應(yīng)于一種溫度的變更來(lái)獲得目標(biāo)基因誘導(dǎo)，例如，升高到42℃(參考，例如，Bukrinskyetal.，Gene70415-17(1989)；NHasan&WSzybalski，Gene163(1)35-40(1995)；HAdarietal.，DNACellBiol.14945-50(1995))；lacI突變體對(duì)應(yīng)于提供可選擇的蔗糖代替乳糖來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，例如，樹(shù)膠醛糖，核糖，或者半乳糖(參考，例如，WO99/27108對(duì)于具有改變的敏感度的Lac抑制蛋白)；以及LacI突變體，其表現(xiàn)出至少野生型的結(jié)合到lac操縱基因的能力，但是提高了對(duì)于一種誘導(dǎo)物的敏感度(例如，IPTG)，或者其表現(xiàn)出提高的連接到lac操縱基因的能力，但是至少野生型的去抑制能力(參考，例如，LSwint-Kruseetal.，Biochemistry42(47)14004-16(2003))。特定實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因插入到染色體中與天然的大腸桿菌lacI基因相同，并且具有SEQIDNO.9(表10)的核酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，插入到宿主染色體中的基因編碼Lac抑制蛋白，其具有SEQIDNO.10(表11)的氨基酸序列。表10-天然大腸桿菌lacI基因的核酸序列表.11-LacI阻遏物的氨基酸序列可替換實(shí)施方案中，插入的lacI轉(zhuǎn)基因是天然大腸桿菌lacI基因的衍生物。特定實(shí)施方案中，lacI衍生的基因是具有SEQIDNO.11(表12)的核酸序列的lacIQ基因。LacIQ突變體與天然的大腸桿菌lacI基因是同一的除了在啟動(dòng)子的-35區(qū)域具有單一的點(diǎn)突變，其在大腸桿菌中10倍地增加了lacI阻遏物的水平。參見(jiàn)，例如，MPCalos，Nature274(5673)762-65(1978)。表.12-LacIQ基因的核酸序列另一個(gè)實(shí)施方案中，lacI衍生基因是具有SEQIDNO.12(表13)核酸序列的lacIQI基因。LacIQI突變具有一個(gè)重排，其取替了與大腸桿菌-35區(qū)域保守序列嚴(yán)格匹配的-35區(qū)域的核酸序列，產(chǎn)生的表達(dá)其比大腸桿菌中的原始啟動(dòng)子高出100倍。參見(jiàn)，例如，MPColas&JHMiller，Mol.&Gen.Genet.183(3)559-60(1980)。表.13-LacIQI基因的核酸序列本發(fā)明中，宿主細(xì)胞染色體可以通過(guò)插入至少一種含有至少一個(gè)編碼LacI蛋白基因的拷貝的核酸序列，這種基因可以被細(xì)胞所使用來(lái)，優(yōu)選地，組成地表達(dá)編碼的LacI蛋白，并且含有這種基因的多聚核苷酸不是PlacI-lacI-lacZYA核酸序列(也就是PlacI-lacl-lacZYA操縱子的Plac(-)變體)或者PlacI-lacI-lacZ多聚核苷酸(也就是一種包含這種Plac(-)操縱子的一部分的結(jié)構(gòu)的lac利用操縱子基因，例如至少部分地截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA核酸序列變體)。編碼選擇的LacI蛋白的基因優(yōu)選組成型地表達(dá)。這可以通過(guò)任意在所選擇的表達(dá)宿主細(xì)胞中是組成型表達(dá)的啟動(dòng)子來(lái)完成。例如，一種天然的大腸桿菌PlacI可以操作地連接到選擇的lacI編碼基因，或者不同的組成型表達(dá)啟動(dòng)子可以操作性地連接到其上。在一些情況下，一種調(diào)控的啟動(dòng)子可以被使用，如果這種調(diào)控的啟動(dòng)子在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中維持一種狀態(tài)其中LacI蛋白在那里是連續(xù)表達(dá)的。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的是一種lac或tac家族啟動(dòng)子，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PlacUV5，lpp-PlacW5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。染色體組插入位點(diǎn)染色體插入可以按照本領(lǐng)域中已知的任意技術(shù)來(lái)完成。例如，參考DSToder，″GenereplacementinPseudomonasaeruginosa，″MethodsinEnzymology235466-74(1994)；和JQuandt&MFHynes，″VersatilesuicidevectorswhichallowdirectselectionforgenereplacementinGramnegativebacteria，″Gene127(1)15-21(1993)。轉(zhuǎn)位子插入技術(shù)例如是本領(lǐng)域中所公知的，隨著選擇，也可以被使用；參考，例如，IYGoryshin&WSReznikoff，″Tn5invitrotransposition，″JournalofBiologicalChemistry273(13)7367-74(1998)?？蛇x擇地，通過(guò)(非裂解的)噬菌體轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)染也可以被用作染色體插入；參考，例如，JHMiller，ExperimentsinMolecularGenetics(1972)(ColdSpringHarborLab.，NY)。在細(xì)菌表達(dá)宿主細(xì)胞染色體中的位點(diǎn)，其對(duì)插入了lacI基因，或其衍生物是有用的位點(diǎn)，包括任意其在所使用的發(fā)酵條件下對(duì)于細(xì)胞功能是不需要的位置，例如在任意的基因中其存在，轉(zhuǎn)錄，或者表達(dá)在所使用的發(fā)酵條件下對(duì)于細(xì)胞的健康功能是重要的。這種插入位點(diǎn)的說(shuō)明性的實(shí)施例包括，但是不限于，蔗糖引入和代謝基因(例如，sacB)，果糖引入和代謝基因(例如，果糖激酶基因，1-磷酸果糖激酶基因)，芳香族的碳源引入和利用基因(例如，氨基苯甲酸鹽操縱子基因，例如antABC基因，安息香酸鹽操縱子基因，作為benABCD基因)，β-內(nèi)酰胺酶基因(例如，ampC，blII，blc基因，blo基因，blp基因)，堿性磷酸酶基因(例如，phoA)，核酸酶或核酸生物合成基因(例如，pyrBCDEF基因)，氨基酸生物合成基因(例如，proABC基因)，天冬氨酸半醛脫氫酶基因(例如，asd)，3-異丙基脫氫酶基因(例如，leuB)，和氨基苯甲酸鹽合成基因(例如，trpE)。在任意的實(shí)施方案中其中這種基因插入導(dǎo)致了或者伴隨營(yíng)養(yǎng)缺陷，隨后或者將宿主細(xì)胞在一種提供有效的替代代謝物培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使細(xì)胞克服(和避免)致命影響，或者在宿主細(xì)胞中提供一種替代基因，其表達(dá)生物催化效用來(lái)回復(fù)相應(yīng)的原養(yǎng)型(protorophy)，例如，作為一種選擇標(biāo)記基因。構(gòu)建一種代謝作用的營(yíng)養(yǎng)缺陷的失活(如敲除)或者刪除所選擇的基因或多個(gè)基因可以是任意編碼其在代謝途徑中是有作用的酶的基因。這種酶可以是一種對(duì)于細(xì)胞存活是必需的合成代謝生物催化中的分子?？梢赃x擇地，這種酶可以是一種對(duì)于細(xì)胞存活是必需的分解代謝生物催化中的分子。優(yōu)選地，所有的編碼一種給定的生物催化活性基因被可操作刪除或者失活來(lái)保證在構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主細(xì)胞中從宿主細(xì)胞中刪除目標(biāo)酶活性?？蛇x擇地，宿主細(xì)胞可以表現(xiàn)出一種預(yù)先存在的營(yíng)養(yǎng)缺陷(也就是，天然的營(yíng)養(yǎng)缺陷)，其中沒(méi)有通過(guò)所需的刪除或者失活(如敲除)來(lái)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步遺傳修飾。例如，一種氨基酸生物合成基因(例如，proA，proB，或者proC基因)或者一種核酸酶或者核酸生物合成基因(例如，pyrB，pyrC，pyrD，pyrE，或pyrF)可以被用作插入位點(diǎn)，在這種情況下一種所需的生物催化活性是正常地破壞的，因此產(chǎn)生一種營(yíng)養(yǎng)缺陷。在這種情況下，或者1)這種培養(yǎng)基是補(bǔ)償脯氨酸或者尿嘧啶補(bǔ)償物來(lái)避免在生物催化途徑中的代謝依賴，補(bǔ)償；或者2)營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞被一種另外的例如proC，pyrF，或thyA的代謝選擇標(biāo)記基因基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化其表達(dá)并且隨后替代從生物合成途徑中丟失的生物催化劑，因此回復(fù)了細(xì)胞的原養(yǎng)性。特定實(shí)施方案中，lacI轉(zhuǎn)基因，或者它的突變體，被插入到一種細(xì)胞中，其是通過(guò)一種基因的敲除或者與基因結(jié)合引起的伴隨的或者隨后的營(yíng)養(yǎng)缺陷，其選自的組包括pyrF，thyA，和proC。特定實(shí)施方案中，天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因被插入到細(xì)胞中，其是通過(guò)proF的敲除而伴隨的或者隨后來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)缺陷。另一實(shí)施方案中，天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因被插入到細(xì)胞中，其是通過(guò)proC的敲除而伴隨的或者隨后來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)缺陷。另一個(gè)實(shí)施方案中，一種天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因被插入到細(xì)胞中，其是伴隨的或者隨后通過(guò)pyrF和proC的敲除來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)缺陷。另一個(gè)實(shí)施方案中，天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因，或其衍生物，可以被插入到宿主細(xì)胞的果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)。例如，特定實(shí)施方案中，天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因，或其衍生物，可以被插入到熒光假單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位點(diǎn)。特別是，天然的大腸桿菌lacI，lacIQ，或lacIQI轉(zhuǎn)基因，或其衍生物，可以被插入到具有SEQID.NO.13(表14)的核酸序列的熒光假單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位點(diǎn)。表.14-熒光假單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位點(diǎn)的開(kāi)放閱讀框IV.LacO序列抑制啟動(dòng)子泄漏的嘗試必須在目標(biāo)的重組聚合肽表達(dá)中被潛在的伴隨的縮減來(lái)平衡。進(jìn)一步抑制一種啟動(dòng)子和減少啟動(dòng)子的泄漏的目的是為了對(duì)被認(rèn)為是操縱基因序列的調(diào)控序列來(lái)修飾，來(lái)增加相關(guān)的抑制蛋白結(jié)合到操縱基因序列的能力，而沒(méi)有在誘導(dǎo)中減少目標(biāo)重組多肽的潛在表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在熒光假單胞菌中雙重lac操縱基因的使用提供了對(duì)于預(yù)先誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的更好的抑制，而沒(méi)有誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)量的相應(yīng)減少。一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌生物體被提供包含一種核酸構(gòu)建體，其包含一種核酸，該核酸具有至少一種參與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抑制的lacO序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包含多于一種的lacO序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括至少一種，并且優(yōu)選多于一種的lacOid序列。一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包括lacO序列，或其衍生物，位于啟動(dòng)子的3’端，以及l(fā)acO序列，或其衍生物，位于啟動(dòng)子的5’端。特定實(shí)施方案中，這種lacO衍生物是lacOid序列。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在假單胞菌宿主細(xì)胞中使用的核酸構(gòu)建體含有多于一種的lac操縱基因序列，或其衍生物。一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種lac操縱基因可以是lacOid序列。天然的大腸桿菌在誘導(dǎo)劑缺乏的情況下，充當(dāng)調(diào)低lac操縱基因表達(dá)的作用。為了這個(gè)目的，lac操縱基因被LacI抑制蛋白所結(jié)合，抑制了操縱子的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)確定了在相同的DNA分子上LacI蛋白可以同時(shí)地結(jié)合到兩個(gè)lac操縱基因。參考，例如，Mulleretal.，(1996)″Repressionoflacpromoterasafunctionofdistance，phase，andqualityofanauxiliarylacoperator，″J.Mol.Biol.25721-29。這種抑制可以通過(guò)接近啟動(dòng)子的操縱基因O1和兩個(gè)輔助的操縱基因O2和O3進(jìn)行調(diào)整，O2和O3在lacZ基因的密碼子區(qū)域中分別位于O1下游的401堿基對(duì)和O1上游的92堿基對(duì)(參考圖4)。使用一個(gè)理想的lac操縱基因(Oid)來(lái)代替天然的大腸桿菌lac操縱基因序列，從而導(dǎo)致在大腸桿菌中原始lac操縱子抑制的增加。參考Mulleretal.，(1996)″Repressionoflacpromoterasafunctionofdistance，phase，andqualityofanauxiliarylacoperator，J.Mol.Biol.25721-29。lacO序列或者衍生物可以在大腸桿菌中位于一種啟動(dòng)子的天然的O1位置?？梢赃x擇地，lacO序列或衍生物可以位于一種啟動(dòng)子的O3位置。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種lacO序列或者替代物可以位于大腸桿菌天然的O1位置，天然的O3位置，或者對(duì)于一種啟動(dòng)子的兩者的位置。一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包括至少一種lacOid序列或者位于啟動(dòng)子序列的5’端或者位于啟動(dòng)子序列的3’端。特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子3’端的lacOid序列，以及至少一種lacO序列，或其衍生物，啟動(dòng)子的5’端。可替換實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含lacOid序列的啟動(dòng)子的5’端，以及至少一種lacO序列，或其衍生物，啟動(dòng)子的3’端。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包含lacOid序列的啟動(dòng)子5’和3’端。特定實(shí)施方案中，這種lacO序列是SEQIDNO.14所代表的lacOid，或者基本同源的序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，使用SEQID.NO.59的lacOid序列，或者與SEQIDNO.59的序列基本同源的序列。表.15-LacOID序列V.分離的核酸和氨基酸本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供在改進(jìn)的蛋白生產(chǎn)中使用的核酸序列。一個(gè)實(shí)施方案中，提供在營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌宿主細(xì)胞中使用的編碼原養(yǎng)型回復(fù)酶的核酸序列。特定實(shí)施方案中，提供了純化于熒光假單胞菌的編碼含氮堿基化合物生物合成酶的核酸序列。一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中編碼pyrF基因的核酸序列(SEQ.IDNo.s1和3)。另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中編碼thyA基因的核酸序列(SEQ.IDNo.4)。另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了從熒光假單胞菌生物體中純化的編碼種氨基酸生物合成化合物的核酸序列。特定實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中編碼proC基因的核酸序列(SEQ.IDNo.s6and8)。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在改良的蛋白生產(chǎn)中使用的新的氨基酸序列。一個(gè)實(shí)施方案中，提供了從熒光假單胞菌生物體中純化到的含氮堿基化合物生物合成酶的氨基酸序列。一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種含有SEQ.IDNo.2的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種包含SEQ.ID.No.5的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了從熒光假單胞菌中分離到的氨基酸生物合成酶的氨基酸序列。特定實(shí)施方案中，提供了一種含有SEQ.IDNo.7的氨基酸序列。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是新的分離的熒光假單胞菌pyrF基因的核酸序列(表2，Seq.IDNo.1；表4，Seq.IDNo.3)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了熒光假單胞菌pyrF基因的分離的肽序列(表3，Seq.IDNo.2)。提供了含有與Seq.IDNos.1，2，或3至少90％，95％，98％或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷酸和肽的序列，其含有SeqIDNos1，2，或3的至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000個(gè)連續(xù)的核酸或氨基酸。進(jìn)一步提供的是SeqIDNos1，2，或3的片段，衍生物和類似物。SeqIDNos1，2，或3的片段可以包括任意連續(xù)的核酸或肽序列，其包括至少大約10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是新的分離的熒光假單胞菌thyA基因的核酸序列(表5，Seq.IDNo.4)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了分離的熒光假單胞菌thyA基因的肽序列(表6，Seq.IDNo.5)。提供了含有與Seq.IDNos.4或5至少90，95，98或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷和肽序列，其含有與SeqIDNos4或5至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000個(gè)連續(xù)的核酸或氨基酸。進(jìn)一步提供的是Seq.IDNos.4或5的片段，衍生物和類似物。Seq.IDNos.4或5的片段可以包括任意的連續(xù)的核酸或肽序列其包括至少大約10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是新的分離的熒光假單胞菌proC基因的核酸序列(表7，Seq.IDNo.6；表9，Seq.ID.No.8)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了分離的熒光假單胞菌proC基因的氨基酸序列(表8，Seq.IDNo.7)。提供了含有與Seq.IDNos.6，7，或8至少90，95，98或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷和肽序列，其含有SeqIDNos6，7，或8的至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000個(gè)連續(xù)的核酸或氨基酸。進(jìn)一步提供的是Seq.IDNos.6，7，或8的片段，衍生物和類似物。Seq.IDNos.6，7，或8的片段可以包括任意連續(xù)的核酸或肽序列其包括至少大約10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。序列同源性序列同源性被按照本領(lǐng)域中公知的任意不同的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。有用的序列比對(duì)和同源性確定方法的實(shí)例包括下面所述的那些。同源性序列的比對(duì)和搜索可以利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心提供(NCBI)程序，MegaBLAST(通常位于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行。使用這一程序并且選項(xiàng)為氨基酸序列設(shè)定為70％的百分比同一性，或者核酸序列設(shè)定為90％的百分比同一性，將確定那些與所提交的序列有70％，或90％，或更高的同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域已知的其它的軟件也是可以利用來(lái)比對(duì)和/或搜索同源性序列，例如，與一個(gè)含有一種本發(fā)明所述的啟動(dòng)子堿基序列或編碼催化劑蛋白堿基序列的信息串具有至少70％或90％同源性的序列。例如，用于與提交的序列相比具有至少70％或90％同源性的確定序列比對(duì)的可以使用以下程序進(jìn)行，例如，GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA，和TFASTA程序，已知存在于GCG程序分析軟件包(已知來(lái)自于遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(GeneticsComputerGroup)，維斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心(UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter)，1710UniversityAvenue，Madison，Wis.53705)，使用默認(rèn)的參數(shù)作為那里所制定的，加上用于將同一性程度設(shè)定成70％或90％的參數(shù)。而且，例如，也可以使用CLUSTAL程序(已知位于PC/Gene軟件包，來(lái)自于Intelligenetics，MountainView，Cal.)。這些和其它的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域中已知的并且可以被進(jìn)行，通過(guò)手工比對(duì)，通過(guò)視覺(jué)檢查，或者通過(guò)一種序列比對(duì)運(yùn)算的手工的或者自動(dòng)的使用，例如上面所述的程序中所收錄的任意的方法。不同的有用的運(yùn)算法則包括，例如，相似的搜索方法描述在W.R.Pearson&D.J.Lipman，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA852444-48(Apr1988)；當(dāng)?shù)氐耐葱苑椒枋鲈赥.F.Smith&M.S.Waterman，inAdv.Appl.Math.2482-89(1981)和在J.Molec.Biol.147195-97(1981)；同源性比對(duì)方法描述在S.B.Needleman&C.D.Wunsch，J.Molec.Biol.48(3)443-53(Mar1970)；以及不同的方法描述在，例如，由W.R.Pearson，在Genoinics11(3)635-50(Nov1991)；由W.R.Pearson，在MethodsMolec.Biol.24307-31和25365-89(1994)；和由D.G.Higgins&P.M.Sharp，在Comp.Appl′nsinBiosci.5151-53(1989)以及在Gene73(1)237-44(15Dec1988)中。在高度嚴(yán)緊的雜交條件下實(shí)施的核酸雜交也是有用的技術(shù)，用來(lái)獲得在這里使用的充足同源性的序列。VI.核酸構(gòu)建體在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在肽的改良生產(chǎn)中使用的核酸構(gòu)建體來(lái)。一個(gè)實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞中使用的核酸構(gòu)建體包括a)編碼重組多肽的核酸序列，以及b)提供了編碼一種具有原養(yǎng)型能力的酶的核酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括c)一種Plac-Ptac家族啟動(dòng)子。另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括d)至少一種lacO序列，或衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的3’端。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括e)至少一種lacO序列，或衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的5’端。一個(gè)實(shí)施方案中，衍生的lacO序列可以是lacOid序列。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，被提供的在假單胞菌生物體中用作表達(dá)載體的核酸構(gòu)建體包括a)編碼一種重組多肽的核酸序列，b)一種Plac-Ptac家族啟動(dòng)子，c)至少一種lacO序列，或衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的3’端，d)至少一種lacO序列，或者衍生物，lac或tac家族啟動(dòng)子的5’端。一個(gè)實(shí)施方案中，衍生的lacO序列可以是一種lacOid序列。一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括e)在營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌細(xì)胞中使用的原養(yǎng)性能力的選擇標(biāo)記。特定實(shí)施方案中，假單胞菌生物體是熒光假單胞菌。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，提供的核酸構(gòu)建體包括核酸，其編碼至少一種可以將營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為原養(yǎng)型的生物合成酶。這種生物合成酶是任意的可以使?fàn)I養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞在選擇的培養(yǎng)基上存活的酶，沒(méi)有生物合成酶的表達(dá)，這種宿主細(xì)胞就由于缺乏營(yíng)養(yǎng)缺陷代謝物而不能存活。因此，這種生物合成酶可以是一種酶其可以通過(guò)回復(fù)原養(yǎng)型的能力為營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主補(bǔ)償這種代謝物缺陷，從而在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)缺陷的代謝物添加的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其編碼一種功能性的乳清酸核苷(orotodine)-5’-磷酸脫羧酶，其補(bǔ)償pyrF(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主。特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含一種SEQIDNO.1或3的核酸序列?？商鎿Q實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括一種核酸序列，其編碼SEQIDNO.2的氨基酸序列。另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其編碼一種功能性的胸苷酸合成酶，其補(bǔ)償了thyA(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主。特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含SEQIDNO.4的核酸序列?？蛇x擇實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含一種核酸序列其編碼SEQIDNO.5的氨基酸序列。進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其編碼功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基還原酶，其補(bǔ)償了proC(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主。特定實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包括SEQIDNO.6或8的核酸序列。可替換實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含核酸序列，其編碼SEQIDNO.7的氨基酸序列?？商鎿Q實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其編碼至少一種可以將營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化成原養(yǎng)型的生物合成酶以及另外的非-營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記。這種非-營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記的例子在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括標(biāo)記，其增加了比色的/發(fā)色的或者一種發(fā)光的反應(yīng)，例如lacZ基因、GUS基因、CAT基因、luxAB基因、抗生素抗性選擇標(biāo)記例如兩性霉素B，桿菌肽，碳青霉烯，頭孢霉素，乙胺丁醇，氟喹諾酮類(fluoroquinolones)，異煙肼(isonizid)，頭孢霉素(cephalosporin)，新青霉素(methicillin)，苯甲異噁唑青霉素，萬(wàn)古霉素，鏈霉素，喹啉，利福平，利福平(rifampicin)，磺胺藥物，氨芐青霉素，四環(huán)素，新霉素，先鋒霉素，紅霉素，鏈霉素，卡那霉素，硫酸慶大霉素，，青霉素，和氯霉素抗性基因，或者其它的經(jīng)常使用的非-營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記。另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括多于一種的可以將營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化成原養(yǎng)型的生物合成酶。生物合成酶可以是任意的允許營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主細(xì)胞在所選擇的培養(yǎng)基上存活的酶，沒(méi)有生物合成酶的表達(dá)，這種宿主細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)缺陷代謝物的缺乏將不能存活。因此，這種生物合成酶可以是這樣的酶其通過(guò)回復(fù)原養(yǎng)型的能力補(bǔ)償營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主的代謝缺陷來(lái)在非-營(yíng)養(yǎng)缺陷的補(bǔ)償代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。例如，一種包含第一和第二原養(yǎng)型能力的選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體，允許包含構(gòu)建體的宿主細(xì)胞維持在任一的或者兩種的條件下其中宿主細(xì)胞存活所需要提供選擇標(biāo)記基因。當(dāng)只提供了一種存活依賴的標(biāo)記-基因條件的時(shí)候，相關(guān)的標(biāo)記基因必須被表達(dá)，并且其它的標(biāo)記基因隨后可以是活性的或者非活性的，雖然對(duì)于仍然是營(yíng)養(yǎng)缺陷性的細(xì)胞所所有必須營(yíng)養(yǎng)物將仍由培養(yǎng)基提供。這準(zhǔn)許了在宿主細(xì)胞中相同的目標(biāo)基因，或者相同的共價(jià)連接的目標(biāo)基因的，編碼所需的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和/或所需的轉(zhuǎn)基因活性，的連續(xù)地維持，當(dāng)宿主細(xì)胞在不同的條件下轉(zhuǎn)化的時(shí)候。每一個(gè)所選擇的選擇標(biāo)記基因的單獨(dú)的編碼序列可以操作性地連接到組成型的或者調(diào)控的啟動(dòng)子上。特定實(shí)施方案中，核酸載體包含一種核酸構(gòu)建體，其編碼一種功能性的乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶和一種功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基還原酶，其可以補(bǔ)償補(bǔ)償pyrF(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷性宿主細(xì)胞，proC(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞，或者pyrF(-)/proC(-)雙營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞。特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括SEQIDNO.1或3和SEQID.NO.6或8的核酸序列?？商鎿Q實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含一種核酸序列，其編碼SEQIDNO.2和7的氨基酸序列?？商鎿Q的特定實(shí)施方案中，核酸載體包含一種核酸構(gòu)建體，其編碼功能性的乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶和功能性的胸苷酸合成酶(thymidylatesynthaseenzyme)，其可以補(bǔ)償一種pyrF(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞，thyA(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞，或者pyrF(-)/thyA(-)雙-營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞。特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含SEQIDNO.1或3，和SEQID.NO.4的核酸序列?？商鎿Q實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包含一種核酸序列，其編碼SEQIDNO.2和5的氨基酸序列。特定實(shí)施方案中，核酸載體包含核酸構(gòu)建體，其編碼一種功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基還原酶和胸苷酸合成酶，其可以補(bǔ)償proC(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主細(xì)胞，thyA(-)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主細(xì)胞，或者proC(-)/thyA(-)雙-營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞。特定實(shí)施方案中，這種核酸構(gòu)建體包含SEQIDNO.4，和SEQIDNO.6或8的核酸序列。可替換實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含一種核酸序列其編碼SEQIDNO.5和7的氨基酸序列。啟動(dòng)子在發(fā)酵過(guò)程中，一旦目標(biāo)重組多肽的表達(dá)被誘導(dǎo)，具有高水平的生產(chǎn)是理想的從而將表達(dá)系統(tǒng)的功效最大化。啟動(dòng)子啟動(dòng)了轉(zhuǎn)錄并且通常位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的10-100核苷酸。理想地，啟動(dòng)子可以是充分強(qiáng)大的從而允許重組多肽累積占宿主細(xì)胞的細(xì)胞總蛋白的大約50％，服從嚴(yán)格的調(diào)控，并且容易地誘導(dǎo)(并且是便宜的)。按照本發(fā)明所使用的啟動(dòng)子可以是組成型的啟動(dòng)子或者調(diào)控的啟動(dòng)子。通常地所使用的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和它們的伴隨的誘導(dǎo)劑包括lac(IPTG)，lacUV5(IPTG)，tac(IPTG)，trc(IPTG)，Psyn(IPTG)，trp(色氨酸饑餓)，araBAD(1-樹(shù)膠醛糖)，lppa(IPTG)，lpp-lac(IPTG)，phoA(磷酸鹽饑餓)，recA(萘啶酸)，proU(同滲容摩(osmolarity))，cst-1(葡萄糖饑餓)，tetA(tretracylin)，cadA(pH)，nar(厭氧條件)，PL(熱量遷移(shiftto)到42℃)，cspA(熱量變化到20℃)，T7(熱誘導(dǎo))，T7-lac操縱基因(IPTG)，T3-lac操縱基因(IPTG)，T5-lac操縱基因(IPTG)，T4基因32(T4噬菌體)，nprM-lac操縱基因(IPTG)，Pm(烷基-或鹵-安息香酸鹽)，Pu(烷基-或鹵-甲苯(toluenes))，Psal(水楊酸鹽)，和VHb(氧)。參考，例如，Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；HannigG.&Makrides，S.C.(1998)TIBTECH16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures8，R177-R185。參考，例如，J.Sanchez-Romero&V.DeLorenzo，GeneticEngineeringofNonpathogenicPseudomonasstrainsasBiocatalystsforIndustrialandEnvironmentalProcesses，inManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology(A.Demain&J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASMPress，Washington，D.C.)；H.Schweizer，VectorstoexpressforeigngenesandtechniquestomonitorgeneexpressionforPseudomonads，CurrentOpinioninBiotechnology，12439-445(2001)；和R.Slater&R.Williams，TheExpressionofForeignDNAinBacteria，inMolecularBiologyandBiotechnology(J.Walker&R.Rapley，eds.)pp.125-54(2000)(TheRoyalSocietyofChemistry，Cambridge，UK)。一種啟動(dòng)子具有與所選擇的細(xì)菌細(xì)胞的天然啟動(dòng)子的核酸序列也可以用來(lái)調(diào)控編碼目標(biāo)多肽的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，例如，一種假單胞菌氨基苯甲酸鹽或者安息香酸鹽操縱子啟動(dòng)子(Pant，Pben)。也可以使用串連的啟動(dòng)子其中多于一種啟動(dòng)子共價(jià)連接到另一個(gè)上，不管在序列上相同或者不同的，例如，一種Pant-Pben串連的啟動(dòng)子(內(nèi)部啟動(dòng)子混合物(hybrid))或者一種Plac-Plac串連的啟動(dòng)子。使用啟動(dòng)子調(diào)控蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄其中這種啟動(dòng)子是分離的(apart)。這里使用了一種調(diào)控的啟動(dòng)子，一種相應(yīng)的啟動(dòng)子調(diào)控蛋白也可以是根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)的一部分。啟動(dòng)子調(diào)控蛋白的例子包括，激活劑蛋白，例如，大腸桿菌新陳代謝激活劑蛋白，MaIT蛋白；AraC家族轉(zhuǎn)錄激活劑；抑制蛋白，例如，大腸桿菌LacI蛋白；和雙-基團(tuán)(dual-faction)調(diào)控蛋白，例如，大腸桿菌NagC蛋白。許多調(diào)控的-啟動(dòng)子/啟動(dòng)子-調(diào)控-蛋白對(duì)是本領(lǐng)域所公知的。啟動(dòng)子調(diào)控蛋白與一種效應(yīng)劑化合物相互作用，也就是一種化合物其可逆地或者不可逆地與調(diào)控蛋白相結(jié)合，從而使這種蛋白或者釋放或者結(jié)合至少一種基因的DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，其中這種基因是在啟動(dòng)子的調(diào)控下的，因此允許或者阻止在啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄酶的作用。效應(yīng)劑化合物可以分為誘導(dǎo)劑或者共抑制物，并且這些化合物包括天然的效應(yīng)劑化合物和義務(wù)誘導(dǎo)物化合物。許多調(diào)控的-啟動(dòng)子/啟動(dòng)子-調(diào)控-蛋白/效應(yīng)劑化合物三聚體是本領(lǐng)域所公知的。雖然效應(yīng)劑化合物可以在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵過(guò)程中使用，特定實(shí)施方案中，其中使用了一種調(diào)控的啟動(dòng)子，在宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到所需量或密度的生物體后，適當(dāng)?shù)男?yīng)劑化合物被添加到培養(yǎng)基中從而直接地或者非直接地產(chǎn)生了所需的目標(biāo)基因的表達(dá)。通過(guò)實(shí)施例的方法，其中使用lac家族啟動(dòng)子，lacI基因，或其衍生物例如lacIQ或lacIQI基因，也可以被提供到系統(tǒng)中。這種lacI基因，其是(通常地)一種組成型表達(dá)的基因，編碼Lac抑制蛋白(LacI蛋白)其連接到這些啟動(dòng)子的lac操縱基因。因此，使用的lac家族啟動(dòng)子，這種lacI基因也可以在表達(dá)系統(tǒng)中包括和表達(dá)。在使用lac啟動(dòng)子家族成員的情況下，例如，tac啟動(dòng)子，效應(yīng)劑化合物是一種誘導(dǎo)物，優(yōu)選地一種義務(wù)誘導(dǎo)物例如IPTG(異丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷，也稱為“異丙基硫代半乳糖苷”)。特定實(shí)施方案中，一本發(fā)明種所使用的lac或tac家族啟動(dòng)子，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PlacUV5，lpp-PlacUV5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。其它序列表達(dá)構(gòu)建體可以包括其它的調(diào)控序列，包括lacO序列和衍生物，如上所述。這種序列包括，但是不限于，例如，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列，翻譯增強(qiáng)子序列，其它的啟動(dòng)子，激活劑，翻譯啟示和終止信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止子，順?lè)醋诱{(diào)控子，多順?lè)醋诱{(diào)控子，tag序列，例如核苷序列“tags”和“tag”肽編碼序列，其促進(jìn)了表達(dá)多肽的確認(rèn)，分離，純化，或者分離，包括His-tag，F(xiàn)lag-tag，T7-tag，S-tag，HSV-tag，B-tag，Strep-tag，多精氨酸，多半胱氨酸，多苯丙氨酸，多天冬氨酸，(Ala-Trp-Trp-Pro)n，硫氧還蛋白，β-牛乳糖，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，環(huán)麥芽糊精糖苷轉(zhuǎn)移酶，CTPCMP-3-脫氧-D-manno-octulosonatecytidyltransferase，trpE或trpLE，抗生物素蛋白，鏈霉親和素，T7基因10，T4gp55，葡萄球菌蛋白A，鏈球菌蛋白G，GST，DHFR，CBP，MBP，半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域GFP，KSI，c-myc，ompT，ompA，pelB，NusA，泛素(ubiquitin)，和hemosylinA。最小，本發(fā)明所述的蛋白編碼基因可以包括，除了蛋白編碼序列，操作地連接到其上的下列的調(diào)控序列啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合蛋白(RBS)，轉(zhuǎn)錄終止子，翻譯啟示和終止信號(hào)。使用的RBSs可以從本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)中作為宿主細(xì)胞使用的種中獲得，優(yōu)選來(lái)自于所選的宿主細(xì)胞。許多特定的和大量相同的RBSs是已知的，例如，那些描述在或者參考于D.Frishman等人，Startsofbacterialgenesestimatingthereliabilityofcomputerpredictions，Gene234(2)257-65(8Jul1999)；和B.E.Suzek等人，Aprobabilisticmethodforidentifyingstartcodonsinbacterialgenomes，Bioinformatics17(12)1123-30(Dec2001)。另外，或者天然的或者合成的RBSs也可以使用，例如，那些在EP0207459所描述的(合成的RBSs)；O.Ikehataetal.，PrimarystructureofnitrilehydratasededucedfromthenucleotidesequenceofaRhodococcusspeciesanditsexpressioninEscherichiacoli，Eur.J.Biochem.181(3)563-70(1989)(AAGGAAG的天然的RBS序列)。本發(fā)明中所使用的方法，載體，和翻譯和轉(zhuǎn)錄序列，和其它的序列的進(jìn)一步的例子被描述在，例如，美國(guó)專利Gilroy的No.5,055,294和Gilroy等人的美國(guó)專利No.5,128,130；Rammler等人的美國(guó)專利No.5,281,532；Barnes等人的美國(guó)專利Nos.4,695,455和4,861,595；Gray等人的美國(guó)專利No.4,755,465；和Wilcox的美國(guó)專利No.5,169,760。載體通過(guò)假單胞菌宿主對(duì)編碼本發(fā)明酶的DNA的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體或質(zhì)粒中來(lái)進(jìn)一步提高。典型的增強(qiáng)子是DNA的順式作用序列，通常大小約從10到300bp，在啟動(dòng)子上作用來(lái)提高轉(zhuǎn)錄。一般地，重組表達(dá)載體可以包括復(fù)制起點(diǎn)和允許假單胞菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記的，例如，本發(fā)明的原養(yǎng)型回復(fù)基因，以及來(lái)自于高表達(dá)基因的啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)下游的結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子已經(jīng)在上面描述了。異源結(jié)構(gòu)序列適當(dāng)時(shí)機(jī)與翻譯起始和終止序列進(jìn)行組裝，并且在一個(gè)確定的實(shí)施方案中，引導(dǎo)序列可以引導(dǎo)翻譯蛋白的分泌。隨意地，按照本發(fā)明，這種異源的序列可以編碼一種融合多肽，其包括具有所需特性的N-末端辨認(rèn)肽，例如，這種特性是為了表達(dá)重組產(chǎn)品的穩(wěn)定性和簡(jiǎn)單的純化。熒光假單胞菌在表達(dá)酶中所使用的有用的表達(dá)載體可以通過(guò)插入編碼所需目標(biāo)多肽和適當(dāng)翻譯起始和終止信號(hào)與功能啟動(dòng)子處于可操作閱讀狀態(tài)的結(jié)構(gòu)DNA序列來(lái)構(gòu)建。這種載體將包括一種或多種表型的選擇標(biāo)記和復(fù)制的原點(diǎn)來(lái)保證載體在宿主中的維持和，如果需要，提供擴(kuò)大化。按照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容用于轉(zhuǎn)化的適當(dāng)宿主包括假單胞菌屬中的不同的種，并且特別優(yōu)選是熒光假單胞菌的宿主細(xì)胞菌株。本領(lǐng)域中已知的用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的載體，這些中的任意一個(gè)可以被修飾和用于表達(dá)本發(fā)明所述的基因。這種載體包括，例如，質(zhì)粒，粘粒，和噬菌體表達(dá)載體?？梢员恍揎椨糜诒景l(fā)明的有用的質(zhì)粒載體的實(shí)施例包括，但是不限于，表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS，pDSK519，pKT240，pML122，pPS10，RK2，RK6，pRO1600，和RSF1010。進(jìn)一步的實(shí)施?？梢园╬ALTER-Exl，pALTER-Ex2，pBAD/His，pBAD/Myc-His，pBAD/gIII，pCal-n，pCal-n-EK，pCal-c，pCal-Kc，pcDNA2.1，pDUAL，pET-3a-c，pET9a-d，pET-lla-d，pET-12a-c，pET-14b，pET15b，pET-16b，pET-17b，pET-19b，pET-20b(+)，pET-21a-d(+)，pET-22b(+)，pET-23a-d(+)，pET24a-d(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET28a-c(+)，pET-29a-c(+)，pET-30a-c(+)，pET31b(+)，pET-32a-c(+)，pET-33b(+)，pET-34b(+)，pET35b(+)，pET-36b(+)，pET-37b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a-c(+)，pET-42a-c(+)，pET-43a-c(+)，pETBlue-1，pETBlue-2，pETBlue-3，pGEMEX-1，pGEMEX-2，pGEXlλT，pGEX-2T，pGEX-2TK，pGEX-3X，pGEX-4T，pGEX-5X，pGEX-6P，pHAT10/11/12，pHAT20，pHAT-GFPuv，pKK223-3，pLEX，pMAL-c2X，pMAL-c2E，pMAL-c2g，pMAL-p2X，pMAL-p2E，pMAL-p2G，pProEXHT，pPROLar.A，pPROTet.E，pQE-9，pQE-16，pQE-30/31/32，pQE-40，pQE-50，pQE-70，pQE-80/81/82L，pQE-100，pRSET，和pSE280，pSE380，pSE420，pThioHis，pTrc99A，pTrcHis，pTrcHis2，pTriEx-1，pTriEx-2，pTrxFus。這種有用的載體的其它實(shí)施例包括那些被描述于，例如，N.Hayase，inAppl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42(Sep1994)；A.A.Lushnikovetal.，inBasicLifeSci.30657-62(1985)；S.Graupner&W.Wackernagel，inBiomolec.Eng.17(1)11-16.(Oct2000)；H.P.Schweizer，inCurr.Opin.Biotech.12(5)439-45(Oct2001)；M.Bagdasarian&K.N.Timmis，inCurr.TopicsMicrobiol.Immunol.9647-67(1982)；T.Ishiietal.，inFEMSMicrobiol.Lett.116(3)307-13(Mar1，1994)；I.N.Olekhnovich&Y.K.Fomichev，inGene140(1)63-65(Mar11，1994)；M.Tsuda&T.Nakazawa，inGene136(1-2)257-62(Dec22，1993)；C.Nietoetal.，inGene87(1)145-49(Mar1，1990)；J.D.Jones&N.Gutterson，inGene61(3)299-306(1987)；M.Bagdasarianetal.，inGene16(1-3)237-47(Dec1981)；H.P.Schweizeretal.，inGenet.Eng.(NY)2369-81(2001)；P.Mukhopadhyayetal.，inJ.Bact.172(1)477-80(Jan1990)；D.O.Woodetal.，inJ.Bact.145(3)1448-51(Mar1981)；和R.Holtwicketal.，inMicrobiology147(Pt2)337-44(Feb2001)。進(jìn)一步的實(shí)施例，其可以用于假單胞菌宿主細(xì)胞的表達(dá)載體包括那些列于表16中的衍生自所指出的復(fù)制子。表16.有用表達(dá)載體的一些實(shí)例表達(dá)質(zhì)粒，RSF1010，被描述于，例如，由F.Heffronetal.，inProc.Nat′lAcad.Sci.USA72(9)3623-27(Sep1975)；和由K.Nagahari&K.Sakaguchi，inJ.Bact.133(3)1527-29(Mar1978)。質(zhì)粒RSF1010及其衍生物是本發(fā)明中特別有用的載體。在本領(lǐng)域中是公知的有用的RSF1010的衍生物的實(shí)例，包括，例如，pKT212，pKT214，pKT231和相關(guān)的質(zhì)粒，以及pMYC1050和相關(guān)的質(zhì)粒(參考，例如，Thompson等人的美國(guó)專利Nos.5,527,883和5,840,554)，比如，例如，pMYC1803。質(zhì)粒pMYC1803是從RSF1010-基礎(chǔ)的質(zhì)粒pTJS260得到的(參考Wilcox的美國(guó)專利5,169,760)，其攜帶了一種調(diào)控的四環(huán)素抗性標(biāo)記和來(lái)自于RSF1010質(zhì)粒的復(fù)制和啟動(dòng)位點(diǎn)(loci)。其它的代表性的有用的載體包括那些在Puhler等人的美國(guó)專利4,680,264中所描述的。一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)質(zhì)粒被用作表達(dá)載體。另一個(gè)實(shí)施方案中，RSF1010或它的衍生物被用作表達(dá)載體。另一個(gè)實(shí)施方案中，pMYC1050或者它的衍生物，或者pMYC1803或其衍生物，被用作表達(dá)載體。VII.在一種假單胞菌宿主細(xì)胞中重組多肽的表達(dá)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了在改進(jìn)的蛋白生產(chǎn)中使用的重組多肽的表達(dá)方法(process)。一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法提供了核酸構(gòu)建體的表達(dá)其包括的核酸編碼a)重組多肽，和b)對(duì)于至少一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌中的原養(yǎng)型-回復(fù)酶?？商鎿Q實(shí)施方案中，這種假單胞菌對(duì)于多于一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌是熒光假單胞菌細(xì)胞。特定實(shí)施方案中，重組多肽被表達(dá)在假單胞菌中其對(duì)于一種代謝物，或者代謝物的組合體是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，選自的組包括含氮堿基化合物和氨基酸。更特定實(shí)施方案中，重組多肽被表達(dá)在對(duì)一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌中，代謝物選自的組包括尿嘧啶，脯氨酸，和胸苷。另一個(gè)實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷體可以分別通過(guò)宿主pyrF，proC，或thyA基因的敲除來(lái)實(shí)現(xiàn)?？商鎿Q實(shí)施方案中，重組多肽被表達(dá)在一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的假單胞菌中其已經(jīng)進(jìn)行了遺傳修飾，即通過(guò)插入一種不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子的部分的天然大腸桿菌lacI基因，lacIQ基因，或lacIQI基因，，到宿主細(xì)胞的染色體中。特定實(shí)施方案中，含有重組多肽的載體表達(dá)在營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞其包含至少兩種lac操縱基因序列或其衍生物。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種重組多肽由Plac家族啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種過(guò)程包括使用假單胞菌宿主細(xì)胞，其已經(jīng)被遺傳修飾來(lái)提供至少一個(gè)插入到假單胞菌宿主細(xì)胞的染色體中的LacI編碼基因的一個(gè)拷貝，其中這種lacI編碼基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子的部分。一個(gè)實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因與大腸桿菌天然lacI基因相同。另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因是lacIQ基因。另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼Lac抑制蛋白的基因是lacIQI基因。特定實(shí)施方案中，假單胞菌宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種假單胞菌是進(jìn)一步遺傳修飾來(lái)形成一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法產(chǎn)生重組多肽的水平至少大約3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L或者至少大約10g/L。另一個(gè)實(shí)施方案中，重組多肽的表達(dá)水平在3g/L到100g/L之間。這種方法通常包括a)提供一種假單胞菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選一種熒光假單胞菌，如在本發(fā)明中所描述的，b)利用至少一個(gè)核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這種宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體包含i)所需要的目標(biāo)重組多肽，并且，在使用一種營(yíng)養(yǎng)缺陷的宿主的情況下，ii)編碼原養(yǎng)型能力的酶的基因其，當(dāng)表達(dá)的時(shí)候，克服了宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷。c)在一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其提供了一種有效的選擇壓力用于維持宿主細(xì)胞中的這種含有重組多肽的核酸表達(dá)載體；和d)表達(dá)所需要的目標(biāo)重組多肽。這種方法可以進(jìn)一步包括使用至少一個(gè)核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體進(jìn)一步包括iii)Plac家族啟動(dòng)子，和隨意地iv)多于一種lac操縱基因序列。一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種lac操縱基因序列可以是一種lacOid序列。優(yōu)選地，表達(dá)系統(tǒng)可以以多肽的總產(chǎn)量表達(dá)目標(biāo)多肽為至少1g/L到至少80g/L。在特定實(shí)施方案中，重組多肽的表達(dá)水平至少為3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，12g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，60g/L，70g/L，或至少80g/L。特定實(shí)施方案中，lac或者tac家族啟動(dòng)子使用在本發(fā)明中，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PIacUV5，lpp-PlacUV5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種重組多肽可以被表達(dá)在假單胞菌中，其對(duì)一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，其中這種營(yíng)養(yǎng)缺陷作為一種選擇標(biāo)記來(lái)維持核酸表達(dá)載體，該核酸表達(dá)載體編碼所需要的多肽和原養(yǎng)型能力酶?？蛇x擇地，多于一種重組多肽可以被表達(dá)在假單胞菌細(xì)胞中，其對(duì)于一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，其中這種編碼重組多肽的核酸可以包含在相同的載體上，或者可以選擇地，在多種載體上。另一個(gè)實(shí)施方案中，多于一種的編碼不同目標(biāo)多肽的表達(dá)載體可以包含在假單胞菌宿主細(xì)胞中，其對(duì)至少一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，其中一種表達(dá)載體含有編碼原養(yǎng)型能力酶以及所需要的第一目標(biāo)多肽的核酸，以及第二表達(dá)載體，其包含編碼一種可選的、非-營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記和所需要的第二多肽的核酸。另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種重組多肽可以被表達(dá)在一種假單胞菌細(xì)胞中，其對(duì)于多于一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，其中這種多營(yíng)養(yǎng)缺陷作為選擇標(biāo)記用來(lái)維持核酸表達(dá)載體。例如，一種表達(dá)載體可以被使用，其中提供了第一和第二原養(yǎng)型能力選擇標(biāo)記基因。如果兩種標(biāo)記基因位于相同的DNA構(gòu)建體上，這種含有構(gòu)建體的宿主細(xì)胞可以維持在任意一種或者兩種條件下，其中宿主細(xì)胞的存活需要選擇標(biāo)記基因的存在。當(dāng)只有一種標(biāo)記基因依賴的存活條件存在時(shí)候，相關(guān)的標(biāo)記基因必須是被表達(dá)的，其它的標(biāo)記基因隨后可以是活性的或者非活性的，雖然對(duì)于細(xì)胞仍然是營(yíng)養(yǎng)缺陷的所有所需營(yíng)養(yǎng)物依然通過(guò)培養(yǎng)基提供。這允許編碼所需的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和/或所需要的轉(zhuǎn)基因活性的相同的目標(biāo)基因，或者共價(jià)連接到目標(biāo)基因的相同的組，來(lái)連續(xù)地維持在宿主細(xì)胞中，當(dāng)這種宿主細(xì)胞在不同的條件下轉(zhuǎn)換的時(shí)候。如果兩個(gè)選擇標(biāo)記基因的任意一個(gè)位于不同DNA構(gòu)建體上的時(shí)候，隨后，為了在宿主細(xì)胞中維持兩種DNA構(gòu)建體，提供依賴兩種標(biāo)記-基因的存活條件，以及兩種相關(guān)標(biāo)記基因必須被表達(dá)。這允許多于一種非-共價(jià)結(jié)合的標(biāo)記基因或者目標(biāo)基因組來(lái)分別維持在宿主細(xì)胞中。每一個(gè)所選的選擇標(biāo)記基因獨(dú)立的編碼序列可以操作性地連接到一種組成的或者一種調(diào)控的啟動(dòng)子上。這種多-目標(biāo)-基因系統(tǒng)的例子雙-目標(biāo)-基因包括，但是不限于(1)一個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)品與其它的目標(biāo)基因自身相互作用的系統(tǒng)；(2)一個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)品與其它目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)品相互作用的系統(tǒng)，例如，一種蛋白和它的結(jié)合蛋白或者αn-和βn-蛋白的α-和β-多肽；(3)兩個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)品都與第三化合物作用的系統(tǒng)，例如，第三化合物存在于宿主細(xì)胞中；(4)都參與到普通的生物催化途徑中的兩種基因的表達(dá)產(chǎn)品的系統(tǒng)；和(5)獨(dú)立地發(fā)揮作用的兩種基因的兩種表達(dá)產(chǎn)品的系統(tǒng)，例如，一種雙-克隆抗體表達(dá)系統(tǒng)。在上面列出的類型(1)中雙-目標(biāo)-基因系統(tǒng)的一個(gè)例子中，第一目標(biāo)基因可以編碼所需的目標(biāo)蛋白，其中這種第一基因在調(diào)控的啟動(dòng)子的調(diào)控下；第二目標(biāo)基因隨后可以編碼蛋白參與第一目標(biāo)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控中，例如，第二目標(biāo)基因可以編碼第一目標(biāo)基因的啟動(dòng)子激活劑或抑制蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，其中第二基因編碼第一基因的啟動(dòng)子調(diào)控蛋白，這種第二基因的編碼序列可以在組成型的啟動(dòng)子的調(diào)控下。一個(gè)實(shí)施方案中，第二基因可以是分離的DNA構(gòu)建體的一部分，其在細(xì)胞中維持作為一種高拷貝數(shù)構(gòu)建體，具有的拷貝數(shù)至少10，20，30，40，50，或多于50個(gè)拷貝數(shù)被維持在宿主細(xì)胞中。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在假單胞菌中重組多肽的生產(chǎn)中提供了在一個(gè)表達(dá)載體上多于一種的lacO序列的使用，特別是，在熒光假單胞菌中。另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組多肽的方法，其包括轉(zhuǎn)化一種細(xì)菌，該細(xì)胞是假單胞菌和緊密相關(guān)的細(xì)菌，其具有至少一種染色體插入的編碼lacI轉(zhuǎn)基因、或者例如lacIQ或lacIQI的衍生物的Lac抑制蛋白的核酸拷貝，其中轉(zhuǎn)基因不同于整體的一部分或者截?cái)嗟暮蠵lacI-lacI-lacZYA構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)基因，其中具有編碼至少一種目標(biāo)重組多肽的核酸構(gòu)建體。這種編碼至少一種目標(biāo)重組多肽的核酸可以操作性地連接到Plac家族啟動(dòng)子上，其中存在于宿主細(xì)胞中的所有的Plac家族啟動(dòng)子被Lac抑制蛋白所調(diào)控，其中該蛋白被插入到染色體中的lacI轉(zhuǎn)基因所單獨(dú)表達(dá)。隨意地，這種表達(dá)系統(tǒng)可以以總產(chǎn)量為至少3g/L到至少10g/L表達(dá)目標(biāo)多肽。優(yōu)選地，表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)目標(biāo)多肽以總產(chǎn)量為至少3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，或至少10g/L。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組多肽的方法，使用營(yíng)養(yǎng)缺陷假單胞菌或者相關(guān)的已經(jīng)進(jìn)一步遺傳修飾的細(xì)菌，以提供至少編碼插入到細(xì)胞染色體中的lacI基因的拷貝，該基因不同于PlacI-laeI-lacZYA操縱子的一部分。特定實(shí)施方案中，重組的多肽在含有l(wèi)acI轉(zhuǎn)基因插入的營(yíng)養(yǎng)缺陷的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。另一特定實(shí)施方案中，重組的多肽在含有l(wèi)acIQ轉(zhuǎn)基因插入的營(yíng)養(yǎng)缺陷的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步的另一特定實(shí)施方案中，重組的多肽在含有l(wèi)acIQI轉(zhuǎn)基因插入的營(yíng)養(yǎng)缺陷的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。熒光假單胞菌宿主對(duì)于一種細(xì)胞存活的生物化學(xué)需求是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。特定實(shí)施方案中，熒光假單胞菌細(xì)胞對(duì)于含氮堿基是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。特定實(shí)施方案中，熒光假單胞菌細(xì)胞對(duì)于一種選自胸苷或尿嘧啶的含氮堿基是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷體是被遺傳修飾所誘導(dǎo)的，這種pyrF或thyA基因的遺傳修飾提供有關(guān)的非功能性編碼產(chǎn)品。可替換實(shí)施方案中，熒光假單胞菌細(xì)胞對(duì)一種氨基酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。特定實(shí)施方案中，這種熒光假單胞菌對(duì)于氨基酸脯氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。特定實(shí)施方案中，熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷是被一種proC基因的遺傳修飾來(lái)誘導(dǎo)的，其中這種遺傳修飾提供了相關(guān)的非功能性編碼產(chǎn)品。轉(zhuǎn)化載體對(duì)假單胞菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以利用本領(lǐng)域中已知的任意轉(zhuǎn)化方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且細(xì)菌宿主細(xì)胞可以作為完整的細(xì)胞或者作為原生質(zhì)體(也就是包括細(xì)胞質(zhì))被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法的例子包括穿孔方法，例如，電穿孔方法，原生質(zhì)體融合，細(xì)菌結(jié)合，和二價(jià)陽(yáng)離子處理，例如，氯化鈣處理或者CaCl/Mg2+處理，或者其它的本領(lǐng)域中已知的方法。參考，例如，Morrison，J.Bact.，132349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，MethodsinEnzymology，101347-362(Wuetal.，eds，1983)；Sambrooketal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual(2nded.1989)；Kriegler，GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal.，eds.，1994))。選擇優(yōu)選地，選擇那些相應(yīng)于下面的轉(zhuǎn)化的沒(méi)有成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且在整個(gè)發(fā)酵中連續(xù)地進(jìn)行。這種選擇標(biāo)記可以是營(yíng)養(yǎng)缺陷的選擇標(biāo)記或者一種傳統(tǒng)的抗生素選擇標(biāo)記。當(dāng)細(xì)胞對(duì)于多種營(yíng)養(yǎng)化合物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的時(shí)候，這種營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞可以在添加了所有的營(yíng)養(yǎng)化合物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，直到用原養(yǎng)型回復(fù)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。其中宿主細(xì)胞是或者已經(jīng)被處理成對(duì)多個(gè)生物合成活性是缺陷的，原養(yǎng)型-回復(fù)標(biāo)記系統(tǒng)可以被選擇來(lái)回復(fù)一種或者多種或者所有的生物合成活性，剩余的仍然缺少的營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)在培養(yǎng)基中連續(xù)添加。在選擇標(biāo)記系統(tǒng)中，其中多于一種生物合成活性，和/或多于一種原養(yǎng)型被回復(fù)，大量的選擇標(biāo)記基因可以與一種載體一起被表達(dá)或者可以在不同的載體上分別地共表達(dá)。即使一個(gè)單一的代謝物是選擇標(biāo)記系統(tǒng)的目標(biāo)，多重生物合成活性可以包含在選擇標(biāo)記系統(tǒng)。例如，來(lái)自于相同的合成代謝途徑兩個(gè)或者多個(gè)基因編碼活性可以在一種載體上一起進(jìn)行表達(dá)，或者可以在不同的載體上分別地共表達(dá)，從而回復(fù)與化合物的生物合成相關(guān)的原養(yǎng)型，該化合物是途徑中的產(chǎn)品。其中選擇標(biāo)記是一種抗生素抗性基因，相關(guān)的抗生素可以添加到培養(yǎng)基中來(lái)選擇沒(méi)有轉(zhuǎn)化的和回復(fù)的細(xì)胞，如本領(lǐng)域中所公知的。發(fā)酵如這里所需要的，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”包括兩種實(shí)施方案，其中使用了精確的(literal)的發(fā)酵實(shí)施方案以及其中使用了其它的、非發(fā)酵培養(yǎng)模式的實(shí)施方案。發(fā)酵可以以任意的規(guī)模水平進(jìn)行。一個(gè)實(shí)施方案中，這種發(fā)酵培養(yǎng)基可以選自豐富培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基(minimalmedia)，礦物鹽培養(yǎng)基；豐富培養(yǎng)基可以被使用，但是優(yōu)選不使用。另一個(gè)實(shí)施方案中，或者選擇基本培養(yǎng)基或者選擇一種礦物鹽培養(yǎng)基。另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇了一種基本培養(yǎng)基。另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇一種礦物鹽培養(yǎng)基。礦物鹽培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的。在利用編碼原養(yǎng)型能力酶的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化這種宿主細(xì)胞之前，宿主細(xì)胞可以維持在含有補(bǔ)償?shù)拇x物或者其類似物培養(yǎng)基上，，，該代謝物或者其類似物補(bǔ)償了營(yíng)養(yǎng)缺陷。在轉(zhuǎn)化之后，這種宿主細(xì)胞可以在缺乏這種宿主細(xì)胞所缺乏的補(bǔ)償代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在這種方法中，不含有選擇標(biāo)記回復(fù)原養(yǎng)型的宿主細(xì)胞被選擇。同樣的，在一種缺乏選擇所需要的相關(guān)抗生素的培養(yǎng)基上，在轉(zhuǎn)化之前，表達(dá)來(lái)自于含有抗生素抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體的表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞可以被保持。在轉(zhuǎn)化之后和發(fā)酵的過(guò)程中，抗生素可以被添加到培養(yǎng)基中，以本領(lǐng)域中所公知的濃度，來(lái)選擇非轉(zhuǎn)化的和回復(fù)的細(xì)胞。礦物鹽培養(yǎng)基包括礦物鹽和碳源比如，例如，葡萄糖，蔗糖，或甘油。礦物鹽培養(yǎng)基的例子包括，例如，M9培養(yǎng)基，假單胞菌培養(yǎng)基(ATCC179)，Davis和Mingioli培養(yǎng)基(參考，BDDavis&ESMingioli，inJ.Bact.6017-28(1950))。用于準(zhǔn)備礦物鹽培養(yǎng)基的礦物鹽包括那些選自，例如，磷酸鉀，硫酸銨或氯化銨，硫酸鎂或氯化鎂，以及微量元素例如氯化鈣，硼酸鹽，和鐵、銅、錳、和鋅的硫酸鹽。沒(méi)有有機(jī)氮源，例如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸、或者酵母提取物，被包括在這種礦物鹽培養(yǎng)基中。作為替代，一種無(wú)機(jī)的氮源被使用并且這可以被選擇自，例如，銨鹽，氨水，和氨氣。一種特定的礦物鹽培養(yǎng)基將包含葡萄糖作為碳源。與礦物鹽培養(yǎng)基相比，基本培養(yǎng)基也可以包含礦物鹽和碳源，但是可以被補(bǔ)償利用，例如，低水平的氨基酸，維生素，蛋白胨，或者其它的成分，雖然這些以非常低的水平添加。一個(gè)實(shí)施方案中，使用下面表16中給出的組分來(lái)制備培養(yǎng)基。這種組分可以按照下面的順序添加首先(NH4)HPO4，KH2PO4和檸檬酸溶解到大約30升的蒸餾水，隨后添加一種微量元素的溶液，進(jìn)而添加防沫劑，例如UcolubN115。隨后，在熱滅菌后(例如在大約120℃)，添加滅菌的葡萄糖MgSO4和硫胺-HCL?？梢岳冒彼畬H調(diào)控在大約6.8。滅菌的蒸餾水隨后被添加，以從最初的體積調(diào)整到371減去甘油的體積(123mL)?；瘜W(xué)品可以是來(lái)自于不同供應(yīng)商的商業(yè)可獲得的產(chǎn)品，例如Merck。這種培養(yǎng)基可以允許假單胞菌種和相關(guān)細(xì)菌的高細(xì)胞密度培養(yǎng)(HCDC)。這種HCDC可以起始于批次過(guò)程，其跟隨著兩階段(two-phase)發(fā)酵批次培養(yǎng)。在批次部分中非限定性生長(zhǎng)后，生長(zhǎng)可以被調(diào)控成一種縮小的特定生長(zhǎng)速率經(jīng)過(guò)一個(gè)3個(gè)雙倍的時(shí)間段其中這種生物量濃度可以增加幾倍。這種培養(yǎng)步驟的進(jìn)一步的詳細(xì)資料描述于Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Deckwer，W.D.(1991)″HighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate″JBiotechnol20(1)17-27。按照本發(fā)明這種表達(dá)系統(tǒng)可以在任意的發(fā)酵模式中進(jìn)行培養(yǎng)。例如，批次，發(fā)酵-批次，半連續(xù)，和連續(xù)發(fā)酵模式可以在這里使用。按照本發(fā)明這種表達(dá)系統(tǒng)可以用于在發(fā)酵的任意水平(也就是，體積)基因表達(dá)。因此，例如，微升-水平，厘升水平，和1/10公升水平發(fā)酵體積可以被使用；和1升水平和更大的發(fā)酵體積可以被使用。一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵體積可以是或者大約1升。另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵體積可以是或者大約5升，10升，15升，20升，25升，50升，75升，100升，200升，500升，1000升，2000升，10,000升，50,000升。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)，和/或發(fā)酵可以在允許宿主細(xì)胞存活的溫度范圍進(jìn)行，優(yōu)選一個(gè)在大約4℃到55℃大約的溫度范圍內(nèi)，包含的。細(xì)胞密度與大腸桿菌或其它的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比在表達(dá)重組蛋白中所需要的熒光假單胞菌的一個(gè)額外的優(yōu)勢(shì)包括熒光假單胞菌可以高細(xì)胞密度生長(zhǎng)的能力。為了這個(gè)目的，本發(fā)明所述的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可以提供一種大約20g/L或更高的細(xì)胞密度。本發(fā)明所述的這種熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可以同樣提供至少大約70g/L的細(xì)胞密度，被描述成每升的生物量，生物量作為干細(xì)胞重量進(jìn)行測(cè)量。一個(gè)實(shí)施方案中，這種細(xì)胞密度應(yīng)該為至少20g/L。另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞密度可以為至少25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或者至少150g/L。另一個(gè)實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)情況下細(xì)胞密度在20g/L到150g/L之間；20g/L到120g/L之間，20g/L到80g/L之間；25g/L到80g/L之間；30g/L到80g/L之間；35g/L到80g/L之間；40g/L到80g/L之間；45g/L到80g/L之間；50g/L到80g/L之間；50g/L到75g/L之間；50g/L到70g/L之間；40g/L到80g/L之間。重組蛋白的表達(dá)水平本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)轉(zhuǎn)基因多肽以一種在5％到80％細(xì)胞蛋白(％tcp)的水平。一個(gè)實(shí)施方案中，這種表達(dá)水平將是或者大約5％，8％，10％，12％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，或80％tcp。分離和純化按照本發(fā)明所述生產(chǎn)的重組蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)分離和純化從而獲得基本的純度，包括，但是不限于，硫酸銨或者酒精沉淀，酸萃取，陰離子或者陽(yáng)離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水的相互作用色譜，親和力色譜，鎳色譜，羥基磷灰石色譜，反相色譜，血凝素色譜，制備電泳，清潔劑溶解，選擇性沉淀具有這種物質(zhì)作為柱色譜，免疫純化方法，和其他的方法。例如，具有確定的分子結(jié)合能力的蛋白可以相反地融合到一種配合體。具有適當(dāng)?shù)呐浜象w，這種蛋白選擇性地吸附到純化柱并且隨后以一種相對(duì)純度的形式從柱上分離。這種融合蛋白隨后被酶活力除去。另外，蛋白可以使用免疫親和柱或者Ni-NTA柱進(jìn)行純化。通常的技術(shù)進(jìn)一步描述在，例如，R.Scopes，ProteinPurificationPrinciplesandPractice，Springer-VerlagN.Y.(1982)；Deutscher，GuidetoProteinPurification，AcademicPress(1990)；美國(guó)專利No.4,511,503；S.Roe，ProteinPurificationTechniquesAPracticalApproach(PracticalApproachSeries)，OxfordPress(2001)；D.Bollag，etal.，ProteinMethods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AKPatraetal.，ProteinExprPurif，18(2)p/182-92(2000)；和R.Mukhija，etal.，Gene165(2)p.303-6(1995)。也可以參考，例如，Ausubel，etal.(1987andperiodicsupplements)；Deutscher(1990)″GuidetoProteinPurification，″MethodsinEnzymologyvol.182，andothervolumesinthisseries；Coligan，etal.(1996andperiodicSupplements)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene，NY；和廠商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)品的使用，例如，Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。結(jié)合可以將適當(dāng)?shù)钠芜M(jìn)行融合的重組技術(shù)，例如，對(duì)于FLAG序列或者等同的其可以通過(guò)一種蛋白酶-刪除序列進(jìn)行融合的。也可以參考，例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie1269-70；Hochuli(1990)″PurificationofRecombinantProteinswithMetalChelateAbsorbent″inSetlow(ed.)GeneticEngineering，PrincipleandMethods1287-98，PlenumPress，NY；和Crowe，etal.(1992)QIAexpressTheHighLevelExpression&ProteinPurificationSystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。表達(dá)蛋白的監(jiān)測(cè)通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法獲得包括，例如，放射性免疫測(cè)定，Western印跡技術(shù)或免疫沉淀技術(shù)。這種重組生產(chǎn)的和表達(dá)的酶可以利用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，例如，高效液相色譜(HPLC)可以被應(yīng)用到最后的純化步驟，如果需要。本申請(qǐng)中表達(dá)的幾種蛋白可以形成不溶解聚集體(“包涵體”)。幾種方案可以用于從包涵體中純化蛋白。例如，包涵體的純化典型地包括萃取，分離和/或純化通過(guò)破碎宿主細(xì)胞得到的包涵體，例如，通過(guò)在一種50mMTRIS/HCLpH7.5，50mMNaCl，5mMMgCl2，1mMDTT，0.1mMATP，和1mMPMSF的緩沖液中孵化。細(xì)胞懸浮物使用FrenchPress的2-3步的典型的細(xì)胞溶解。細(xì)胞懸浮物也可以利用Polytron(BrinknanInstruments)或者低溫超聲波進(jìn)行均質(zhì)化。可選擇的溶解細(xì)菌方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的(參考，例如，Sambrook等人，supra；Ausubel等人，supra)。如果需要，包涵體可以被溶解，溶解的細(xì)胞懸浮液主要被離心后去除不溶解的物質(zhì)。形成包涵體的蛋白質(zhì)可以利用兼容的緩沖液稀釋或者透析的方式復(fù)性。適當(dāng)?shù)娜軇┌?，但是不限于尿?從大約4M到大約8M)，甲酰胺(至少體積比為大約80％)，鹽酸胍(大約4M到大約8M)。盡管鹽酸胍和相似的試劑是變性劑，但是這種變性不是不可逆轉(zhuǎn)的并且除去(例如通過(guò)透析)或者稀釋這種變性劑可能發(fā)生復(fù)性，允許免疫學(xué)的和/或者生物學(xué)性能蛋白質(zhì)的重新形成。其它適合的緩沖液對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的?？蛇x擇地，從宿主外周胞質(zhì)中純化重組蛋白質(zhì)或者多肽是可能的。宿主細(xì)胞溶解之后，當(dāng)重組蛋白質(zhì)被輸出到宿主細(xì)胞的外周胞質(zhì)，菌體的外周胞質(zhì)片段可以通過(guò)低溫滲透震動(dòng)加上其它已知在該領(lǐng)域的技術(shù)方法分離出來(lái)。例如，為了從外周胞質(zhì)中分離重組蛋白質(zhì)，細(xì)菌細(xì)胞可以被離心成為小塊。小塊可以懸浮于一種包含20％蔗糖的緩沖液中。為了溶解細(xì)胞，細(xì)菌被離心并且小塊被懸浮在冰凍的5mMMgSO4，在冰浴中保留大約10min。細(xì)胞懸浮物離心，上清夜移出并且保存。重組蛋白質(zhì)存在于上清夜中可以從宿主蛋白質(zhì)中通過(guò)在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)分出來(lái)。最初的鹽分餾法可以從許多多余的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(或者從細(xì)胞培養(yǎng)基中衍生出來(lái)的蛋白質(zhì))分離出來(lái)感興趣的重組蛋白質(zhì)。這樣的例子之一是硫酸銨。硫酸銨通過(guò)有效的去除蛋白質(zhì)混合物中含水量形成蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)然后在它們?nèi)芙舛认鲁恋?。蛋白質(zhì)越是疏水，在較低的硫酸銨濃度下越容易形成沉淀。一個(gè)典型的方法就是向蛋白質(zhì)溶液中加入飽和硫酸銨以至于使硫酸銨的最終濃度達(dá)到20-30％。這個(gè)濃度使得最疏水的蛋白質(zhì)沉淀。這種沉淀被去除(除非感興趣的蛋白質(zhì)是疏水的)并且加入硫酸銨到上清液達(dá)到一個(gè)使感興趣蛋白質(zhì)沉淀的濃度。沉淀物然后溶解在緩沖液，如果需要也可以通過(guò)透析或者過(guò)濾去除多余的鹽。其它依賴于蛋白質(zhì)溶解度的方法，如冷乙醇沉淀，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的并且可以用于分餾復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。重組蛋白的分子量可以通過(guò)使用不同孔徑超濾膜(例如，AmiconorMillipore膜)用于分離從比其更大或者更小的蛋白質(zhì)。第一步，蛋白質(zhì)混合物通過(guò)可以將比興趣蛋白質(zhì)的分子量小的低分子量去除的孔徑的膜超濾。超濾后的保留物然后可以通過(guò)膜超濾去除比感興趣蛋白質(zhì)分子量大的分子。重組蛋白質(zhì)會(huì)通過(guò)膜進(jìn)入濾器，濾液可以進(jìn)行色譜分離，如下面所述。重組蛋白質(zhì)也可以依靠它的大小、凈表面電荷、疏水性和配基的親和力同其它蛋白質(zhì)中分離。另外，蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體可以偶聯(lián)成為柱矩陣(matrice)，蛋白質(zhì)得到免疫純化。所有這些方法在該領(lǐng)域內(nèi)是公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的色譜技術(shù)可以在任何規(guī)模中利用并使用許多不同制造商的儀器(例如PharmaciaBiotech)執(zhí)行。復(fù)性與再折疊不溶解的蛋白質(zhì)可以復(fù)性或者再折疊產(chǎn)生二級(jí)或者三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象。蛋白質(zhì)的再折疊步驟可以使用，作為必需(asnecessary)，完成重組產(chǎn)物的構(gòu)象。再折疊和復(fù)性活性可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的促進(jìn)蛋白質(zhì)的分裂/結(jié)合的試劑來(lái)完成。例如，蛋白質(zhì)可以利用二硫蘇糖醇孵育，接著是與氧化型谷胱甘肽二鈉鹽孵育，最后利用包含折疊試劑如尿素的緩沖液孵育。重組蛋白質(zhì)也可以復(fù)性，例如通過(guò)磷酸鹽緩沖液(PBS)或者50mM醋酸鈉pH6緩沖液加入200mMNaCl透析。可選擇地，蛋白質(zhì)可以當(dāng)固定在一個(gè)柱子時(shí)再折疊，例如通過(guò)利用在500mMNaCl中的線性梯度的6M-1M尿素，20％甘油，20mMTris/HClpH7.4，包含蛋白酶抑制劑的NiNTA柱。復(fù)性可以在1.5小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)期執(zhí)行完成。蛋白質(zhì)復(fù)性之后可以通過(guò)加入250mM咪唑(immidazole)洗滌?？梢酝ㄟ^(guò)最后一步在PBS或者50mM醋酸鈉pH6緩沖液加入200mMNaCl中透析去除咪唑。純化后的蛋白可以保存在4℃或者冷凍在-80℃。其他方法包括，例如它們被敘述在MHLee等人，ProteinExpr.Purif.，25(1)p.166-73(2002)，W.K.Cho等人.，J.Biotechnology，77(2-3)p.169-78(2000)，Ausubel，等人(1987和增刊)，Deutscher(1990)《蛋白質(zhì)純化指南》(GuidetoProteinPurification)，″MethodsinEnzymologyvol.182，和該系列的其他期刊，Coligan，等人.(1996和增刊)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene，NY，S.Roe，ProteinPurificationTechniquesAPracticalApproach(PracticalApproachSeries)，OxfordPress(2001)；D.Bollag，等人，ProteinMethods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)。VI.重組多肽本發(fā)明提供在細(xì)菌表達(dá)體系中的蛋白質(zhì)改良產(chǎn)物。重組多肽的例子可以用于本發(fā)明的包括從原核和真核生物體中衍生出來(lái)的多肽。這些生物體包括古細(xì)菌(Archea)，細(xì)菌，真菌的生物體，包括原生生物界，真菌界，植物界和動(dòng)物界的生物體。可以利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的類型包括，非限定性的例子例如酶，它們負(fù)責(zé)催化活細(xì)胞中的上千種的化學(xué)反應(yīng)；角蛋白，彈性蛋白和膠原蛋白，它們是結(jié)構(gòu)，或者支持蛋白的重要類型；血紅蛋白和其它氣體傳輸?shù)鞍踪|(zhì)；卵清蛋白質(zhì)，酪蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)分子；抗體，免疫系統(tǒng)的分子；激素蛋白質(zhì)，用于調(diào)節(jié)新陳代謝；和一些執(zhí)行機(jī)械工作的蛋白質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白質(zhì)和肌漿球蛋白，肌肉收縮蛋白質(zhì)。其它特殊的非限定性的多肽，包括分子例如，血管緊張肽原酶，一種生長(zhǎng)激素，包括人類生長(zhǎng)激素，牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；副甲狀腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1抗胰島素，胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；血小板蛋白質(zhì)；濾泡刺激激素；降血鈣素；黃體激素；胰高血糖素；凝結(jié)因子如VIIIC因子，IX因子，組織因子和vonWillebrands因子；抗凝結(jié)因子如蛋白質(zhì)C，心房利鈉因子(atrialnaturieticfactor)，肺表面活性劑；血纖維蛋白溶酶原激活劑，例如尿激素或者人類尿或者組織形式的血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾肽(bombesin)；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；瘤壞疽因子-α和-β；腦啡肽酶；血清白蛋白例如人血清白蛋白；繆勒式抑制物質(zhì)；松弛肽A-鏈；松弛肽B-鏈；預(yù)先松弛肽(prorelaxin)；鼠促性腺激素結(jié)合蛋白；一種微生物蛋白，例如β-內(nèi)酰胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活性分子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或者生長(zhǎng)因子受體；整聯(lián)蛋白；蛋白質(zhì)A或者D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)因子例如大腦起源神經(jīng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3，-4，-5，or-6(NT-3，NT-4，NT-5，orNT-6)，或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β，心臟營(yíng)養(yǎng)(心臟肥大因子)如心臟營(yíng)養(yǎng)蛋白-1(CT-1)；血小板起源的生長(zhǎng)因子(PDGF)；纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子如TGF-α與TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或者TGF-β5；類胰島素生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IF-ION；des(1-3)-IGF-I(大腦IGF-I)；類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD-3，CD-4，CD-8，和CD-19；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)(osteoinductive)因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和γ；集落刺激素(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白細(xì)胞介素(ILs)，如IL-1至IL-10；anti-HER-2抗體；超氧化歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；腐化加速因子(decayacceleratingfactor)；濾過(guò)性毒菌抗原如AIDS包膜的一部分；運(yùn)輸?shù)鞍?；自?dǎo)引受體；地址素(addressins)；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；和任何以上名單中多肽的片段。根據(jù)本發(fā)明被表達(dá)的重組多肽可以從多聚核糖核酸中表達(dá)，其中目標(biāo)多肽的編碼序列可操作的連接在轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列以形成功能性基因，該基因可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)。編碼序列可以是一個(gè)天然的編碼目標(biāo)多肽序列，如果可以獲得，但是更多優(yōu)選在選擇表達(dá)宿主細(xì)胞使用已經(jīng)被篩選的、改良的或者最優(yōu)化的序列。利用，通過(guò)合成基因反應(yīng)假單胞菌如熒光假單胞菌的密碼子使用偏好。結(jié)果獲得的基因被構(gòu)建到或者被插入一個(gè)或者更多載體，然后轉(zhuǎn)到表達(dá)宿主細(xì)胞。核酸或者多聚核苷酸被提供“可表達(dá)形式”的表述指通過(guò)選擇的細(xì)菌表達(dá)宿主細(xì)胞表達(dá)包含至少一種基因核酸或者多聚核苷酸。分子遺傳學(xué)和遺傳工程技術(shù)所需要的廣泛序列信息是被廣泛大眾化的獲得。接近完成哺乳動(dòng)物的核苷酸序列，和人一樣，基因，cDNA序列，氨基酸序列和基因組可以從GenBank中位于URL的地址所得到。http//www.ncbi.iiih.gov/Entrez.附加信息可以通過(guò)GeneCards得到，它是一個(gè)結(jié)合了有關(guān)基因和它們的產(chǎn)物以及來(lái)自于Weizmann基因組和生物信息科學(xué)院(http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的電子百科全書，核苷酸序列信息可以從EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ebi.ac.uk/emb)或者DNA基因庫(kù)或者日本DDBJ中獲得(http//www.ddbj.nig.ac.ip/)；其它關(guān)于氨基酸序列的網(wǎng)址包括喬治敦蛋白信息資源的網(wǎng)址(http//www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和瑞士-Prot(http//au.expasv.org/sprot/sprot-top.html)。實(shí)施例實(shí)施例1在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞表達(dá)體系中構(gòu)建pyrF選擇標(biāo)記體系除了另外說(shuō)明的所需試劑均從Sigma-Aldrich(St.LouisMO)獲得。LB是在明膠膠囊中含有10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和5g/LNaCl(BIO101)。如果需要，尿嘧啶(BIO101，CarlsbadCA)或者L-脯氨酸加入至最終濃度為250μg/mL，四環(huán)素加至15μg/mL，LB/5-FOA培養(yǎng)皿中包含帶有250mM尿嘧啶和0.5mg/mL5-氟乳清酸核苷酸(5-fluorooroticacid5-fluorooroticacid)(5-FOA)的LB。M9培養(yǎng)基包含6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，1g/LNH4CI，0.5g/LNaCl，10mMMgSO4，1xHoLe微量元素溶液，pH7。加入葡萄糖至最終濃度為1％。1000xHoLe微量元素溶液是2.85g/LH3BO3，1.8g/LMnCl2·4H2O，1.77g/L酒石酸鈉，1.36g/LFeSO4·7H2O，0.04g/LCoCl2·6H2O，0.027g/LCuCl2·2H2O，0.025g/LNa2MoO4·2H2O，0.02g/LZnCl2。所使用的寡核苷酸MB214pyrFl(黑體為NotI位點(diǎn))5′-GCGGCCGCTTTGGCGCTTCGTTTACAGG-3′(SEQIDNO14)MB214pyrR1(黑體為PvuI位點(diǎn)；下劃線黑體為KpnI位點(diǎn))5′-CGATCGGGTACCTGTCGAAGGGCTGGAGACAT-3′(SEQIDNO15)pyrFPstF(黑體為PstI位點(diǎn))5′-AACTGCAGGATCAGTTGCGGAGCCTTGG-3′(SEQIDNO16)pyrFoverlap5′-TGCTCACTCTAAAAATCTGGAATGGGCTCTCAGGC-3′(SEQIDNO17)pyrFXbaR2(黑體為XbaI位點(diǎn))5′-GCTCTAGATGCGTGGCTGGATGAATGAA-3′(SEQIDNO18)pyranaIF5′-GGCGTCGAACAGGTAGCCTT-3′(SEQIDNO19)pyranaIR5′-CTCGCCTCCTGCCACATCAA-3′(SEQIDNO20)M13F(-40)5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′(SEQIDNO21)從熒光假單胞菌中克隆pvrF基因pyrF基因是從熒光假單胞菌中通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增方式克隆的，利用的引物分別是結(jié)合pyrF基因起始密碼子上游連接297bp和終止密碼子的下游212bp的MB214pyrFl和MB214pyrRl。限制性位點(diǎn)包含在5’末端，以促進(jìn)進(jìn)一步的克隆反應(yīng)。pyrF讀碼框(ORF)擴(kuò)增區(qū)域的上游被預(yù)測(cè)能夠包括天然pyrF的上游啟動(dòng)子的足夠長(zhǎng)度。一個(gè)在pyrF讀碼框(ORF)下游大約14～117bp的強(qiáng)大的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其可以是轉(zhuǎn)錄的終止子，也可以包含在下游的側(cè)翼區(qū)域。為了pyrF基因的PCR擴(kuò)增，高保真的PROOFSTARTDNA聚合酶混合在50μL反應(yīng)體系，該體系包含制造商(Qiagen，ValenciaCA)提供的緩沖液，0.3mMdNTPs((Promega，Madison，WI)，1μM的每種MB214pyrFl和MB214pyrRl引物，和0.3μg的來(lái)自熒光假單胞菌MB214基因組DNA。擴(kuò)增條件是95℃5min，94℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后是72℃10min。該反應(yīng)在1％SEAKEMGTG瓊脂糖(來(lái)自于BioWhittakerMolecularApplications，RocklandME)凝膠中分離。從凝膠中切離預(yù)期的1.2kb的帶，并且通過(guò)從Millipore(BedfordMA)的ULTRAFREE-DA(超速)離心凝膠噴霧器(nebulizer)純化；使用MICROBIOSPIN6P-6聚丙烯酰胺旋轉(zhuǎn)柱(Bio-Rad，HerculesCA)在Tris鹽酸緩沖液中除鹽?？寺〉幕虬幋a乳清酸核苷-5’-磷酸鹽脫羧酶單一的讀碼框(ORF)。該基因的身份可以通過(guò)其整個(gè)長(zhǎng)度(232個(gè)殘基中的209)與來(lái)自曾經(jīng)被報(bào)道過(guò)(Strychetal.，1994)的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的pyrF基因，，的高度類似性(P-valueof3.3×10-78)得到進(jìn)一步確認(rèn)為pyrF。熒光假單胞菌菌株已經(jīng)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有其它的pyrF基因的拷貝。測(cè)序由Dow化學(xué)公司完成。pyrF序列參見(jiàn)SEQIDNO1。pyrF(-)熒光假單胞菌的構(gòu)建為了構(gòu)建pyrF(-)熒光假單胞菌，細(xì)胞基因組的pyrF基因通過(guò)刪除介于和包括起始和終止密碼子它們的讀碼框(ORF)而改變。這種刪除是通過(guò)在體外將pyrF區(qū)域的側(cè)翼上游和下游區(qū)域融合到非復(fù)制質(zhì)粒上，而后利用等位基因交換實(shí)現(xiàn)的，即同源重組，在MB101中用刪除的等位基因代替內(nèi)源的pyrF基因。為了構(gòu)建側(cè)翼區(qū)域的融合，利用了“Megaprimer”的方法(Barik1997)，其間欲刪除的上游區(qū)域和下游區(qū)域被隨后利用與所需刪除的序列兩邊的同源的重疊引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所以側(cè)翼區(qū)域可以連接，除去pryF的讀碼框(ORF)。上游區(qū)域可以從MB214基因組DNA利用上面提及的Proofstart聚合酶(Qiagen)，pyrFPstF和pyrF的重疊引物，1分鐘的延伸而擴(kuò)增出來(lái)。在使用連接到玻璃奶(來(lái)自BiolOl，Carlsbad，Calif.，USA的GENECLEANSpin試劑盒)凝膠純化以后，1kb產(chǎn)物可以用做Megaprimer來(lái)進(jìn)行第二次擴(kuò)增。因?yàn)榈诙綌U(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物是非常困難的，利用PCR擴(kuò)增準(zhǔn)備包含基因組pyrF區(qū)域的模板，以便增加模板的數(shù)量。利用HOTSTARTAQDNA聚合酶(來(lái)自于Qiagen，ValenciaCA)，熒光假單胞菌基因組DNA，pyrFPstF和pyrFXbaR2引物。然后利用該模板，Megaprimer和pyrFXbaR2引物，和HOTSTARTAQDNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增該刪除產(chǎn)物，擴(kuò)增條件為95℃15min，94℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后是72℃3min。預(yù)期2kb條帶通過(guò)電泳與其它產(chǎn)物分離，然后按照上面條件凝膠純化，按照廠商的說(shuō)明書克隆到質(zhì)粒pCR2.1Topo(Invitrogen，CarlsbadCA)，形成pDOW1215-7。測(cè)序顯示pDOW1215-7的PCR擴(kuò)增區(qū)域在擴(kuò)增過(guò)程引入了3個(gè)突變。所有3個(gè)改變?cè)趐ryF終止密碼下游的112bp之內(nèi)。測(cè)序該區(qū)域是非常困難，因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程在該區(qū)域內(nèi)停止。通過(guò)對(duì)該區(qū)域編碼的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的M-折疊(GCG)的分析表明存在著一個(gè)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和一系列的尿苷殘基，其為不依賴ρ轉(zhuǎn)錄終止子的特征結(jié)構(gòu)。沒(méi)有突變發(fā)生在讀碼框(ORF)。質(zhì)粒pDOW1215-7用于刪除MB101中的染色體pyrF基因。為了達(dá)到此目的，首先，熒光假單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞根據(jù)Artiguenave等(1997)的方法制得，與0.5μg純化后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化物通過(guò)平鋪到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒不能在熒光假單胞菌中復(fù)制，所以對(duì)卡那霉素有抗性的克隆得自該質(zhì)粒已經(jīng)整合進(jìn)入染色體的細(xì)胞。質(zhì)粒的整合位點(diǎn)可以通過(guò)PCR方法分析，使用HOTSTARTAQ聚合酶，引物pryanalF和M13F(-40)，57℃退火，4分鐘的延伸時(shí)間。十個(gè)分離物中一個(gè)(MB101::pDOW1215-7#2)包含了插入進(jìn)入下游區(qū)域的pDOW1215-7(2.8kb分析產(chǎn)物)，其他九個(gè)進(jìn)入上游區(qū)域(2.1kb分析產(chǎn)物)。其次，為了確認(rèn)菌株已經(jīng)失去了通過(guò)同源區(qū)域之間的重組的整合質(zhì)粒，下面的分析PCR過(guò)程可以使用單克隆pDOW1215-7#2接種到補(bǔ)充了250mM尿嘧啶的LB中，生長(zhǎng)過(guò)夜，然后涂布在含有尿嘧啶和500μg/mL的5-氟乳清酸核苷酸(5-FOA-ZymoResearch，OrangeCA)的LB平板上。八個(gè)克隆PCR被檢測(cè)，，PCR條件是HOTSTARTAQ聚合酶，pyranalF和pyranalR引物，57℃退火，延伸4分鐘。從母本MB101中擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小是3.2kb，或者如果pyrF基因被刪除后是2.5kb。每個(gè)克隆預(yù)期產(chǎn)生來(lái)自pyrF刪除的2.5kb的帶。前三個(gè)克隆被純化后命名為PFG116，PFG117，和PFG118(也稱為DC36)。三個(gè)單菌落表現(xiàn)為預(yù)料的pyrF刪除的表型，即它們對(duì)卡那霉素敏感，尿嘧啶是生長(zhǎng)所必需的，它們對(duì)5-FOA有抵抗力。PFG118的DNA序列是與pDOW1215-7的擴(kuò)增區(qū)域相同；例如在直接位于pyrF的下游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上有三個(gè)突變，沿著pyrF刪除部分插入到PFG118基因組，。利用pyrF基因作為熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記pyrF基因作為選擇性標(biāo)記物的能力可以通過(guò)將其克隆到pMYC表達(dá)質(zhì)粒中來(lái)檢測(cè)，這種質(zhì)粒包括一個(gè)現(xiàn)有的四環(huán)素抵抗標(biāo)記和在tac啟動(dòng)子調(diào)控下的目標(biāo)酶編碼序列。為此，質(zhì)粒pMYC5088在37℃下在含有NEB緩沖液4和0.1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)(NewEnglandBiolabs，BeverlyMA)的50μL體系中用SnaBI消化2小時(shí)。反應(yīng)的混合物在70℃保持20分鐘以滅活酶，然后按照上面的進(jìn)行凝膠純化。60ng的SnaBI-消化后的pMYC5088可以和50ng的MB214pyrFl-MB214pyrRlPCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，利用DNA連接試劑盒(EpicentreTechnologies，MadisonWI)。25℃反應(yīng)1小時(shí)后，反應(yīng)混合物在70℃保持20分鐘后結(jié)束。反應(yīng)結(jié)果在制造商推薦條件下轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(PromegaCorp.，MadisonWI)轉(zhuǎn)化株在含有15μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基篩選。質(zhì)粒DNA從12個(gè)克隆中利用QiaPrepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen，ValenciaCA)準(zhǔn)備，經(jīng)過(guò)Notl和EcoRI篩選，表明其中一個(gè)克隆包含預(yù)期的克隆，pDOW1249-2(圖2)。質(zhì)粒pDOW1249-2被轉(zhuǎn)化到包含了含有l(wèi)acI抑制表達(dá)盒和卡那霉素抑制標(biāo)記基因的pCN質(zhì)粒的pyrF(-)熒光假單胞菌中。克隆在搖瓶和20-L發(fā)酵罐中檢測(cè)到?？寺≡诤锌敲顾氐幕钧}培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是培養(yǎng)基不含有四環(huán)素，pDOW1249-2質(zhì)粒的唯一選擇壓力由在質(zhì)粒上的pyrF基因的能力提供，以補(bǔ)償染色體上pyrF刪除部分。由聚丙烯酰胺凝膠分析所決定，由在搖瓶檢測(cè)中新菌株產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)的數(shù)量接近于對(duì)照菌株，對(duì)照菌株包含相同的兩個(gè)質(zhì)粒的，但是在pDOW1249-2中缺乏pyrF基因的pyrF(+)熒光假單胞菌的系統(tǒng)，在相同培養(yǎng)基但是為了維持該質(zhì)粒另外加入四環(huán)素(數(shù)據(jù)沒(méi)有提供)。兩種菌株在20-L規(guī)模進(jìn)一步分析中非常接近，基于在聚丙烯酰胺凝膠和搖瓶中OD575的值所呈現(xiàn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的量。兩種菌株對(duì)于參照菌株都有在正常范圍內(nèi)可以觀察的一定目標(biāo)蛋白質(zhì)的積累量(圖1)。實(shí)施例2熒光假單胞菌宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)的pvrF-proC雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇性標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建在此使用的寡核苷酸表達(dá)系統(tǒng)proC15′-ATATGAGCTCCGACCTTGAGTCGGCCATTG-3′(SEQIDNO22)proC25′-ATATGAGCTCGGATCCAGTACGATCAGCAGGTACAG-3′(SEQIDNO23)proC35′-AGCAACACGCGTATTGCCTT-3′(SEQIDNO24)proC55′-GCCCTTGAGTTGGCACTTCATCG-3′(SEQIDNO25)proC65′-GATAAACGCGAAGATCGGCGAGATA-3′(SEQIDNO26)proC75′-CCGAGCATGTTTGATTAGACAGGTCCTTATTTCGA-3′(SEQIDNO27)proC85’-TGCAACGTGACGCAAGCAGCATCCA-3’(SEQIDNO28)proC95′-GGAACGATCAGCACAAGCCATGCTA-3′(SEQIDNO29)genF25′-ATATGAGCTCTGCCGTGATCGAAATCCAGA-3′(SEQIDNO30)genR25′-ATATGGATCCCGGCGTTGTGACAATTTACC-3′(SEQIDNO31)XbaNotDraU2連接序列5′-TCTAGAGCGGCCGCGTT-3′(SEQIDNO32)XbaNotDraL連接序列5′-GCGGCCGCTCTAGAAAC-3′(SEQIDNO33)從熒光假單胞菌中克隆proC并且形成一個(gè)包含proC的pCN表達(dá)質(zhì)粒在pCN511acI中用proC代替抗生素抗性基因proCORF和接近上游和下游序列的100bp的基因是從MB101基因組DNA利用proC1和proC2為引物擴(kuò)增，56℃退火和1分鐘的延伸擴(kuò)增的。在凝膠純化1kb產(chǎn)物后SacI熔解，該片段克隆到SacI-熔解的pDOW124(來(lái)自pCN511acl的增加了聚合連接體，并且用慶大霉素抗性基因替代卡那霉素抗性基因而得的質(zhì)粒)，生成pDOW1264-2。該質(zhì)粒在proC(-)突變株P(guān)FG932中檢測(cè)，其調(diào)控pDOW1249-2淀粉酶的合成的能力。表達(dá)目標(biāo)酶產(chǎn)物水平在20-L規(guī)模上接近于雙重抗生素抗性標(biāo)記的對(duì)照菌株DC88的產(chǎn)量(數(shù)據(jù)未提供)。genR抗生素標(biāo)記基因然后從pDOW1264-2(圖3)中除去而形成一個(gè)沒(méi)有抗生素標(biāo)記的含有proC和lacI的質(zhì)粒，除去genR基因是通過(guò)限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)pDOW1264-2消化，得到6.1kB的純化片段，連接到其本身，電轉(zhuǎn)化到proC(-)熒光假單胞菌宿主PFG1016中完成。克隆通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI檢驗(yàn)的。所得到的質(zhì)粒被命名為pDOW1306-6。EcoRI限制性內(nèi)切的分析和通過(guò)BamHI連接測(cè)序確認(rèn)了質(zhì)粒和該基因正確方向。測(cè)序工作由Dow化學(xué)公司完成。proC序列參見(jiàn)SEQIDNO4。含有用pyrF標(biāo)記替代抗生素抗性的標(biāo)記的目標(biāo)酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建沒(méi)有抗生素標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)粒，pDOW1269-2，包含一個(gè)tac啟動(dòng)子的調(diào)控下目標(biāo)酶編碼基因，是由PvuI在DOW1269-2中限制性切除去tetR/terA基因而構(gòu)建的。將來(lái)自MB214的pyrF基因插入pMYC5088后形成的，pDOW1249-2如實(shí)施例1所述準(zhǔn)備。10.6kb的PvuI片段凝膠純化后，連接其自身，電轉(zhuǎn)化到PFG118/pCN5llacI，涂在包含卡那霉素的M9葡萄糖培養(yǎng)基(以保留質(zhì)粒pCN5llacI)。提取質(zhì)粒DNA并對(duì)其用限制性內(nèi)切酶NcoI酶切分析的分離，被限制性內(nèi)切后兩個(gè)分離物與期望的條帶一致。兩個(gè)分離物均被PvuI連接后測(cè)序，確認(rèn)質(zhì)粒的相同性和其在基因內(nèi)部正確的方向。利用pyrF和proC的基因組刪除來(lái)構(gòu)建熒光假單胞菌菌株P(guān)FG118，一種含有pryF刪除基因的熒光假單胞菌MB101菌株，在實(shí)施例1中已經(jīng)描述。pDOW1261-2的構(gòu)建，用于基因替換和刪除的載體載體pDOW1261-2被設(shè)計(jì)來(lái)創(chuàng)造完全刪除基因組DNA，使用通過(guò)正向交叉和反向交叉(cross-in/cross-out)方法交換標(biāo)記物(Toder1994；Davison2002)，通過(guò)合并下列物性·ColEI復(fù)制原點(diǎn)，其僅在大腸桿菌發(fā)揮功能，而不存在熒光假單胞菌中發(fā)揮功能；·選擇性標(biāo)記物(tetR/tetA)用于將質(zhì)粒整合進(jìn)入染色體；·一種反向選擇的標(biāo)記(pyrF)其允許進(jìn)行插入質(zhì)粒丟失的選擇(只要宿主菌株是pyrF-)；丟失pyrF基因的細(xì)胞對(duì)5-FOA有抗性；和·鈍末端克隆位點(diǎn)，SrfI，有一個(gè)不平常的8bp的識(shí)別位點(diǎn)，如果欲插入缺失該位點(diǎn)，插入的功效可以通過(guò)在反應(yīng)體系中加入SrfI(Stratagene，LaJollaCA)以重新切開(kāi)沒(méi)有連接插入物的載體而被提高。為了構(gòu)建這個(gè)載體，5kb的包含tetR，tetA，和pyrF基因的PstI到EcoRI片段克隆到經(jīng)過(guò)PstI和EcoRI酶切的pCRScriptCAM(Stratagene，LaJollaCA)中，產(chǎn)生pDOW1261-2。構(gòu)建從染色體刪除proC的載體構(gòu)建proC的刪除部分，proC基因上游和下游側(cè)翼區(qū)域的拷貝通過(guò)PCR方法連接在一起，然后克隆到pDOW1261-2基因的替換載體。proC7引物，搭建了proC的ORF，被設(shè)計(jì)刪除整個(gè)從ATG起始密碼子到TAG終止密碼子的編碼序列。另外終止密碼子的下游16bp的序列也包括在刪除部分。為了使proC上游和下游區(qū)域的PCR融合，使用了PCR擴(kuò)增的Megaprimer方法(Barik1997)。為了制作megaprimer，proC開(kāi)放讀碼框的直接上游的0.5kb區(qū)域從MB214基因組DNA中通過(guò)PCR方式擴(kuò)增，以proC5和proC7作為引物。引物proC7覆蓋了proCORF的上游和下游區(qū)域。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1uM的引物，每種200uM的四種dNTPs，和Herculase高保真聚合酶(Stratagene，LaJollaCA)在制造商推薦的緩沖液中進(jìn)行。Herculase是一種高保真酶，主要包含Pfu聚合酶，得到平末端。擴(kuò)增過(guò)程是95℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)為95℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分鐘每kB，最后是72℃10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物由1％瓊脂糖凝膠電泳在TBE中分離并用溴化乙錠顯色。包含DNA的凝膠片段從凝膠中切下并且按照上面的方法純化。proC基因下游的1.3kb區(qū)域利用引物proC和proC6擴(kuò)增，作為下一步反應(yīng)的模板。同樣的擴(kuò)增條件被應(yīng)用，除了退火溫度為60℃。反應(yīng)由瓊脂糖凝膠檢測(cè)，然后利用StrataPrepPCR純化試劑盒進(jìn)行純化(Stratagene，LaJollaCA)。為了制造刪除融合部分的第二個(gè)步驟，megaprimer和proC6用做PCR反應(yīng)中引物，以proC-proC6PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板。退火溫度是61℃，延伸時(shí)間2分鐘。1kb的PCR產(chǎn)物被純化，平末端連接到經(jīng)由SrfI酶切過(guò)的自毀載體pDOW1261-2上。SrfI已經(jīng)包括在連接物中，為了降低不必要的載體的再次連接，如制造商說(shuō)明書上所示(pCRScriptCamCloningKit-Stratagene，LaJollaCA)。連接物通過(guò)電轉(zhuǎn)化(2mMgapcuvette，25，uF，2.25kV，200Ohms)(Artiguenaveetal.1997)至DH10β(GibcoBRLLifeTechnologies，nowInvitrogen，CarlsbadCA)，分離物通過(guò)限制酶DraIII篩選。每個(gè)分離物的PCR擴(kuò)增區(qū)域均由Dow化學(xué)公司測(cè)序；pDOW1305-6經(jīng)驗(yàn)證包含正確的基因組DNA序列。熒光假單胞菌pyrF-proC雙刪除的形成為了制作雙刪除的菌株，如上面所述利用pDOW1305-6電轉(zhuǎn)化PFG118?？寺◇w的分析PCR以proC8和M13/pUC反向序列引物(-48)(只與質(zhì)粒雜交)(NewEnglandBiolabs，BeverlyMA)，利用HotStarTaq酶(Qiagen，ValenciaCA)，退火溫度為59℃，延伸時(shí)間為4分鐘，顯示22個(gè)分離物中有9個(gè)具有整合進(jìn)入proC的上游區(qū)域的質(zhì)粒，22個(gè)中有7個(gè)具有整合進(jìn)入下游區(qū)域的質(zhì)粒(數(shù)據(jù)未提供)。每個(gè)方向的3個(gè)被純化成為單克隆。三個(gè)分離物PFG118::1305-6.1，-6.8，-6.10已經(jīng)插入到上游區(qū)域；PFG118::1305-6.2，-6.3，-6.9這三個(gè)單體插入到下游區(qū)域。為了給已經(jīng)攜帶質(zhì)粒和離開(kāi)一個(gè)刪除部分的染色體基因之間同源重組的細(xì)胞(Toselectforcellsthathavecarriedoutahomologousrecombinationbetweentheplasmidandthechromosomegenestherebyleavingadeletion)，PFG118::1305-6.1和-6.2在含有尿嘧啶和脯氨酸補(bǔ)充物的50mL的LB中生長(zhǎng)為穩(wěn)定期，然后接種在含有尿嘧啶和脯氨酸添加物的LB-5-FOA。通過(guò)重組丟失了整合質(zhì)粒的細(xì)胞也丟失了pyrF基因，所以預(yù)期能夠抵制以其它方式轉(zhuǎn)變成毒性物質(zhì)的5-FOA。利用proC8和proC9分析的PCR執(zhí)行著區(qū)分細(xì)胞丟失質(zhì)粒和更新的原始序列，它們已經(jīng)丟失了刪除部分。兩個(gè)帶有預(yù)期的1.3kb帶的分離物分別從兩個(gè)選擇物中挑選出來(lái)，命名為PFG1013，PFG1014，PFG1015和PFG1016(也稱為DC164)。所有這四個(gè)分離物都不能在M9葡萄糖中生長(zhǎng)除非加入脯氨酸和尿嘧啶，而且都對(duì)四環(huán)素敏感。PFG118(野生型proC)和PFG1016(刪除了proC)的基因組區(qū)域通過(guò)PCR(引物是proC8和proC9，HotStarTaq聚合酶，63℃退火，3分鐘延伸)擴(kuò)增和測(cè)序。菌株P(guān)FG1016的proC5和proC6之間的區(qū)域與母本相同，除了預(yù)期刪除的835bp。雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記物表達(dá)體系PFG1016/pDOW1306-6pDOW1269-2的構(gòu)建質(zhì)粒從菌株P(guān)FG118pCN511acIpDOW1269-2通過(guò)HISPEED質(zhì)粒Midi試劑盒(Qiagen，ValenciaCA)分離出來(lái)。pDOW1269-2從pCN511acl通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳部分純化，電轉(zhuǎn)化至PFG1016pDOW1306-6。轉(zhuǎn)化株在沒(méi)有添加劑的M9/葡萄糖培養(yǎng)基上篩選。因?yàn)榇嬖谝恍┌琾CN5llacI污染pDOW1269-2制備品的轉(zhuǎn)換進(jìn)入細(xì)胞的可能，每個(gè)轉(zhuǎn)化株中的三個(gè)分離物被檢測(cè)對(duì)卡那霉素的敏感性，攜帶pCN5llacI的抗生素標(biāo)記物；所有六個(gè)發(fā)現(xiàn)成敏感性。這六個(gè)菌株發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)酶活性檢測(cè)中表達(dá)目標(biāo)酶。PCR分析表明所有六個(gè)都包含染色體的proC刪除。從轉(zhuǎn)化株分離出來(lái)的質(zhì)粒限制性內(nèi)切與預(yù)期的模式相同。雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記表達(dá)系統(tǒng)在搖瓶中的性能測(cè)試如實(shí)施例1中所述，六個(gè)菌株在搖瓶中測(cè)試。通過(guò)在26小時(shí)之后加入IPTG對(duì)目標(biāo)酶表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。六個(gè)菌株的OD575值與雙抗生素抗性標(biāo)記表達(dá)系統(tǒng)對(duì)照組DC88一致。通過(guò)SDS-PAGE測(cè)試所有六個(gè)的目標(biāo)酶產(chǎn)物水平也與對(duì)照相當(dāng)。最高OD575的兩個(gè)菌株1046和1048被選做進(jìn)一步特征研究。雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記表達(dá)系統(tǒng)在20-L發(fā)酵罐中性能測(cè)試菌株1046和1048被選做在20-L生物發(fā)生器中進(jìn)一步測(cè)試。通過(guò)在26小時(shí)之后加入IPTG對(duì)目標(biāo)酶表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。兩個(gè)菌株都到達(dá)對(duì)照菌株DC88的OD575和目標(biāo)酶活性的正常范圍的性能水平。這兩個(gè)菌株的性能的平均水平如表1所示。在接種狀態(tài)和在26小時(shí)后剛開(kāi)始誘導(dǎo)前的樣品中制備的質(zhì)粒的限制酶切表明與預(yù)期的模式相一致。同一樣品所攜帶的基因組DNA的分析PCR證明proC刪除和pyrF刪除部分的保持力。25小時(shí)的樣品的一部分涂平板在四環(huán)素，慶大霉素，或者卡那霉素添加的培養(yǎng)基上；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)，證明缺乏抗生素抑制基因活性。菌株1046(也稱為DC167)在20-L生物發(fā)生器中的分析重復(fù)兩次，出現(xiàn)相近的結(jié)果。接種時(shí)和發(fā)酵25小時(shí)后(感應(yīng)現(xiàn)象出現(xiàn)之前)的質(zhì)粒穩(wěn)定性通過(guò)從稀釋和涂在完全培養(yǎng)基的復(fù)制法(replica)而測(cè)試。兩個(gè)質(zhì)粒出現(xiàn)高于97％的克隆檢測(cè)，表明在沒(méi)有質(zhì)粒的缺乏交叉?zhèn)鬟f回復(fù)突變型(crossfeedingrevertants)能夠存活并且在熒光假單胞菌中維持表達(dá)載體。結(jié)果兩種pyrF表達(dá)系統(tǒng)都具有與只使用抗生素抑制標(biāo)記物的對(duì)照體系相同的性能(圖1)。對(duì)于對(duì)照菌株，沒(méi)有交叉?zhèn)鬟f(cross-feeding)的副反應(yīng)，因?yàn)槿魏螐钠屏鸭?xì)胞而來(lái)的外源代謝物的都不能降低或者除去由培養(yǎng)基中抗生素提供的選擇壓力。預(yù)期在兩個(gè)pyrF表達(dá)體系的由于交叉?zhèn)鬟f導(dǎo)致的性能的預(yù)期降低非常驚訝的沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例3在熒光假單胞菌中的lacI，lacIQ和lacIQI染色體整合三個(gè)熒光假單胞菌菌株已經(jīng)構(gòu)建，每個(gè)與三個(gè)不同的大腸桿菌lacI等位基因，lacI(SEQIDNO9)，lacIQ(SEQIDNO11)，和lacIQI(SEQIDNO12)，整合到染色體。三個(gè)菌株展示不同的LacI抑制積累量。每個(gè)菌株都在熒光假單胞菌DC36果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)(SEQIDNO13)攜帶一個(gè)lacI基因的單拷貝，它是MB101的衍生物(參見(jiàn)TDLandry等人，″Safetyevaluationofana-amylaseenzymepreparationderivedfromthearchaealorderThermococcalesasexpressedinPseudonaonasfluorescensbiovarI，″RegulatorToxicologyandPharraacology37(1)149-168(2003))通過(guò)從其中刪除pyrF基因而形成，如上面所述。沒(méi)有載體或者其它外來(lái)DNA序列保留在菌株中。菌株不含抗生素抗性基因并且還包含pyrF刪除，允許維持一個(gè)攜帶pyrF+基因的表達(dá)質(zhì)粒在不含尿嘧啶添加劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。蛋白質(zhì)產(chǎn)物完全不含抗生素抗性基因和抗生素。MB214包含lacI-lacZYA染色體的插入在美國(guó)專利5,169,760中有描述。MB214也包含在LacI蛋白的C末端點(diǎn)的一個(gè)復(fù)制，加入大約10kDa的分子量至LacI抑制劑的分子量。用于插入基因至果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)的載體pDOW1266-1的構(gòu)建質(zhì)粒pDOW1266-1通過(guò)熒光假單胞菌的果聚糖蔗糖酶(SEQIDNO13)的上游和其中區(qū)域的PCR擴(kuò)增而構(gòu)建的，利用XbaI位點(diǎn)替代起始密碼子，利用Megaprimer方法，參見(jiàn)ABarik，″MutagenesisandGeneFusionbyMegaprimerPCR，″inBAWhite，PCRCloningProtocols173-182(1997)(Humana)。PCR是利用HERCULASE聚合酶(Stratagene，MadisonWI，USA)，引物L(fēng)EV1(SEQIDNO34)和LEV2(SEQIDNO35)，熒光假單胞菌MB214基因組DNA(參見(jiàn)下面的寡聚核苷酸序列)為模板而執(zhí)行的。引物L(fēng)EV2(SEQIDNO35)包含插入XbaI位點(diǎn)的序列。反應(yīng)條件為95℃2分鐘，95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后是72℃10分鐘。1kb的產(chǎn)物凝膠純化后作為下一個(gè)反應(yīng)的引物之一，同LEV3(SEQIDNO36)，利用MB214基因組DNA作為模板，相同的條件，除了延伸時(shí)間為2分鐘。2kb的產(chǎn)物凝膠純化，再次與LEV2(SEQIDNO35)和LEV3(SEQIDNO36)再擴(kuò)增以提高數(shù)量。所用的寡核苷酸LEV1(SEQIDNO34)5′-TTCGAAGGGGTGCTTTTTCTAGAAGTAAGTCTCGTCCATGALEV2(SEQIDNO35)5′-CGCAAGGTCAGGTACAACACLEV3(SEQIDNO36)5′-TACCAGACCAGAGCCGTTCALEV7(SEQIDNO37)5′-CTACCCAGAACGAAGATCAGLEV8(SEQIDNO38)5′-GACTCAACTCAATGGTGCAGGBglXbaLacF(SEQIDNO39)5′-AGATCTCTAGAGAAGGCGAAGCGGCATGCATTTACGlacIR4(SEQIDNO40)5′-ATATTCTAGAGACAACTCGCGCTAACTTACATTAATTGCLacpro9(SEQIDNO41)5′-ATATTCTAGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGALacIQF(SEQIDNO42)5′-GCTCTAGAAGCGGCATGCATTTACGTTGACACCLacINXR(SEQIDNO43)5′-AGCTAGCTCTAGAAAGTTGGGTAACGCCAGGGTlacIQI(SEQIDNO44)5′-AGTAAGCGGCCGCAGCGGCATGCATTTACGTTGACACCACCTTTCGCGGTATGGCATG下面的僅用于分析測(cè)序lacIF1(SEQIDNO45)5′-ACAATCTTCTCGCGCAACGClacIF2(SEQIDNO46)5′-ATGTTATATCCCGCCGTTAAlacIR1(SEQIDNO47)5′-CCGCTATCGGCTGAATTTGAlacIR2(SEQIDNO48)5′-TGTAATTCAGCTCCGCCATCSeqLev5AS(SEQIDNO49)5′-TATCGAGATGCTGCAGCCTCSeqLev3S(SEQIDNO50)5′-ACACCTTCACCTACGCCGACLEV10(SEQIDNO51)5′-TCTACTTCGCCTTGCTCGTTLEV2-LEV3的擴(kuò)增產(chǎn)物被克隆至pDOW1261-2的SrfI位點(diǎn)，包含熒光假單胞菌pyrF+基因作為一個(gè)選擇性標(biāo)記物以促進(jìn)刪除的選擇的自殺性載體。新質(zhì)粒命名為pDOW1266-1。擴(kuò)增區(qū)域被測(cè)序。LacI基因克隆至插入載體pDOW1266-1大腸桿菌lacI基因從pCN511acI中以引物BglXbaLacF(SEQIDNO39)和lacIR4(SEQIDNO40)，利用HERCULASE聚合酶(退火溫度62℃，延伸時(shí)間2分鐘)擴(kuò)增出來(lái)。凝膠純化之后，利用XbaI酶切，lacI基因克隆至pDOW1266-1的XbaI位點(diǎn)，形成pDOW1310。lacIQ基因通過(guò)利用pCN511acI為模板，使用15個(gè)引物lacpro9(SEQIDNO41)和lacIR4(SEQIDNO40)，HERCULASE聚合酶(退火溫度62℃，2分鐘延伸時(shí)間)PCR擴(kuò)增出來(lái)。凝膠純化后XbaI酶切，它被克隆至pDOW1266-1的XbaI位點(diǎn)，形成pDOW1311。lacIQI基因是通過(guò)從大腸桿菌K12(ATCC47076)中的lacI基因利用引物lacIQI(SEQIDNO44)和lacINXR(SEQIDNO43)擴(kuò)增而創(chuàng)造，然后克隆至pCR2.1Topo(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，形成pCR2-lacIQI。lacIQI基因從pCR2-lacIQI再次擴(kuò)增利用引物lacIQF(SEQIDNO42)和lacINXR(SEQIDNO43)，Herculase聚合酶(61℃退火，3分鐘延伸時(shí)間，35個(gè)循環(huán))。凝膠純化之后，利用XbaI酶切，PCR產(chǎn)物被克隆至pDOW1266-1的XbaI位點(diǎn)，形成pDOW1309。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pCR2-lacIQl，pDOW1310，pDOW1311，和pDOW1309進(jìn)行測(cè)序(利用引物lacIF1(SEQIDNO45)，lacIF2(SEQIDNO46)，lacIR1(SEQIDNO47)，lacIR2(SEQIDNO48)，SeqLev5AS(SEQIDNO49)，SeqLev3S(SEQIDNO50)，和LEV10(SEQIDNO51))證實(shí)PCR反應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生的突變。在每一種情況下，選擇方向其使得lacI轉(zhuǎn)錄同果聚糖蔗糖酶基因方向相同。盡管果聚糖蔗糖酶啟動(dòng)子潛在的能夠調(diào)控lacI的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子只能在蔗糖存在下起作用，它不存在于發(fā)酵條件下。在果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)攜帶整合lacI基因的熒光假單胞菌菌株的構(gòu)建載體pDOW1309，pDOW1310，和pDOW1311通過(guò)電轉(zhuǎn)化介入DC36，載體整合進(jìn)入基因組的第一選擇就是利用四環(huán)素的抗性?？寺〗?jīng)過(guò)篩選，以測(cè)定載體已經(jīng)整合在果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)，通過(guò)PCR方式利用引物L(fēng)EV7(SEQIDNO37)和M13R(NewEnglandBiolabs，GloucesterMA，USA)。為了第二次交換選擇，該交換能夠讓lacI基因留在基因組，分離物在存在5-氟乳清酸核苷酸而缺乏四環(huán)素的條件下生長(zhǎng)。基因組中復(fù)制區(qū)域之間的重組或者保存母本的基因型，或者留下了lacI基因。獲得的分離物，生長(zhǎng)在缺乏尿嘧啶條件下，通過(guò)以LEV7(SEQIDNO37)和LEV8(SEQIDNO38)為引物的PCR篩選對(duì)四環(huán)素的敏感性。新菌株的命名參見(jiàn)表17。為了得到基因組區(qū)域的序列信息，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，參見(jiàn)EWerle，″Directsequencingofpolymerasechainreactionproducts，″LaboratoryMethodsfortheDetectionofMutationsandPolymorphismsinDNA163-174(1997)。對(duì)與每個(gè)菌株，測(cè)序證實(shí)了啟動(dòng)子的同一性，相對(duì)于側(cè)面區(qū)域的lacI變體的方向，以及相對(duì)于母本序列是否存在點(diǎn)突變。DC202和DC206的序列正如所預(yù)料的。DC204序列表明在果聚糖蔗糖酶讀碼框，lacIQ的下游，的一個(gè)點(diǎn)突變，它并沒(méi)有改變?nèi)魏尉幋a序列，所以是無(wú)關(guān)緊要的。表17.攜帶LACI等位基因整合到基因組中的熒光假單胞菌菌株與pCN511acI相比較LacI在lacI整合(integrants)中的相對(duì)濃度的分析，UnBlot是一種類似于Western分析的方法，蛋白質(zhì)在凝膠中檢測(cè)而不需要轉(zhuǎn)移到濾紙(filter)。該技術(shù)根據(jù)制造商PierceBiotechnology(Rockford，IL，USA)的指示完成。利用UnBlot分析表明在每個(gè)新整合菌株的LacI的量均高于MB214中的量。MB214包含lacI-lacZYA插入部分在美國(guó)專利5,169,760有描述。LacI在lacIQ和lacIQI整合體中相對(duì)濃度大約同攜帶pCN511acI的菌株中的濃度相當(dāng)，包含lacI多拷貝質(zhì)粒。參見(jiàn)圖5。進(jìn)行一系列稀釋，為了更精確的評(píng)估LacI濃度在MB214，DC202(lacI整合)和DC206(lacIQI整合)的相對(duì)差別。MB101pCN511acI，DC204和DC206中的LacI比MB214中高出大約100倍，而DC202大約高出5倍多。實(shí)施例4腈水解酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄菌株DC140通過(guò)導(dǎo)入熒光假單胞菌MB214廣泛宿主范圍的四環(huán)素抗性質(zhì)粒，pMYC1803(WO2003/068926)而獲得，其中腈水解酶基因(GDeSanthisetal.，J.Amer.Chem.Soc.12511476-77(2003))，在啟動(dòng)子Ptac的調(diào)控下已經(jīng)被插入該質(zhì)粒。為了比較DC202和DC206中靶基因沒(méi)有誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)節(jié)與MB214之間的關(guān)系，同樣的腈水解酶基因被克隆至pMYC1803衍生物，其中的四環(huán)素抗性基因已經(jīng)被pyrF選擇性標(biāo)記所代替。新質(zhì)粒pDOW2415電轉(zhuǎn)化至DC202和DC204，分別得到DC239和DC240。DC140，DC239和DC240在20L發(fā)酵罐內(nèi)生長(zhǎng)，通過(guò)在礦物鹽的培養(yǎng)基中提供葡萄糖或者甘油，最終細(xì)胞濃度位于在大約20g/L至超過(guò)70g/L干細(xì)胞重量的生物量(參見(jiàn)WO2003/068926)。Ptac啟動(dòng)子的安慰誘導(dǎo)物，IPTG，被加入以誘導(dǎo)表達(dá)。DC140與DC239與DC240腈水解酶活性誘導(dǎo)前的比例是6∶2∶1。相同樣品的Northern印跡法的RNA分析顯示相同程度的阻遏水平?；诠饷芏葴y(cè)量，DC140∶DC239∶DC240未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本水平比例是2.4∶1.4∶1.0。使用0.3mMIPTG誘導(dǎo)之后馬上(30分鐘)，所有菌株的轉(zhuǎn)錄本水平相同。腈水解酶誘導(dǎo)后產(chǎn)物比例也相當(dāng)。這暗示所用的誘導(dǎo)物的濃度能夠足夠充分的誘導(dǎo)這三個(gè)菌株的Ptac啟動(dòng)子，盡管它們不同的LacI蛋白水平。但是，阻遏最多的菌株DC140的發(fā)酵在大約誘導(dǎo)后24小時(shí)后伴隨著腈水解酶活性的消失承受著較大的細(xì)胞裂解。改良的誘導(dǎo)，更嚴(yán)格調(diào)節(jié)的菌株DC239和DC240能夠延伸到超過(guò)誘導(dǎo)后48小時(shí)，而且維持高的腈水解酶的產(chǎn)率，最終結(jié)果是腈水解酶的產(chǎn)量加倍，參加圖6。結(jié)果本實(shí)施例顯示在假單胞菌中使用不同于整體中的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子的LacI編碼基因?qū)е抡T導(dǎo)前重組蛋白表達(dá)充分改良的抑制，在商業(yè)大規(guī)模發(fā)酵中更高的細(xì)胞密度，與先前l(fā)acI-lacZYA假單胞菌染色體的插入(美國(guó)專利5,169,760)相比，預(yù)期產(chǎn)物產(chǎn)量也增加了。結(jié)果也顯示lacI插入體在熒光假單胞菌中LacI產(chǎn)生抑制蛋白非常有效，所以排除在細(xì)胞中維持一個(gè)獨(dú)立編碼LacI受體蛋白質(zhì)粒的需要，并且減少由于這種維護(hù)而產(chǎn)生的無(wú)效的潛在產(chǎn)物。另外不含有抗生素，在DC239和DC240中生長(zhǎng)階段的阻遏達(dá)到比MB214菌株少10倍。DC239和DC240的誘導(dǎo)前腈水解酶在多于13個(gè)單獨(dú)發(fā)酵中活性水平平均為0.4U/ml，在DC239和DC240中細(xì)胞密度和腈水解酶表達(dá)在延伸誘導(dǎo)階段沒(méi)有衰減，和DC140一樣，考慮到較高的阻遏作用，DC239和DC240發(fā)酵運(yùn)行，降低生長(zhǎng)階段的時(shí)間超過(guò)30％，減少發(fā)酵成本。實(shí)施例5tac啟動(dòng)子與單個(gè)理想的lac操作子和與兩個(gè)lac操縱基因的構(gòu)建天然的tac啟動(dòng)子只有一個(gè)天然的lac操縱基因，AATTGTGAGCGGATAACAATT，在O1位置(圖4)。在第一個(gè)構(gòu)建體中，pDOW1418，天然的操縱基因由更對(duì)稱的lacOid操縱基因序列5′-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3′(SEQIDNO14)(JR.Sadler，H.SasmorandJL.Betz.PNAS.1983Nov；80(22)6785-9)代替。一個(gè)包含tac啟動(dòng)子和天然lacO序列的289bpHindlll/Spel片段被從pMYC1803衍生物pDOW2118中刪除，由從SOE中PCR擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物，其包含了對(duì)稱的lacOid序列分離出來(lái)的HindIII/Spel片段代替。SOEPCR引物(RC-3和RC-9)含有4個(gè)核苷變化，其產(chǎn)生最優(yōu)化/對(duì)稱lacO序列(三個(gè)堿基對(duì)取代和一個(gè)堿基對(duì)刪除)。獲得質(zhì)粒pDOW2201的HindIII/SpeI啟動(dòng)子片段被克隆至基于pMYC1803的腈水解酶表達(dá)質(zhì)粒，代替天然的tac啟動(dòng)子，形成pDOW1414。這種表達(dá)盒然后轉(zhuǎn)移至pyrF(+)質(zhì)粒pDOW1269，通過(guò)交換DraI/XhoI片段形成pDOW1418。質(zhì)粒pDOW1418然后轉(zhuǎn)至宿主菌株DC206，形成菌株DC281(參見(jiàn)圖4)。所用的寡核苷酸RC-3(SEQIDNO52)5′-GTGAGCGCTCACAATTCCACACAGGAAAACAGRC-4(SEQIDNO53)5′-TTCGGGTGGAAGTCCAGGTAGTTGGCGGTGTARC-9(SEQIDNO54)5′-GAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCRC-10(SEQIDNO55)5′-ATTCAGCGCATGTTCAACGG在第二次構(gòu)建體中，pDOW1416，lacOid操縱基因，5′-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3′(SEQIDNO14)，通過(guò)PCR插入核苷在天然lacO1存在的上游(5’)52個(gè)核苷酸的位置。啟動(dòng)子區(qū)域使用Megaprimer方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增利用pMYC1803的衍生物，pMYC5088執(zhí)行，然后第一步引物是AKB-1和AKB-2。所得的PCR產(chǎn)物在利用相同模板的第二輪的PCR擴(kuò)增中與引物AKB-3相結(jié)合。在利用HindIII和Spel純化和酶切之后，包括雙重操縱基因的啟動(dòng)子片段被克隆到質(zhì)粒pMYC5088的HindIII和SpeI位點(diǎn)，得到pDOW1411。第二個(gè)操縱基因的介入引進(jìn)了一個(gè)唯一緊跟著最優(yōu)化操縱基因的上游的MfeI位點(diǎn)。攜帶pDOW1411的啟動(dòng)子區(qū)域的Xhol/Spel載體片段然后連接攜帶到腈水解酶基因的pMYC1803衍生物的兼容片段，形成pDOW1413。pDOW1413的MfeI/XhoI表達(dá)盒片段的下一步與pDOW1269的兼容載體片段連接，得到pDOW1416；它轉(zhuǎn)錄到DC206，形成菌株DC262。所用的寡聚核苷酸AKB-1(SEQIDNO56)5′-ACGGTTCTGGCAAACAATTGTGAGCGCTCACAATTTATTCTGAAATGAGCAKB-2(SEQIDNO57)5′-GCGTGGGCGGTGTTTATCATGTTCAKB-3(SEQIDNO58)5′-TACTGCACGCACAAGCCTGAACA腈水解酶阻遏Northern印跡分析在MB214，DC202，和DC206誘導(dǎo)前后分別進(jìn)行。MB214，DC202，和DC206利用在tac啟動(dòng)子3’端的O1位置含有野生型的lacO序列的腈水解酶表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造了MB214wtO1，DC202wtO1(DC239)，和DC206wtO1(DC240)，如上面所述。DC206也利用在tac啟動(dòng)子3’端的O1位置含有取代野生型lacO序列的含有l(wèi)acOid序列的腈水解酶表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如上面所述，創(chuàng)建了DC2060id(DC281)。DC206也利用在tac啟動(dòng)子3’端的O1位置含有野生型的有l(wèi)acO序列和在tac啟動(dòng)子5’端的O3位置含有l(wèi)acOid序列的腈水解酶表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，創(chuàng)建了包含DC206wtO1O3id(DC263)的雙重lacO。Northern印跡分析顯示了包含雙重lacO序列盒(DC206wtO1O3id(DC263))的菌株在誘導(dǎo)前表現(xiàn)出了更大的抑制。當(dāng)產(chǎn)生毒素蛋白質(zhì)時(shí)誘導(dǎo)前表達(dá)的更大的抑制尤其有用，因?yàn)檎T導(dǎo)前毒素蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)水平導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)階段的延遲，并且潛在地，產(chǎn)物更低的收率。權(quán)利要求1.一種用于包括核酸構(gòu)建體的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)缺陷型假單胞菌細(xì)胞，該構(gòu)建體包括a.編碼重組多肽的核酸；b.編碼至少一種將營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞回復(fù)為原養(yǎng)型的多肽的核酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是尿嘧啶是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是脯氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞對(duì)多于一種代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其中該這種細(xì)胞對(duì)尿嘧啶和脯氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中原養(yǎng)型回復(fù)多肽是細(xì)胞存活必需的代謝物生物合成中活性的酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中該酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中該酶通過(guò)選自SEQID.1和3的核酸序列編碼。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中該酶包含SEQIDNo.2的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中該酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中該酶通過(guò)選自SEQID.6和8的核酸序列編碼。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中該酶包含SEQID.No.7的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中通過(guò)使pyrF基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中通過(guò)使proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其中該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6和SEQ.ID.No.8的核酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中通過(guò)使pyrF基因和proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中該失效的pyrF基因含有選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，以及該失效的proC基因含有選自SEQ.ID.No.6或SEQID.No.9的核酸。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞還包含不是作為PlacI-lacI-lacZYA操縱子一部分的染色體lacI插入片段。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中該lacI基因選自lacI，lacIQ和lacIQI。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種lacOid序列。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含多于一種的lac操縱基因序列。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞，其中至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的5’端，并且至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的3’端。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)胞，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。28.一種用于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的遺傳修飾假單胞菌細(xì)胞，其中該修飾包括至少一種lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA操縱子。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中該lacI基因選自lacI，lacIQ或lacIQI。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中該lacI基因被插入果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞被進(jìn)一步修飾以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾選自pyrF和proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。35.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包括含有至少一種lacOid序列的核酸。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。37.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包括含有多于一種lac操縱基因序列的核酸。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。40.用于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中的假單胞菌細(xì)胞，包括核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含至少一種lacOid操縱基因序列。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列位于啟動(dòng)子的3’端。43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列位于啟動(dòng)子的5’端。44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中l(wèi)acOid序列位于啟動(dòng)子的3’端和5’端。45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞被進(jìn)一步修飾以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾選自pyrF和proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。49.根據(jù)權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQIDNO.14或SEQ.ID.NO.59。50.一種用于包含核酸構(gòu)建體的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的假單胞菌細(xì)胞，，該構(gòu)建體包含多于一種的lac操縱基因序列。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中至少一種lac操縱基因是lacOid序列。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端或3’端。54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的細(xì)胞，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端和3’端。55.根據(jù)權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾選自pyrF或proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的細(xì)胞，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。58.根據(jù)權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacl-lacZYA操縱子整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。59.根據(jù)權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。60.一種生產(chǎn)重組多肽的方法，包括a.在假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)編碼重組多肽的核酸，該假單胞菌細(xì)胞已經(jīng)被遺傳修飾以形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型；b.表達(dá)編碼多肽的核酸，該多肽將營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞回復(fù)成原養(yǎng)型；c.使細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)缺陷型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該細(xì)胞是尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷。63.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該細(xì)胞是脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞對(duì)多于一種的代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中該細(xì)胞是尿嘧啶和脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。66.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該原養(yǎng)型回復(fù)多肽是細(xì)胞存活所需代謝物生物合成中活性的酶。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中該酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中該酶通過(guò)選自SEQ.ID.1或3的核酸序列編碼。69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中該酶包含SEQIDNo.2的氨基酸序列。70.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中該酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶。71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中該酶通過(guò)選自ID.NO.6或8的核酸序列編碼。72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中該酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。73.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中通過(guò)使pyrF基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸序列。75.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中通過(guò)使proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸序列。77.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中通過(guò)使pyrF基因和proC基因失效產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸序列，以及該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。79.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中該細(xì)胞還包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子一部分的染色體lacI插入片段。80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中該lacI基因選自lacI，lacIQ或lacIQI。81.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中編碼重組多肽的該核酸進(jìn)一步包含至少一種lacOid序列。82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。83.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中編碼重組多肽的該核酸進(jìn)一步包含多于一種的lac操縱基因序列。84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的5’端，以及至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的3’端。85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。87.一種生產(chǎn)重組多肽的方法，包括在假單胞菌中表達(dá)編碼重組多肽的核酸，該假單胞菌細(xì)胞包含至少一種lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子整體的部分或者截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA操縱子。88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。89.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中該lacI基因選自lacI，lacIQ或lacIQI。90.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中將該lacI基因插入果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)。91.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF或proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。93.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。94.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中編碼重組多肽的該核酸包含至少一種lacOid序列。95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。96.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中編碼重組多肽的該核酸包含多于一種lac操縱基因序列。97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。99.一種生產(chǎn)重組多肽的方法，包括在假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)編碼該重組多肽的核酸，其中該核酸進(jìn)一步包含至少一種lac操縱基因序列，其中該lac操縱基因序列是lacOid序列。100.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。101.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。102.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中至少一種lacOid序列位于啟動(dòng)子的3’端。103.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中至少一種lacOid序列位于啟動(dòng)子的5’端。104.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中至少一種lacOid序列位于啟動(dòng)子的3’端和5’端。105.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF和proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。107.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。108.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。109.一種生產(chǎn)重組多肽的方法，包括在假單胞菌中表達(dá)編碼重組多肽的核酸，其中該核酸進(jìn)一步包含多于一種lac操縱基因序列。110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中至少一種lac操縱基因是lacOid序列。111.根據(jù)權(quán)利要求110所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。112.根據(jù)權(quán)利要求110所述的方法，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端或3’端。113.根據(jù)權(quán)利要求110所述的方法，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端和3’端。114.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。115.根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF或proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。116.根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。117.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。118.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。119.一種在宿主細(xì)胞中調(diào)控重組蛋白表達(dá)的方法，包括a.選擇假單胞菌細(xì)胞，其中通過(guò)將lacI基因染色體插入該細(xì)胞中對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，其中l(wèi)acI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或者截?cái)嗟腜lacI-lacI-lacZYA操縱子；和b.核酸構(gòu)建體引入該細(xì)胞中，該構(gòu)建體包括可操作連接編碼該重組多肽的核酸的LacI蛋白啟動(dòng)子。120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中假單胞菌是熒光假單胞菌。121.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中該lacI基因選自由lacI，lacIQ或lacIQI。122.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中將該lacI基因插入果聚糖蔗糖酶位點(diǎn)。123.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。124.根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF或proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。125.根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。126.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中編碼該重組蛋白的該核酸包含至少一種lacOid序列。127.根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。128.根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中至少一種lacOid序列位于啟動(dòng)子的3’端。129.根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中至少一種lacOid序列位于啟動(dòng)子的5’端。130.根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中l(wèi)acOid序列位于啟動(dòng)子的5’端和3’端。13l、根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中編碼該重組蛋白的該核酸包含多于一種的lac操縱基因序列。132.根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。133.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。134.一種調(diào)控宿主細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)的方法，包括a.選擇假單胞菌細(xì)胞；和b.引入核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括i.編碼重組多肽的核酸，ii.至少一種lacOid操縱基因序列。135.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中假單胞菌是熒光假單胞菌。136.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中該lacOid位于啟動(dòng)子的3’端。137.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中該lacOid位于啟動(dòng)子的5’端。138.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中l(wèi)acOid位于啟動(dòng)子的3’端和5’端。139.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。140.根據(jù)權(quán)利要求139所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF和proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。141.根據(jù)權(quán)利要求139所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。142.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。143.根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。144.一種調(diào)控宿主細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)的方法，包括a.選擇假單胞菌細(xì)胞；和b.引入核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括i.編碼重組多肽的核酸，和ii.多于一種lac操縱基因序列。145.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中至少一種lac操縱基因是lacOid序列。146.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中該lacOid序列選自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。147.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端或3’端。148.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中該lacOid序列是啟動(dòng)子的5’端和3’端。149.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中進(jìn)一步修飾該細(xì)胞以在該細(xì)胞中形成對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。150.根據(jù)權(quán)利要求149所述的方法，其中通過(guò)修飾選自pyrF和proC的基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。151.根據(jù)權(quán)利要求149所述的方法，其中通過(guò)修飾pyrF和proC兩種基因來(lái)形成該營(yíng)養(yǎng)缺陷型。152.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中該細(xì)胞包含lacI基因的染色體插入，其中該lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操縱子整體的一部分或者截?cái)嗟腜lac-lacI-lacZYA操縱子。153.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。154.一種在缺少抗生素的情況下生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括a.選擇假單胞菌細(xì)胞，其中對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來(lái)引起對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因此產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞；b.將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中，該構(gòu)建體包括i.編碼重組多肽的核酸；ii.編碼將營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞回復(fù)成原養(yǎng)型的多肽的核酸；c.在該細(xì)胞中表達(dá)重組多肽和原養(yǎng)型回復(fù)多肽；和d.使該細(xì)胞在缺乏該營(yíng)養(yǎng)缺陷型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。155.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。156.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該細(xì)胞是尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷。157.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該細(xì)胞是脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。158.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞是對(duì)多于一種的代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷。159.根據(jù)權(quán)利要求158所述的方法，其中該細(xì)胞是尿嘧啶和脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。160.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該原養(yǎng)型回復(fù)多肽是細(xì)胞存活所需代謝物生物合成中活性的酶。161.根據(jù)權(quán)利要求160所述的方法，其中該酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶。162.根據(jù)權(quán)利要求161所述的方法，其中該酶通過(guò)選自SEQ.ID.1或3的核酸來(lái)編碼。163.根據(jù)權(quán)利要求160所述的方法，其中該酶含SEQIDNo.2的氨基酸序列。164.根據(jù)權(quán)利要求160所述的方法，其中該酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶。165.根據(jù)權(quán)利要求164所述的方法，其中該酶通過(guò)選自SEQ.ID.NO.6或8的核酸序列來(lái)編碼。166.根據(jù)權(quán)利要求164所述的方法，其中該酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。167.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中通過(guò)使pyrF基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。168.根據(jù)權(quán)利要求167所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。169.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中通過(guò)失效proC基因來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。170.根據(jù)權(quán)利要求169所述的方法，其中該失效的proC基因包含選自的SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸序列。171.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中通過(guò)使pyrF和proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。172.根據(jù)權(quán)利要求171所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，以及該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。173.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該細(xì)胞還包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子一部分的染色體lacI插入片段。174.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中該lac基因選自lacI，lacIQ或lacIQI。175.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種lacOid序列。176.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含多于一種的lac操縱基因序列。177.根據(jù)權(quán)利要求176所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的5’端，以及至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的3’端。178.根據(jù)權(quán)利要求177所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。179.缺少抗生素條件下生產(chǎn)重組多肽的方法，其中交叉?zhèn)鬟f抑制在選擇過(guò)程中被最小化，包括a.選擇假單胞菌細(xì)胞，其中對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來(lái)引起對(duì)至少一種代謝物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因此產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞；b.將核酸構(gòu)建體引入該細(xì)胞中，該構(gòu)建體包括i.編碼重組多肽的核酸；和ii.編碼可以將該營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞回復(fù)成原養(yǎng)型的多肽的核酸；c.在該細(xì)胞中表達(dá)重組多肽和原養(yǎng)型回復(fù)多肽；和d.使該細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)缺陷型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。180.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該假單胞菌是熒光假單胞菌。181.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該細(xì)胞對(duì)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷。182.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該細(xì)胞對(duì)脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。183.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該細(xì)胞對(duì)多于一種的代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷。184.根據(jù)權(quán)利要求183所述的方法，其中該細(xì)胞對(duì)尿嘧啶和脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。185.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該原養(yǎng)型回復(fù)蛋白是細(xì)胞存活所需代謝物生物合成中活性的酶。186.根據(jù)權(quán)利要求185所述的方法，其中該酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶。187.根據(jù)權(quán)利要求186所述的方法，其中該酶通過(guò)選自SEQ.ID.1或3的核酸來(lái)編碼。188.根據(jù)權(quán)利要求185所述的方法，其中該酶包含SEQIDNo.2的氨基酸序列。189.根據(jù)權(quán)利要求185所述的方法，其中該酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物還原酶。190.根據(jù)權(quán)利要求189所述的方法，其中該酶通過(guò)選自SEQ.ID.NO.6或8的核酸序列來(lái)編碼。191.根據(jù)權(quán)利要求189所述的方法，其中該酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。192.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中通過(guò)使pyrF基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞型。193.根據(jù)權(quán)利要求192所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。194.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中通過(guò)使proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)胞型。195.根據(jù)權(quán)利要求194所述的方法，其中該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸。196.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中通過(guò)使pyrF基因和proC基因失效來(lái)產(chǎn)生該營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。197.根據(jù)權(quán)利要求196所述的方法，其中該失效的pyrF基因包含選自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，和該失效的proC基因包含選自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。198.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該細(xì)胞還包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操縱子一部分的染色體lacI插入片段。199.根據(jù)權(quán)利要求198所述的方法，其中該lacI基因選自lacI，lacIQ或lacIQI。200.根據(jù)權(quán)利要求199所述的方法，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種lacOid序列。201.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含多于一種的lac操縱基因序列。202.根據(jù)權(quán)利要求201所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的5’端，以及至少一種lac操縱基因序列位于啟動(dòng)子的3’端。203.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中至少一種lac操縱基因序列是lacOid序列。204.熒光假單胞菌pyrF基因，或與pyrF基因雜交的核酸，包含選自SEQ.ID.No.1或3的核酸序列。205.根據(jù)權(quán)利要求204所述的基因，其中該核酸包括SEQ.ID.No.1的序列。206.根據(jù)權(quán)利要求204所述的基因，其中該核酸包含SEQ.ID.No.3的序列。207.熒光假單胞菌proC基因，或與proC基因雜交的核酸，包括選自SEQ.ID.No.6或8的核酸序列。208.根據(jù)權(quán)利要求207所述的基因，其中該核酸包含SEQIDNo.6的序列。209.根據(jù)權(quán)利要求207所述的基因，其中該核酸包含SEQIDNo.8的序列。210.核酸構(gòu)建體，包括a.編碼重組多肽的核酸；和b.編碼從熒光假單胞菌分離的pyrF基因的核酸。211.根據(jù)權(quán)利要求210所述的構(gòu)建體，其中該pyrF基因包含SEQ.IDNo.1的核酸序列。212.根據(jù)權(quán)利要求210所述的構(gòu)建體，其中該pyrF基因包含SEQ.IDNo.3的核酸序列。213.核酸構(gòu)建體，包括a.編碼重組多肽的核酸；和b.編碼從熒光假單胞菌分離的proC基因的核酸。214.根據(jù)權(quán)利要求213所述的構(gòu)建體，其中該proC基因包含SEQ.IDNo.6的核酸序列。215.根據(jù)權(quán)利要求213所述的構(gòu)建體，其中該proC基因包含SEQ.IDNo.8的核酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的改良表達(dá)系統(tǒng)來(lái)用于重組多肽的生產(chǎn)。此外，本發(fā)明通過(guò)提高的表達(dá)調(diào)控提供了在宿主細(xì)胞中提高的重組蛋白生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N15/78GK1906294SQ200480040702公開(kāi)日2007年1月31日申請(qǐng)日期2004年11月19日優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日發(fā)明者J·C·施奈德,L·C·丘,A·K·巴杰利,T·M·拉姆塞耶爾申請(qǐng)人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司