專利名稱：中性蛋白酶npr表達和純化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及蛋白質的表達和純化領域。
背景技術：
HbAlc監(jiān)測是糖尿病療判定和調整治療方案的“金標準”，而目前市場上常見的廣泛應用于生化分析儀的酶法測定HbAlc的試劑盒得到了大量客戶的認可。中性蛋白酶 (NPR)作為測定HbAlc試劑盒中最重要的酶之一，其來源困難，價格昂貴，利用基因工程的手段將其進行表達，有著廣泛的應用前景和良好的市場價值。嗜熱芽孢桿菌的NPR主要的表達方式有兩種，一是利用枯草芽孢桿菌將其進行表達，二是利用NPR自身的啟動子使得其在大腸桿菌進行表達。目前有的關于中性蛋白酶NPR(Therm0Iysin)的表達，幾乎都是利用桿菌自身發(fā)酵表達后再進行純化，或者是利用枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)來進行表達，純度可以達到很高的純度，至少95%以上。大腸桿菌表達系統(tǒng)由于其研究背景成熟、操作簡單而且成本低，是表達外源基因的首選表達系統(tǒng)。但是，目前的研究表明桿菌的蛋白酶基因卻無法在大腸桿菌中進行表達。究其原因，目前說法最多是中性蛋白酶基因對大腸桿菌有致死作用或是因為大腸桿菌不能轉錄枯草桿菌的促使生長調節(jié)基因。目前，已有利用利用PUC19載體、JM109菌株在大腸桿菌表達NPR蛋白的報道。根據(jù)已有的文獻報道，兩種方式表達NPR蛋白表達量低，最主要的是其純化方面要先后用到疏水層析和親和層析，工藝復雜而且會降低收率， 限制了它的實用性。Kuniyo Inouye 等人(Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli， and its purification and enzymatic characterization, Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255)描述了一種利用中性蛋白酶自身的啟動子在大腸桿菌表達其基因序列的方法。然而，上述方法較難獲得理想表達，并且獲得的蛋白純度較低(90%左右)。因此，需要對中性蛋白酶WR在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達的方法進行研究以找到能提高NPR表達量和簡化其純化工藝的方法。

發(fā)明內容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對pET系列的載體進行修飾(去除pET系列的T7啟動子)并表達中性蛋白酶的全長基因(而非開放閱讀框)可獲得良好的表達效果。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)1、在選擇基因片段時，首選WR基因的全長基因，而非開放閱讀框 (ORF)，從而在以后的表達中用到該基因自身的啟動子；2、將NPR的全長基因克隆到常見的 pET28b表達載體上，但除去pET28b載體上的T7啟動子基因；3、將構建的重組表達載體轉化Rosetta(DEIB)表達菌株，增強含有稀有密碼子基因的表達；4、保留pET28b多克隆位點 3’端His標簽，以利于表達的蛋白通過親和鎳柱實現(xiàn)純化。因此，本發(fā)明一方面提供一種中性蛋白酶的表達方法，該方法包括
a)通過中性蛋白酶的全長基因與去除T7啟動子活性的PET載體構建重組表達質粒，以及b)通過步驟a)構建的重組表達質粒轉化大腸桿菌，從而表達中性蛋白酶。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的全長基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的pET載體為pET28b。優(yōu)選地，構建重組表達質粒時保留pET載體3’端的His標簽，去掉NPR基因的終止密碼子。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的大腸桿菌為Rosetta(DE3)菌株。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選通過BglII和B10I酶切位點構建重組表達質粒。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括對表達的中性蛋白酶進行純化的步驟。優(yōu)選地，通過親和鎳柱對表達的中性蛋白酶進行純化。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法獲得的中性蛋白酶純度在95%以上。本發(fā)明的方法可以廣泛用于各個分子實驗室進行表達，大大提高了蛋白的表達量及大大減少了 NPR的純化工藝，達到表達量高、純化簡單的效果。


圖1 :pUC19-NPR 轉 JM109 后的表達情況，1 :pUC19_NPR 轉 JM109 后上清；2 PUC19-NPR 轉 JM109 后沉淀；3 :pUC19 轉 JM109 后上清；4 :pUC19 轉 JM109 后沉淀；M 蛋白標記。圖2 :pET28b-NPR 轉 JM109 后的表達情況，1、2 :pET28b_NPR轉 JM109 后的上清；M
蛋白標記。圖3 :pET28b-NPR轉Rosetta(DEIB)后的表達情況及其純化情況，M 蛋白標記；1 TCA濃縮后LB上清；2 =Ni柱純化后穿透液；3 =Ni柱純化后El ；4、Ni柱純化后E2。圖 4 :pET28b-NPR 分別轉 JM109 和 Rosetta(DE3)的比較，Μ:蛋白標記；1、2、3、4 分別為pET28b-NPR分別轉JM109后LB上清、過Ni柱后的穿透液、過Ni柱后的E1組分、過Ni 柱后的E2組分；5、6、7、8分別為pET28b-NPR分別轉Rosetta(DE3)后的LB上清、過Ni柱后的穿透液、過Ni柱后的El組分、過Ni柱后的E2組分。圖5 =NPR的Wfestern Blot鑒定，M 蛋白標記；1 =NPR經Ni柱純化之后，濃縮前的 E2，組分；2 =NPR經Ni柱純化之后，濃縮前的E2組分；3 =NPR經Ni柱純化之后，濃縮后的 E2組分；4 =TCA濃縮后含NPR的LB上清；5 =NPR經Ni柱純化之后，Ni柱純化后濃縮后E2， 組分；6 =NPR經Ni柱純化之后，濃縮后的E2組分。圖6 :pET22b-npr/BL21重組蛋白表達，1 空白對照；2 蛋白表達產物；M 蛋白質標記；引用自張敏，趙叢，路福平，趙洪坤，杜連祥.中性蛋白酶基因在大腸桿菌中誘導表達條件的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)2007年第33卷第10期(總第238期):31 34。圖7 =NprT純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，M 分子量標記；1 純化NprT ；引用自張敏，趙叢，杜連祥，路福平，高晨.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的表達、純化及其酶學性質的研究.中國科學C輯生命科學2008年第38卷第2期 166 172。
圖8 嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(嗜熱菌蛋白酶)的全基因序列，黑色框內編碼成熟肽。圖9 :中性蛋白酶的成熟肽序列。
具體實施例方式發(fā)明人對利用大腸桿菌表達中性蛋白酶進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)利用多種pET系列的載體(如pET28a)表達中性蛋白酶的開放閱讀框部分，較難得到目的蛋白的表達。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)對PET系列的載體進行修飾(去除pET系列的T7啟動子)并表達中性蛋白酶的全長基因可獲得良好的表達效果。在表達時，還可利用pET28b載體上的C端的His標簽表達中性蛋白酶基因的全長序列。在本發(fā)明中，可以在Rosetta(DEIB)中表達中性蛋白酶基因的全長序列。因此，在設計本發(fā)明時需要考慮1)合適地將含NPR自身的啟動子的全長基因克隆到pET28b上，并且除去pET28b 自身帶有的T7啟動子；2)重新構建的表達載體轉化Rosetta (DE3)后實現(xiàn)分泌表達；3)在LB中分泌著的NI3R蛋白，一般至少都要有500_1000ml的上清，由于上樣量太大，在用AKTA進行純化時，會造成后續(xù)各收集峰樣品的濃度太低而不容易通過SDS-PAGE檢測。在此基礎上，對本發(fā)明的設計如下首先同時參考NPR基因和載體pET28b的酶切位點圖譜，選取BglII和BioI酶切位點，通過克隆手段構建重組質粒pET2m3-NPR ；然后將pET2m3-NPR轉化Rosetta (DE3)表達菌株，挑選單克隆在LB培養(yǎng)基、37°C培養(yǎng)M小時；最后經過離心，收集上清、膜包超濾濃縮后用于蛋白的純化及后續(xù)的監(jiān)測工作。實施例1 構建重組質粒pET28b_NPR1)設計特異性引物，PCR擴增全長基因綜合分析NPR的酶切圖譜和pET28b載體(Novagen)的多克隆位點(MCS)的序列特征，再設計引物時，上下游分別引入BglII和BioI酶切位點，在如下反應條件進行WR的 PCR擴增，得到了約2000bp的片段，符合理論上片段的大小，可以用于基因的克隆。上游引物GAGATCTAAGCTTTTATTAGGAAT下游引物GCTCGAG TTTCACCCCTAC在做PCR反應時，用的酶為高保真性的DNA聚合酶；引物終濃度都為0. 5uM ；模板為化學合成的NPR全基因序列。94°C、5min，1 個循環(huán)；94°C、20s，54°C、20S，72°C、lmin，35 循環(huán)；72°C、10min，1 個循環(huán)。2) NPR片段和pET28b的雙酶切及連接選取合適BglII和BioI的共用的緩沖液，在37°C下，各自充分酶切Iug的pET28b 和至少3ug純化的NPR片段，通過膠回收試劑盒回收后，在T4DNA連接酶的作用下實現(xiàn)連接。3)轉化克隆菌株和陽性克隆的篩選及測序
連接后的產物轉化DH5 α細胞，提取質粒，用BglII和B10I進行雙酶切鑒定，篩選陽性克隆后用于測序，上游測序引物自帶，對測序結果進行分析，確保沒有基因的突變和移碼等。實施例2 融合蛋白的表達1)轉化Rosetta (DE3)表達菌株(Novagen)并進行表達將經過測序結果分析正確的重組質粒pET28b_NPR轉化Rosetta (DE3)表達菌株， 挑去單菌落，經過小量培養(yǎng)后，按1 %的接種量轉接到500mL的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)、表達， 24小時后取出，離心機離心后收集保存上清。2)表達蛋白的SDS-PAGE檢測上清用SDS-PAGE檢測，可看到微弱的條帶，這是由于LB上清體積太大，導致樣品中蛋白濃度太低；用TCA沉淀的方法濃縮樣品中的蛋白，再用SDS-PAGE檢測，可看到明顯的有蛋白條帶。實施例3 =NPR蛋白的純化及鑒定1)NPR的親和鎳柱純化由于當初在構建重組質粒時，發(fā)明人保留了 pET28b載體MCS的3’端的His標簽并直接接在NPR的后面進行表達，所以表達的WR可以直接利用其3’端的His標簽通過親和鎳柱來對其進行純化。純化時，用低濃度OOmM)咪唑平衡鎳柱及系統(tǒng)、用一定百分比的高濃度(500mM)咪唑來進行洗脫，收集穿透液以及各個洗脫峰。2)純化后個收集峰的SDS-PAGE檢測收集的各峰，部分經過TCA沉淀后，用SDS-PAGE檢測，在洗脫峰可以看到明顯的、 單一的表達條帶，約40KDa，比理論上(37KDa)的稍大。3)表達蛋白的Wfestern Blot鑒定用Wfestern Blot對純化的NPR蛋白進行鑒定。由于NPR蛋白在理論上3，端是帶有His標簽的，所以選取的一抗為鼠抗His tag的單克隆抗體，二抗為HPR偶聯(lián)的羊抗鼠抗體，選取DAB為底物進行顯色，顯色后結果表明得到了 1條特異的、40KDa大小的條帶(圖 5)，這充分證明表達的蛋白應為WR蛋白。圖5第4泳道在LB上清中可以通過印跡得到很單一的條帶，也充分證明了 LB中的確已經含有NI3R蛋白。實施例4 與其他幾種表達方式的對比1.完全按照文獻 艮道(Kuniyo Inouye,Masashi Minoda,Teisuke Takita,Haruko Sakurama, Yasuhiko Hashida, Masayuki Kusano, Kiyoshi Yasukawa. Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and enzymatic characterization.Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255)，構建了重組質粒 pUC19_NPR，將其轉化 JM109 細胞，并在 37°C經過M小時的培養(yǎng)，SDS-PAGE檢測表達LB上清中的NPR蛋白。2.模仿上述文獻做法，將發(fā)明人自己構建的重組質粒pET28b_Nra也轉化JM109細胞，在37°C經過M小時的培養(yǎng)，SDS-PAGE檢測表達LB上清中的NPR蛋白。3.按照本發(fā)明提出方法，用重組質粒pET2 -Nra轉化ROSetta(DE；3)，在37°C經過 24小時的培養(yǎng)，SDS-PAGE檢測表達LB上清中的NPR蛋白。SDS-PAGE檢測結果表明，pUC19_NPR轉JM109后LB上清幾乎檢測不到蛋白，而
6且即使是沉淀，與PUC19空載體轉化JM109后的陰性對照相比，也沒有特異的表達條帶 (圖1) ；pET28b-NPR轉JM109 (圖2)后上清中都可以看到微弱的蛋白條帶，pET28b_NPR 轉R0Setta(DE3)后的LB上清濃縮后可以看到很明顯的條帶，純度在95%以上(圖3)； pET28b-NPR分別轉JM109和Rosetta(DEIB)后純化后得產物經過相同倍數(shù)的濃縮后，會發(fā)現(xiàn)pET28b-NPR轉Rosetta(DEIB)的表達產物的條帶明顯強于pET28b_NPR轉JM109后的表達產物的條帶(圖4)。目前，關于嗜熱菌中性蛋白酶的表達主要有4種，依據(jù)其應用的廣泛程度，結合本發(fā)明專利的表達蛋白質的方法共5種表達方式的主要的優(yōu)缺點分別總結在下表中。
現(xiàn)有技術的表達方式本發(fā)明表1.利用嗜熱2.利用 pHP133.利用pET4.利用中性5.利用中性蛋白達芽孢桿菌進經過改造后系列的T7啟蛋白酶自身酶自身的啟動方行自身發(fā)酵的載體來表動子在大腸的啟動子和子、去除利用pET式表達達在枯草芽桿菌 BL21PUC19載體系列的T7啟動子的孢桿菌菌株(DE3)中表達在大腸桿菌而利用pET28b簡DB104中表枯草芽孢桿JM109中表載體上的C端的單達嗜熱脂肪菌中性蛋白達嗜熱菌中His標簽，并且是說芽孢桿菌的酶的的全長性蛋白酶全在 Rosetta (DE3)明中性蛋白酶編碼序列的長基因中進行表達的CDSCDS說pHB13PSNpET22b-NPRpUC19-NPRpET28b-NPR(全明(CDS)(全長基因)長基因)優(yōu)直接選取嗜能夠非常容細胞破碎后在LB上清在LB上清中得占熱芽孢桿菌易地得到外可利用Ni柱中得到NPR到NPR的表達，進行發(fā)酵，源表達的中進行純化的表達而且可以直接利取材方便性蛋白酶用Ni柱進行純化缺發(fā)酵表達后細菌培養(yǎng)周超聲破碎時純化目的蛋唯一繁瑣的就是占的蛋白成分期長，純化相容易產生熱白需要經過LB上清培養(yǎng)液的非常復雜，對較為繁瑣，量，造成目的多步純化，濃縮純化中性蛋多步純化，勢蛋白的碳化，勢必造成目白酶比較繁必造成目的滲透破碎過的蛋白的損瑣，而且得蛋白的損失程稍微繁瑣失率很低結圖7圖6圖3果參考文獻1參考文獻2
參考文獻1 張敏，趙叢，杜連祥，路福平，高晨.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的表達、純化及其酶學性質的研究.中國科學C輯生命科學2008年第38卷第2期166 172。參考文獻2 張敏，趙叢，路福平，趙洪坤，杜連祥.中性蛋白酶基因在大腸桿菌中誘導表達條件的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)2007年第33卷第10期(總第238期):31 34。因此，本發(fā)明利用去除T7啟動子的pET系列載體在大腸桿菌中表達WR蛋白，其表達量明顯高于傳統(tǒng)方法表達的WR蛋白；所獲得蛋白的純度可達到95%以上。以上實施例是對本發(fā)明的說明和進一步解釋，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的精神和權利保護范圍內所做的任何修改，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種中性蛋白酶的表達方法，該方法包括a)通過中性蛋白酶的全長基因與去除T7啟動子活性的pET載體構建重組表達質粒，以及b)通過步驟a)構建的重組表達質粒轉化大腸桿菌，從而表達中性蛋白酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的中性蛋白酶的表達方法，其中所述的全長基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的中性蛋白酶的表達方法，其中所述的中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的中性蛋白酶的表達方法，其中所述的pET載體為pET28b。
5.根據(jù)權利要求1所述的中性蛋白酶的表達方法，其中構建重組表達質粒時保留PET 載體3’端的His標簽，去掉NPR基因的終止密碼子。
6.根據(jù)權利要求1所述的中性蛋白酶的表達方法，其中所述的大腸桿菌為 Rosetta(DE3)菌株。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的中性蛋白酶的表達方法，其中在步驟a)中通過 BglII和BioI酶切位點構建重組表達質粒。
8.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的中性蛋白酶的表達方法，還包括對表達的中性蛋白酶進行純化的步驟。
9.根據(jù)權利要求8所述的中性蛋白酶的表達方法，其中通過親和鎳柱對表達的中性蛋白酶進行純化。
10.根據(jù)權利要求9所述的中性蛋白酶的表達方法，其中所述的中性蛋白酶純度在 95%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及中性蛋白酶NPR表達和純化的方法。研究發(fā)現(xiàn)對pET系列的載體進行修飾并表達中性蛋白酶的全長基因可獲得良好的表達效果。因此，本發(fā)明提供一種中性蛋白酶的表達方法，包括a)通過中性蛋白酶的全長基因與去除T7啟動子活性的pET載體構建重組表達質粒，以及b)通過步驟a)構建的重組表達質粒轉化大腸桿菌，從而表達中性蛋白酶。本發(fā)明的方法可以方便、簡單地得到純的NPR蛋白，簡化了NPR的純化過程。
文檔編號C12N15/09GK102168078SQ20101060997
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權日2010年12月28日
發(fā)明者劉希, 賈如, 龔俊 申請人:北京九強生物技術股份有限公司