專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白質(zhì)的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域。特別是，涉及應(yīng)用固定的金屬親合層析技術(shù)純化補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的背景技術(shù)以往，純化蛋白質(zhì)的方法是由這種欲純化蛋白質(zhì)與廢棄蛋白質(zhì)雜質(zhì)分子的大小、電荷和溶解性這些性能的不同所決定的。基于這些參數(shù)的方法包括分子排阻層析法、離子交換層析法和差示沉淀法等。
分子排阻層析法，也可以稱(chēng)做凝膠過(guò)濾層析法或凝膠滲透層析法，它的機(jī)理是流動(dòng)相中的大分子滲透到固定相顆粒的孔隙中。滲透差是顆粒的流體動(dòng)力學(xué)體積的函數(shù)。因而，在理想的條件下，當(dāng)小分子進(jìn)入到顆粒體內(nèi)時(shí)大分子被排阻到顆粒外部。洗脫容積與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，所以可以根據(jù)蛋白質(zhì)的大小確定洗脫順序。分子排阻層析法的支持劑主要為交聯(lián)葡聚糖如SEPHADEX，珠狀瓊脂糖顆粒如SEPHAROSE(二者均可在瑞典Pharmacia AB.Uppsala買(mǎi)到)，交聯(lián)聚丙烯酰胺如BIOGEL(可從加利弗尼亞，Richmond，BioRad藥廠買(mǎi)到)，或乙二醇異丁烯酸共聚物如TOYOPEARL HW65S(可從日本東京ToyoSoda買(mǎi)到)。它們都可用于本發(fā)明的實(shí)施。
沉淀方法取決于在蛋白質(zhì)粗混合物中各個(gè)蛋白質(zhì)的溶解性可能存在的極大的不同。盡管蛋白質(zhì)在水介質(zhì)中的溶解性受多種因素影響，但為討論起見(jiàn)，通常認(rèn)為如果蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用強(qiáng)于與相同的或類(lèi)似的蛋白質(zhì)分子間的相互作用則這種蛋白質(zhì)為可溶性的。不局限于任何描述沉淀現(xiàn)象的特殊機(jī)制學(xué)說(shuō)，有人認(rèn)為蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用是通過(guò)氫與幾種無(wú)電荷基團(tuán)結(jié)合以及氫與帶電荷基團(tuán)靜電結(jié)合為偶極而產(chǎn)生的，沉淀物如單價(jià)陽(yáng)離子的鹽(如硫酸銨)與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，因此，在高鹽濃度下蛋白質(zhì)“脫水”，與水之間的相互作用減弱，與相似蛋白質(zhì)的聚集增加，導(dǎo)致從介質(zhì)中沉淀出來(lái)。
離子交換層析法涉及樣品中的帶電官能團(tuán)與帶相反電荷的離子官能團(tuán)在吸附表面的相互作用。已知有兩種普通類(lèi)型的相互作用。陰離子交換層析法是通過(guò)帶負(fù)電荷的氨基酸支鏈(如天冬氨酸和谷氨酸)與帶正電荷的吸附表面產(chǎn)生相互作用而完成的，陽(yáng)離子交換層析法是通過(guò)帶正電荷的氨基酸殘基(如賴(lài)氨酸和精氨酸)與帶負(fù)電荷的吸附表面產(chǎn)生相互作用而完成的。
最近開(kāi)發(fā)的親合層析技術(shù)和疏水性相互作用層析技術(shù)進(jìn)一步補(bǔ)充了較為傳統(tǒng)的分子排阻層析法和離子交換層析法。親合層析的依據(jù)為蛋白質(zhì)與一種固定配體間的相互作用。在這種配體為一種底物，底物類(lèi)似物，抑制劑或抗體的情況下，它對(duì)于特殊蛋白質(zhì)能是特異的。另一方面，這種配體還可以與大量的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。象一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、煙堿腺嘌呤二核苷酸或某種染料的常用配體均可用于回收一種特殊類(lèi)型的蛋白質(zhì)。這種親和層析法中至少的生物特異性之一是固定的金屬親合層析技術(shù)(IMAC)也可以稱(chēng)作金屬螯合層析法。Porath et al.，(Nature 258598-99(1975)中介紹的IMAC涉及將一種金屬與一種固體支持劑螯合，然后與欲分離蛋白質(zhì)表面的電子供體氨基酸殘基形成一種復(fù)合物。
疏水性相互作用層析法的首次開(kāi)發(fā)源于一種觀察即蛋白質(zhì)可在包含有碳?xì)浠衔镞B接臂(spacer arm)但不含有親合配體的親合凝膠上保留。盡管在本領(lǐng)域中有時(shí)使用疏水性層析法的名稱(chēng)，但較好的名稱(chēng)為疏水性相互作用層析法(HIC)，因?yàn)檫@種溶液與凝膠之間的相互作用是疏水性過(guò)程而不是色譜分析過(guò)程。在高離子強(qiáng)度下疏水性相互作用非常強(qiáng)，因此，在鹽沉淀或離子交換之后很容易完成這種形式的分離。通過(guò)改變?nèi)軇?、pH值、離子強(qiáng)度或者通過(guò)加入高離液序列或有機(jī)調(diào)節(jié)劑如乙二醇能夠?qū)崿F(xiàn)從HIC支持劑上的洗脫。有關(guān)疏水性相互作用層析法的基本原理的描述可以在美國(guó)專(zhuān)利3,917,527和美國(guó)專(zhuān)利4,000,098中看到。下列的公開(kāi)的參考文獻(xiàn)中舉例說(shuō)明了HIC在純化特異性蛋白質(zhì)中的應(yīng)用人的生長(zhǎng)激素(美國(guó)專(zhuān)利4,332,717)，毒素共軛物(美國(guó)專(zhuān)利4,771,128)，抗溶血因子(美國(guó)專(zhuān)利4,743,680)，瘤壞死性因子(美國(guó)專(zhuān)利4,894,439)，白細(xì)胞介素-2(美國(guó)專(zhuān)利4,908,434)，人的淋巴毒素(美國(guó)專(zhuān)利4,920,196)和溶菌酶種類(lèi)(Fausnaugh，J.L.和F.E.Regnier，J.Chromatog.359131-146(1986)。
本發(fā)明是將離子交換法，IMAC，HIC和分子排阻層析法結(jié)合起來(lái)用于補(bǔ)體受體分子和補(bǔ)體受體相似分子的純化。本發(fā)明的簡(jiǎn)單描述本發(fā)明涉及一種從含有一種補(bǔ)體受體蛋白的混合物中純化這種補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括把該混合物依次與一種陽(yáng)離子層析支持劑、金屬親合層析支持劑、分子排阻層析支持劑相接觸并且選擇性地從每一種支持劑中洗脫出這種蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供了從含有一種補(bǔ)體受體蛋白的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化這種補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括對(duì)這種培養(yǎng)基進(jìn)行依次處理(a)最初的陽(yáng)離子交換層析，(b)固定的金屬親合層析，(c)疏水性相互作用層析，(d)陰離子交換層析，以及(e)排阻層析。
另一方面，本發(fā)明提供了從細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化一種補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括(a)濃縮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；(b)把補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)吸附在一種陽(yáng)離子層析支持劑上；(c)用至少一種緩沖液沖洗吸附后的蛋白質(zhì)；(d)在一種固定的金屬親合層析支持劑上洗脫沖洗過(guò)的蛋白質(zhì)；(e)吸附從(d)步驟中洗脫的蛋白質(zhì)；(f)用至少一種緩沖液沖洗吸附的蛋白質(zhì)；(g)洗脫沖洗過(guò)的蛋白質(zhì)；(h)在一種疏水性相互作用層析支持劑上吸附從步驟(g)中洗脫過(guò)的蛋白質(zhì)；(i)選擇性地洗脫這種蛋白質(zhì)；(j)在一種陰離子交換支持劑上吸附從步驟(h)中洗脫的蛋白質(zhì)；(k)洗脫吸附的蛋白質(zhì)；(l)對(duì)步驟(k)中的洗脫物進(jìn)行分子排阻層析；(m)由此回收這種蛋白質(zhì)。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的純化技術(shù)，這種技術(shù)可應(yīng)用于補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化。因?yàn)樗梢垣@得蛋白質(zhì)純度＞95％的受體蛋白質(zhì)，所以特別有用。本發(fā)明還可以用于大量補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)及補(bǔ)體受體類(lèi)似物蛋白質(zhì)的純化。
補(bǔ)體是一組血清蛋白，可被有限蛋白水解依次激活，是人體免疫的重要因子。補(bǔ)體的活性是由早期活性補(bǔ)體成分與抗原/抗體復(fù)合物相互作用而產(chǎn)生的。激活后的蛋白水解片段單獨(dú)或與其它蛋白一起激活其它的補(bǔ)體成分，引起一種蛋白水解的連鎖反應(yīng)，此反應(yīng)過(guò)程與凝血因子的活動(dòng)相似。或者，通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁成分，蛋白水解酶(如血纖維蛋白溶酶)或復(fù)合碳水化合物(如旋復(fù)花粉)激活補(bǔ)體。補(bǔ)體系統(tǒng)的成分能夠調(diào)節(jié)許多生物活性作用(如免疫胞溶，過(guò)敏毒素的產(chǎn)生，溶菌作用，趨化作用，溶血作用，調(diào)理作用和吞噬作用)。
CR1-CR4為已知的四型補(bǔ)體受體(CR)。補(bǔ)體受體1(CR1)是補(bǔ)體成分C3b和C4b的受體，補(bǔ)體受體2(CR2)是補(bǔ)體成分C3dg或C3d的受體，補(bǔ)體受體3(CR3)是補(bǔ)體成分C3bi的受體，補(bǔ)體受體4(CR4)是補(bǔ)體成分C3dg的受體。
1型補(bǔ)體受體(CR1)存在于紅細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、某些T細(xì)胞、脾濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞以及腎小球內(nèi)的足狀突細(xì)胞的細(xì)胞膜上。CR1連接C3b和C4b并稱(chēng)之為C3b/C4b受體。它的初級(jí)序列已經(jīng)確定(Klickstein et al.，J.Exp.Med.1651095-1122(1987)，Klickstein et al.J.Exp.Med.1681699-1717(1988)，Hourcade et al.J.Exp.Med.1681255-1270(1988)。它是由30個(gè)含60-70個(gè)氨基酸的短concensus repeats(SCR)組成，其中保存有29個(gè)SCR，每個(gè)SCR平均含有65個(gè)氨基酸。有人認(rèn)為每個(gè)SCR通過(guò)二硫鍵形成一個(gè)三元三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是以二硫鍵把第三和第一和第四和第二個(gè)半胱氨酸連接形成的。這些SCRs進(jìn)一步組成4個(gè)長(zhǎng)類(lèi)似復(fù)制(homologous repeats)(LHR)，每個(gè)LHR由7個(gè)SCRs組成在頂枝序列之后，該分子由含有一個(gè)C4b連接區(qū)的多個(gè)N端的LHR-A，接著是兩個(gè)重復(fù)片段，含有3b連接區(qū)的LHR-B和LHR-C以及多個(gè)C端的LHR-D組成，隨后有2個(gè)附加的SCRs，一個(gè)是含有25個(gè)殘基的公認(rèn)轉(zhuǎn)換膜區(qū)域和一個(gè)43個(gè)殘基的細(xì)胞漿末端。
CR1是具有SCR同系現(xiàn)象總族中的一員。這個(gè)總族包括具有一種C3/C4結(jié)合功能的成員，如CR2，C4bp，H因子，B因子和C2，還包括沒(méi)有此功能的蛋白質(zhì)，如白介素-2受體，b2-糖蛋白I，Clr，結(jié)合珠蛋白的一條鏈以及XIIIb因子。
CR1已知為一種糖蛋白，推測(cè)其氨基酸序列具有24個(gè)位點(diǎn)，此位點(diǎn)用來(lái)結(jié)合胞外區(qū)域的N-聯(lián)寡糖。但是，衣霉素條件下的CR1合成(Lublin et al.J.Biol.Chem.2615736(1986))和氨基葡糖內(nèi)容物的分析(Sim，Biochem J.232883(1985))推測(cè)實(shí)際只有6-8個(gè)位點(diǎn)用于聯(lián)接寡糖。糖蛋白的N-端似乎被封閉。
CR1存在四種不同的同種異型，其區(qū)別在于大小按30-50kD增加。在人群中這些同種異型的基因頻率不同(Holter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842459-2463(1987))。F(或A)型同種異型由4個(gè)LHR組成，其大小約為250kD；較大的S(或B)型同種異型含有第5個(gè)LHR，它是一個(gè)LHR-B5′端的一半和LHR-A3′端的一半的嵌合體，可推測(cè)出它有一個(gè)C3b的第三結(jié)合位點(diǎn)(Wong et al.J.Exp.Med.169847(1989))，其大小約為290kD。最小的F′(或C)型同種異型在全身性紅斑狼瘡(SLE)病人中發(fā)生率較高(Van Dyne et al.，Clin.Exp.Immunol.68570(1987)和Dykman et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 801698(1983))，這很可能是由LHR-B和一個(gè)C3b結(jié)合位點(diǎn)的缺失所引起的。
在正常人和具有SLE的某些病人的血漿中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種天然可溶型CR1(Yoon & Fearon J.Immunol.1343332-3338(1985))。在結(jié)構(gòu)和功能上它們的特征與那些紅細(xì)胞(細(xì)胞表面)的CR1的都很相似。
Hourcade等(J.Exp.Med.1681255-1270(1988)還在人的CR1轉(zhuǎn)錄單位上觀察到一個(gè)可替代的多腺苷?；稽c(diǎn)，可推測(cè)出這個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可產(chǎn)生一種分泌型CR1。這個(gè)截?cái)嘈蛄兴a(chǎn)生的mRNA包括第一位的8.5個(gè)SCR；如C4b結(jié)合區(qū)，并能夠編碼一種約80kD的蛋白質(zhì)。當(dāng)把一個(gè)與此截?cái)嘈蛄邢鄳?yīng)的cDNA轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞并且表達(dá)時(shí)，表現(xiàn)出所期望的C4b結(jié)合活性，而非C3b結(jié)合活性(Kyrch et al.F.A.S.E.B.J.3A368(1989)。Krych等還觀察到一種與幾種人體細(xì)胞系中推測(cè)的相似的mRNA，并推斷在人體中能合成這種能夠結(jié)合C4b的可溶型CR1截?cái)嘈蛄小?br> 借助重組DNA的方法從被表達(dá)出的DNAs中刪除轉(zhuǎn)換膜區(qū)域也可以產(chǎn)生一些可溶性CR1片段(Fearon等國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 89/09220，1989年10月5日公開(kāi)以及Fearon等的國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 91/05047，1991年4月18日公開(kāi))。這些可溶性CR1片段具有活性功能，它們能夠結(jié)合C3b和/或C4b，并表現(xiàn)出I因子輔助因子的活性，這些活性依它們所包含的區(qū)域而定。另外它們能夠作為CR1的功能如中性粒細(xì)胞氧化破裂，補(bǔ)體介導(dǎo)溶血以及C3a和C5a的產(chǎn)生的體外抑制劑。一種由質(zhì)粒sCR1/pBSCR1c編碼的可溶性CR1結(jié)構(gòu)還在體內(nèi)的反向被動(dòng)阿圖斯反應(yīng)中表現(xiàn)出活性(Feuron et al.1989 & 1991以及Yeh etal.J.Immunol(1991))，并且能抑制分泌物潴留后的心肌炎癥和壞死(Fearon et al.1989 & 1990以及Weisman et al.，Science 249146-151(1990))。再者，SCR1/pBSCR1c產(chǎn)物與對(duì)甲氧苯?；娜死w維蛋白溶酶原-鏈激酶-激活性復(fù)合物(APSAC)的共同制劑具有與單獨(dú)的APSAC相似的抗溶血活性，這表明將這種補(bǔ)體抑制劑SCR與一種溶栓劑組合是一種有用的聯(lián)合治療(Fearon等，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 91/0504
公開(kāi)日1991，4，18)。
補(bǔ)體受體類(lèi)似蛋白質(zhì)是指可以用本文所描述的方法可純化的蛋白質(zhì)，如果需要該方法可以通過(guò)常規(guī)的非發(fā)明性的調(diào)整進(jìn)行改良，并不需要做太多的實(shí)驗(yàn)。這類(lèi)蛋白質(zhì)包括多個(gè)CR的同種異型和等位基因，截?cái)囝?lèi)型，化學(xué)修飾類(lèi)型如經(jīng)過(guò)PEG處理的以及含有一個(gè)CR部分的核聚變蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)稱(chēng)為補(bǔ)體受體類(lèi)似物，因?yàn)樗鼈兙哂谢虮Ａ袅薈R蛋白質(zhì)的特性，足可以用本發(fā)明的方法純化。除非有特殊限定，補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)術(shù)語(yǔ)還包括補(bǔ)體受體類(lèi)似蛋白質(zhì)。CR-1類(lèi)似蛋白質(zhì)代表CR-類(lèi)似蛋白質(zhì)的一個(gè)亞型，它包括來(lái)源于CR-1的同種異型的等位基因、截?cái)囝?lèi)型、化學(xué)修飾類(lèi)型以及核聚變蛋白質(zhì)。可溶性補(bǔ)體受體1(sCR1)，本文中被認(rèn)為是含有全部30個(gè)細(xì)胞外SCR區(qū)的人CR1的一種可溶性類(lèi)型，它是CR-1類(lèi)似蛋白質(zhì)中的一個(gè)特例。
用各種技術(shù)能夠制造出本發(fā)明的補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)。如果需要完整的天然鏈，可以從上面確定的細(xì)胞來(lái)源中提取天然分子。如果需要的是可溶性類(lèi)型，優(yōu)選天然完整分子的片段。因而，編碼所需鏈片段的DNAs被表達(dá)為重組方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明對(duì)從各種可以產(chǎn)生sCR1重組細(xì)胞系的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化sCR1特別有用。雖然可以在本文公開(kāi)的內(nèi)容基礎(chǔ)上，想到細(xì)胞系以及補(bǔ)體受體產(chǎn)物的某些變化，但是調(diào)整本發(fā)明以適應(yīng)一個(gè)補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)和所產(chǎn)生的細(xì)胞系的特別組合，卻在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能想到的范圍之內(nèi)。
通常，編碼蛋白質(zhì)如補(bǔ)體受體的基因是通過(guò)把編碼所需多肽區(qū)域的DNA片段并入到一個(gè)重組DNA載體(如媒介動(dòng)物)中，并且轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適宜的原核生物或真核生物宿主來(lái)克隆的。適宜的原核生物宿主包括但并不局限于Escberichia，Streptomyces，Bacillus等等。適宜的真核生物宿主包括但并不局限于酵母菌，如Saccharomyces以及培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞如VERO，Hela，小鼠C127，中國(guó)大田鼠卵巢(CHO)，WI-38，BHK，COS，MDCK，和昆蟲(chóng)細(xì)胞系。特別優(yōu)選的宿主為缺乏二氫葉酸還原酶的CHO細(xì)胞系如ATCC CRL 1793，CRL 9096以及如下所述的其它細(xì)胞系。現(xiàn)在這種重組技術(shù)已經(jīng)眾所周知并且在Methods in Enzymdoog(Academic Press)，卷65和69(1979)，100和101(1983)中有所描述，其中還列舉了參考文獻(xiàn)。在Maniatis等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)和Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing(1988，1991)中可以找到使最常用的重組DNA整套方法的許多技術(shù)討論。
把cDNA克隆化是獲得一個(gè)可以編碼一個(gè)所需多肽如一個(gè)補(bǔ)體受體的DNA片段的方法之一。在此過(guò)程中，可以將信使RNA(mRNA)從已知或推測(cè)能夠產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞中分離出來(lái)。通過(guò)一系列的酶催化反應(yīng)，把細(xì)胞的mRNA群復(fù)制到一條互補(bǔ)DNA(cDNA)中。然后將所得cDNA植入克隆載體，之后用于轉(zhuǎn)化一個(gè)適宜的原核生物或真核生物宿主。所得cDNA“文庫(kù)”是由一群轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞組成，每個(gè)宿主細(xì)胞含有一個(gè)基因單體或一個(gè)基因片段。從理論上講，這個(gè)全部文庫(kù)提供了一個(gè)具有代表性的編碼信息樣本，其存在于用作起始物質(zhì)的mRNA混合物中。
使用核酸或抗體探子篩選這些文庫(kù)以便確定特殊的DNA序列。一旦分離出來(lái)，這些DNA序列可以被修飾或者裝配成完整基因?；蛘撸绫景l(fā)明所述，基因的特異性片段可以不依賴(lài)于這個(gè)基因的其它部分而獨(dú)立裝配。盡管由這些裝配后的基因片段編碼的蛋白質(zhì)片段不能在自然界中發(fā)現(xiàn)，但是它們?cè)谥委煵幌Ｍ纳砑膊》矫鎱s有重要用途。能夠用于預(yù)防和/或治療與補(bǔ)體活性有關(guān)的序列的紊亂的可溶性補(bǔ)體受體的遺傳工程學(xué)就是其中的一例。
基因或基因片段一經(jīng)克隆化，DNA就可以轉(zhuǎn)入一個(gè)表達(dá)載體，這種結(jié)構(gòu)可以用于轉(zhuǎn)化一個(gè)適宜的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體是以具有如本文所定義的表達(dá)控制序列為特征的，所以當(dāng)一個(gè)有關(guān)的DNA序列有效地聯(lián)接到載體上時(shí)，這個(gè)載體就能夠控制產(chǎn)生一種產(chǎn)物，這種產(chǎn)物是由與含有這個(gè)載體的宿主細(xì)胞有關(guān)的DNA序列編碼的。與本發(fā)明特別有關(guān)的是一旦形成表達(dá)一種可溶性受體蛋白，裝配這種單克隆序列的片段也就成為可能。這種方法在SCR1重組生產(chǎn)上的特別有效的應(yīng)用可見(jiàn)上文援引過(guò)的Fearon等的PCT申請(qǐng)WO 89/09220，1989年10月5日公開(kāi)以及WO 91/05047，1991年4月18日公開(kāi)的文獻(xiàn)。
產(chǎn)生重組產(chǎn)物之后需要將其分離出來(lái)。如果這個(gè)產(chǎn)物是由產(chǎn)生它的細(xì)胞運(yùn)送的，那么可以直接從細(xì)胞培養(yǎng)中將其分離出來(lái)。如果這個(gè)產(chǎn)物仍留在細(xì)胞內(nèi)，那么必須通過(guò)機(jī)械、化學(xué)或生物的方法完全地破壞細(xì)胞以獲得這個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物。
如果是一種蛋白質(zhì)產(chǎn)品，這種純化方法不僅能提供一種基本上不含其它蛋白質(zhì)的產(chǎn)品，也就是說(shuō)在制劑中這種蛋白質(zhì)在總蛋白中的純度至少為80％，最好大于95％，而且還要除去其它宿主細(xì)胞雜質(zhì)，DNA，RNA，潛在熱原等等，或者將它們降低為可接受的水平。
如上所述，多種宿主細(xì)胞均可用作生產(chǎn)本發(fā)明的受體。首先考慮到受體的性質(zhì)，合成率，衰敗率以及能夠引發(fā)這種受體表達(dá)的重組載體的特性諸方面，選擇一個(gè)特殊的宿主細(xì)胞在普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。所選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在很大程度上決定著所使用的細(xì)胞培養(yǎng)方法的性質(zhì)。一旦選擇了表達(dá)系統(tǒng)，也就選擇了一種一次性或連續(xù)性，螺旋式或空氣式提升的，流動(dòng)性或固定性生產(chǎn)模式。因而，可以使用流動(dòng)層生物反應(yīng)器，空心絲生物反應(yīng)器，滾動(dòng)式培養(yǎng)瓶，或者攪拌釜生物反應(yīng)器，可以有也可以沒(méi)有細(xì)胞微載體。這種選擇的標(biāo)準(zhǔn)在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中是可以想到的。因?yàn)檫@不屬于本發(fā)明的范疇，所以不在此詳述。本發(fā)明涉及存在于一個(gè)可調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的補(bǔ)體受體的純化。
如上所述，本發(fā)明涉及固定的金屬親合層析(IMAC)在補(bǔ)體受體蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用。IMAC的原理是通?？上氲降?。人們認(rèn)為在一個(gè)金屬離子與位于所要結(jié)合的蛋白質(zhì)的表面可接近的電子給體氨基酸之間形成一種金屬配位化合物來(lái)決定吸附的，該金屬離子是由吸附基質(zhì)上的螯合作用固定的氨基酸。金屬離子微包繞物包括并不局限于基質(zhì)，隔離桿(即使有也極少)，螯合配體，金屬離子。普通技術(shù)人員能夠控制周?chē)牧鲃?dòng)培養(yǎng)基和溶解狀態(tài)的可溶性品種的特性以改變所需的分離等級(jí)。
并非局限于任何特殊的機(jī)制理論，人們進(jìn)一步認(rèn)為就結(jié)合而言較重要的氨基酸殘基為組氨酸、色氨酸、也可能為半胱氨酸。如果在蛋白質(zhì)中找到一個(gè)或多個(gè)這種殘基，就可以推測(cè)所有蛋白質(zhì)與IMAC柱結(jié)合。盡管如此，對(duì)發(fā)生有效結(jié)合來(lái)說(shuō)，這種殘基不僅必需存在而且還應(yīng)當(dāng)是可以接近的(如位于蛋白質(zhì)的表面)。最后，本發(fā)明還考慮到其它適于補(bǔ)體受體蛋白的殘基。通過(guò)美國(guó)專(zhuān)利4,569,794中所描述的下列的方法將殘基裝配進(jìn)本文所述的重組表達(dá)系統(tǒng)中，如加到蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端的聚組氨酸尾部。
金屬的性質(zhì)以及在柱上的配位方式也可以影響這種結(jié)合反應(yīng)的強(qiáng)度和選擇性。硅膠基質(zhì)，瓊脂糖以及有機(jī)合成分子如聚乙烯異丁烯酸共聚物均可使用。這種基質(zhì)最好含有促進(jìn)螯合的取代基。可以使用象亞氨基二乙酸(IDA)或它的三(羧基甲基)亞乙基二酰胺(TED)的取代基。IDA為優(yōu)選。一種特別有用的IMAC物質(zhì)為T(mén)oyopearl AF-Chelate 650M，它是一種用IDA取代的聚乙烯異丁烯酸共聚物。雖然Co++、Ni++、Cd++和Fe+++均可使用，但優(yōu)選到鋅為止的第一過(guò)渡系元素中的二價(jià)金屬。當(dāng)然，一個(gè)重要的選擇參數(shù)是此金屬與欲純化蛋白的親合力，Cu++為優(yōu)選。在這些金屬離子周?chē)乃膫€(gè)配位位置中，至少有一個(gè)被一個(gè)水分子占用，這個(gè)水分子在弱堿性pH下容易被一個(gè)較強(qiáng)的電子給體如一個(gè)組氨酸殘基取代。
在實(shí)踐中，用金屬鹽濃溶液脈沖給IMAC柱裝上金屬然后用水或緩沖液過(guò)柱。該柱常常顯示出金屬離子的顏色(鋅除外)。通常，金屬數(shù)量的選擇以大約能夠裝滿(mǎn)柱的一半為準(zhǔn)，這使金屬離子能夠緩慢地滴入未裝區(qū)域而不會(huì)進(jìn)入洗脫液中。在此之前通常用欲洗脫緩沖液進(jìn)行預(yù)沖洗。為了使非特異性離子交換作用降低到最小，樣品緩沖液應(yīng)該含到1M或更多的鹽。在較高pH的情況下蛋白的吸附作用達(dá)到最大。洗脫通常是通過(guò)降低pH值以使被吸附蛋白上的供電子原子團(tuán)質(zhì)子化，或者是通過(guò)在pH9條件下利用較強(qiáng)的配位劑如咪唑或甘氨酸。在后種情況下，可以從柱中置換金屬。使用線性梯度洗脫方法也有很大益處。
如上所述，IMAC是一種特別適用于結(jié)合有其它蛋白質(zhì)物質(zhì)的純化技術(shù)。也就是說(shuō)，將IMAC用于已經(jīng)用其它蛋白純化方法部分純化后的物質(zhì)更為適合。“部分純化的”一詞的含義是一種蛋白制劑，其中有益蛋白質(zhì)的重量百分比至少為5％，至少10％較好，至少45％更好。因而，在上下文中對(duì)IMAC的應(yīng)用大加推崇，因?yàn)樗且环N能完全純化補(bǔ)體受體蛋白的方法。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)第857,002，1992年3月24日公開(kāi)的文獻(xiàn)公開(kāi)了一種特別有用的聯(lián)合層析方法，此處將其引用為參考文獻(xiàn)。例如，在使用IMAC之前使一個(gè)細(xì)胞條件培養(yǎng)基樣本接受部分純化，這已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)很有益處的“細(xì)胞條件培養(yǎng)基”一詞的含義是一種支持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞修復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)基，它含有分泌產(chǎn)物。在使用IMAC步驟之前先對(duì)此培養(yǎng)物的濃縮樣本進(jìn)行一步或多步蛋白純化?？梢詫?duì)樣本進(jìn)行離子交換層析作為第一步。如上所述，可以將多種陰離子或陽(yáng)離子取代基加在基質(zhì)上以形成層析用陰離子或陽(yáng)離子支持劑。陰離子交換替代物包括二乙基氨基乙基(DEAE)，季銨乙基(QAE)以及季胺(Q)基團(tuán)。陽(yáng)離子交換替代物包括羧基甲基(CM)，磺乙基(SE)，磺丙基(SP)，磷酸鹽(P)以及磺酸鹽(S)。纖維素離子交換樹(shù)脂如DE23，DE32，DE52，CM-23，CM-32以及CM-52均可從Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.中得到以SEPHADEX為主，而交聯(lián)離子交換劑也是已知的。如DEAE-，QAE-，CM-，和SP-SEPHADEX以及DEAE-，Q-，CM-和S-SEPHAROSE均可從Pharmacia AB中得到。而且，來(lái)源于乙二醇異丁烯酸共聚物的DEAE和CM，如TOYOPEAPL DEAE-650S和TOYOPEARL CM-650S均可從Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa中得到。因?yàn)閬?lái)源于離子支持劑的洗脫通常包括加鹽，而且在增高的鹽濃度下會(huì)增強(qiáng)如前所述的IMAC，所以在經(jīng)過(guò)離子交換層析步驟或其它鹽介導(dǎo)的純化步驟之后進(jìn)行IMAC步驟為優(yōu)選方案。其它純化方法也可以加入，包括并不局限于HIC，進(jìn)一步離子交換層析，分子排阻層析，病毒滅活，濃縮和冷凍干燥。
在水溶劑中疏水性分子將會(huì)自身締合。這種締合是由于疏水性相互作用而產(chǎn)生的?，F(xiàn)在認(rèn)為大分子如蛋白質(zhì)除具有能夠推測(cè)的疏水性基因外，還在其表面存在大量疏水性碎片。HIC部分是由這些碎片與附著與層析支持劑上的疏水性配位體的相互作用產(chǎn)生的。一種與一個(gè)基質(zhì)結(jié)合的疏水性配位體本文也可以稱(chēng)為HIC支持劑，HIC凝膠或HIC柱。進(jìn)一步認(rèn)為蛋白與HIC支持劑之間的相互作用的強(qiáng)弱不僅是蛋白質(zhì)上非極性和極性表面的均衡的作用，而且還與非極性表面的分布有關(guān)。
許多基質(zhì)均可用于HIC柱的制備，其中應(yīng)用最多的是瓊脂糖。硅和有機(jī)聚合物樹(shù)脂均可使用?？捎玫氖杷耘湮惑w包括并不局限于含有2-10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，如丁基、丙基或辛基；或者為芳基如苯基。用于凝膠和柱的常規(guī)HIC產(chǎn)品可以從市場(chǎng)上的商品中得到，如Pharmacia LKB AB，Uppsala，瑞典生產(chǎn)的商品名為丁基-SEPHAROSE，苯基-SEPHAROSECL-48，辛基-SEPHAROSEFF以及苯基-SEPHAROSEFF的商品；日本東京Tosoh公司生產(chǎn)的名為T(mén)OYOPEARL丁基-650，乙醚-650或苯基-650(Fractogel Tsk丁基-650)或TSK-GEL苯基-5PW的商品；Miles-Yeda，Rohovot，以色列生產(chǎn)的名為烷基瓊脂糖的商品，其中烷基含有2-10個(gè)碳原子，以及J.T.Baker，Philipsburg，N.J.生產(chǎn)的名為BakerbondWP-HI-丙基的商品。
配位體濃度是一個(gè)不僅影響相互作用的強(qiáng)度而且影響柱的層析能力的重要參數(shù)。市場(chǎng)上可以得到的苯基、辛基苯基凝膠的配位體濃度為每毫升凝膠層含有40微摩爾凝膠。凝膠的層析能力是正被談?wù)摰奶囟ǖ鞍滓约皃H、溫度和鹽濃度的函數(shù)，但是，人們常希望它能落在3-20mg/ml的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能選擇一種特殊的凝膠。通常，蛋白與HIC配位體間的相互作用力的強(qiáng)弱隨著烷基配位體的鏈的長(zhǎng)度的增加而增加，但是對(duì)大多數(shù)分離來(lái)講，含有4-8個(gè)碳原子的配位體較為適宜。盡管由于苯基與蛋白質(zhì)上的芳基間的pi-pi相互作用的可能性這種選擇性有很大不同，但是苯基和戊基卻具有相同的疏水性。
雖然，蛋白質(zhì)與HIC柱的吸附作用在高鹽濃度下較好，但是準(zhǔn)確的濃度卻可以根據(jù)此蛋白與所選用的HIC配位體的性質(zhì)在一個(gè)較大的范圍內(nèi)變化?？梢愿鶕?jù)它們是否能促進(jìn)疏水性相互作用(鹽析效應(yīng))或破壞水的結(jié)構(gòu)(離液效應(yīng))在一個(gè)被稱(chēng)為憎溶系中選擇離子并且能導(dǎo)致疏水性相互作用減弱。在鹽析效應(yīng)增強(qiáng)方面，陽(yáng)離子的排列順序?yàn)锽a++＜Ca++＜Mg++＜Li+＜Cs+＜Na+＜K+＜Rb+＜NH4+。而在離液效應(yīng)增強(qiáng)方面，陰離子的排列順序?yàn)镻O---＜SO4--＜CH3COO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。
因而，將影響相互作用強(qiáng)弱的鹽用下列關(guān)系式給出它們的關(guān)系Na2SO4＞NaCl＞(NH4)2SO4＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN通常使用的鹽濃度為硫酸銨約0.75-2M，NaCl約1-4M。
雖然溫度的下降可引起相互作用的減弱，但是溫度對(duì)HIC分離的影響卻很復(fù)雜。不管怎樣應(yīng)該加大任何有利因素以對(duì)抗如在蛋白活動(dòng)中產(chǎn)生的相反作用的增強(qiáng)，這些有利因素是隨著溫度的增加而增強(qiáng)的。
無(wú)論是分步洗脫還是梯度洗脫均可用許多方法完成(a)通過(guò)改變鹽的濃度，(b)通過(guò)改變?nèi)軇┑臉O性，(c)通過(guò)加入洗滌劑，通過(guò)降低鹽濃度以疏水性作用增加的順序洗脫被吸附的蛋白。通過(guò)加入如乙二醇或(異)丙醇的溶劑由此減弱疏水性相互作用，以改變?nèi)軇┑臉O性。洗滌劑的作用為置換蛋白，主要用于有關(guān)膜蛋白的純化。
當(dāng)對(duì)經(jīng)過(guò)HIC的洗脫物進(jìn)行進(jìn)一步的離子交換層析時(shí)，陰離子方法和陽(yáng)離子方法均可使用。
如上所述，凝膠過(guò)濾層析是對(duì)基于分子大小的分離起作用，它是以篩選分子的形式起作用的。人們希望基質(zhì)與所存在的溶質(zhì)之間無(wú)相互作用，因而可優(yōu)選所有的惰性基質(zhì)。人們還希望基質(zhì)硬而且為大孔。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，其硬度尤為重要，因?yàn)檫@個(gè)參數(shù)與最終的流速確定有很大關(guān)系。傳統(tǒng)的物質(zhì)如SEPHADEX或BIOGEL雖有足夠的惰性且孔的大小符合要求，但這些凝膠相對(duì)較軟而且尤其不適合大規(guī)模的純化。最近開(kāi)發(fā)了一些硬度增加的凝膠(如SEPHACRYL，UTROGEL，F(xiàn)RACTOGEL和SUPEROSE)。所有這些基質(zhì)產(chǎn)品的顆粒大小小于那些可得到的傳統(tǒng)支持劑，從而即使在較高流速下仍保持再溶解。優(yōu)選TOYOPEARL HW系列基質(zhì)(Toso Haas)。
本發(fā)明可用于溶解型補(bǔ)體受體的純化僅僅是為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的目的。具體地說(shuō)是將其應(yīng)用于一個(gè)最多包含前導(dǎo)鏈，LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30區(qū)域并包括轉(zhuǎn)換膜區(qū)域的第一丙氨酸殘基的可溶性CR1結(jié)構(gòu)，這與Fearon等；1989，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 89/09220，
公開(kāi)日1989年10月5日文獻(xiàn)中描述的用于質(zhì)粒pBSCR1c中CR1編碼序列相一致(此后稱(chēng)為“TP10HD”)。這種TP10HD產(chǎn)品的重組系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)在上述的PCT申請(qǐng)中有詳細(xì)描述，總結(jié)如下。
用胰蛋白酶處理CHO細(xì)胞，在平皿中培養(yǎng)出一個(gè)每60mm 5×105的盤(pán)，放入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2/P5空氣的氣壓下，在可調(diào)濕的孵化器中培養(yǎng)(這種生長(zhǎng)培養(yǎng)基為Hams F12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(041-1765)，含1％普通的谷氨酸(043-05030)、1％普通的pen/strep(043-05070)以及10％小牛血清(011-6290)，Gibco，Paisley，蘇格蘭生產(chǎn))。21小時(shí)后將此細(xì)胞用于DNA轉(zhuǎn)染。用pSV2dhfr將一個(gè)來(lái)源于pBSCR1c含有sCR1編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入一個(gè)需要dhfr的中國(guó)Hamster Ovary細(xì)胞系(CHODUXBII)。轉(zhuǎn)染在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，并且使用了如DNA Cloning，D.M.Glover ed.(Chap.15，C.Corman)中所述的鈣共同沉淀或甘油沖擊方法。在用pBSCR1c/pTCSgpt和pSV2dhfr轉(zhuǎn)染之后，開(kāi)始選擇之前，將細(xì)胞在生長(zhǎng)條件下(如上所述在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繼續(xù)保存46小時(shí)。
選擇和共同增強(qiáng)的進(jìn)行基本如R.J.Kaufman，等(Mol.Cell.Biol 51750-1759(1985)所述。轉(zhuǎn)染后46小時(shí)細(xì)胞變?yōu)檫x擇性培養(yǎng)基MEM ALPHA(041-02571)，它含有1％普通谷氨酸、1％普通pen/strep(043-05070)以及經(jīng)過(guò)滲析的胎牛血清(220-6300AJ)(Gibco，Paisley，蘇格蘭生產(chǎn))。將細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中保存8-10天直到dhfr+克隆出現(xiàn)，當(dāng)建起克隆時(shí)，細(xì)胞變?yōu)楹邪奔椎实倪x擇性培養(yǎng)基(A6770，Sigma Chem.Co，St.Louis，Mo.)。氨甲蝶呤的濃度開(kāi)始為0.02μM，以后逐步增加到5μM。在放大過(guò)程中用來(lái)源于生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的等分試樣測(cè)定ELISA生產(chǎn)的TP10HD。按照本發(fā)明，任何能分泌重組細(xì)胞系(如ATCC CRL10052)的補(bǔ)體受體均可用來(lái)提供純化用的條件培養(yǎng)基，當(dāng)然不需要一個(gè)特別的細(xì)胞系。
培養(yǎng)一個(gè)能夠產(chǎn)生TP10HD的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系可以采用多種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用而言，培養(yǎng)的特殊方法并不是重要的，但為了詳細(xì)說(shuō)明的目的，可用的細(xì)胞培養(yǎng)的一種方法是一種連續(xù)灌注法，此方法基于如美國(guó)專(zhuān)利4,861,714；4,863,856；4,978,616以及4,997,753中所載的Verax流動(dòng)層技術(shù)。其內(nèi)容本文引用為參考文獻(xiàn)。因而，如上所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在用10％胎牛血清(FBS)和5mM氨甲蝶呤(MTX)補(bǔ)充的CCM-3培養(yǎng)基中遞增，CCM-3培養(yǎng)基為DMEM，Ham′s F-12，牛血清白蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)性添加劑的混合物。在輥式瓶中擴(kuò)大細(xì)胞群落直到產(chǎn)生足夠的細(xì)胞以用于孵化一個(gè)生物反應(yīng)器。
在孵化一個(gè)S200生物反應(yīng)器之前進(jìn)行器皿的清潔和蒸氣消毒環(huán)節(jié)。然后用含有5％FBS的CCM-3填充并加入450g微球體。在孵化之前用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)微球體。用細(xì)胞孵化此反應(yīng)器，其操作參數(shù)為pH7.2，37℃，進(jìn)口含氧100-400torr(進(jìn)口是指流動(dòng)層的底部)，出口含氧0-200torr(出口是指流動(dòng)層的頂部)。繼初相之后，進(jìn)行培養(yǎng)基灌注，灌注率逐漸增加以保持葡萄糖的濃度為1.0g/L。如此連接灌注直到在反應(yīng)器中積累了足夠量的細(xì)胞以孵化一個(gè)S2000生物反應(yīng)器。CTP和SIP之后，將加有5％FBS和5mM MTX的CCM-3培養(yǎng)基裝入S-2000反應(yīng)器中，并且加入5000g微球體。在孵化之前用培養(yǎng)基濕潤(rùn)此微球體。溫度、反應(yīng)設(shè)計(jì)和含氧量方面的操作條件如上所述。將S-200反應(yīng)器中的微球體無(wú)菌地轉(zhuǎn)入S-2000反應(yīng)器以建立初相。當(dāng)葡萄糖的濃度下降到1.5g/L以下時(shí)，通過(guò)一定流速的介質(zhì)(CCM-3，5％FBS和5mM MTX)灌注啟動(dòng)生長(zhǎng)相以保持葡萄糖的濃度為1.0g/L。通過(guò)測(cè)氧攝入率和葡萄糖消耗率來(lái)用曲線監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)反應(yīng)器的細(xì)胞積累到足夠的數(shù)量時(shí)，灌注的培養(yǎng)基改為加有1％FBS和5mM MTX的CCM-3的一種過(guò)渡培養(yǎng)基。再次增加灌注率以保持葡萄糖的濃度為1.0g/L。在過(guò)渡性培養(yǎng)基中進(jìn)一步生長(zhǎng)之后，將灌注培養(yǎng)基再改為生產(chǎn)培養(yǎng)基，加有5mM MTX的CCM-3。增加灌注率以保持葡萄糖的濃度為1.0g/L。此后降低給定的出口含氧量或者循環(huán)流率以結(jié)束反應(yīng)器的反應(yīng)。生產(chǎn)相一般持續(xù)60天左右。
將400-1600升4-8℃下保存的的反應(yīng)滲透劑穿過(guò)一個(gè)Millipore Prostak微過(guò)濾裝置。對(duì)從此操作中得到的細(xì)胞外滲透劑進(jìn)行超過(guò)濾。用Millipore Spiral Mound裝置將滲透劑濃縮30-60倍。濃縮后，將殘余物排入一個(gè)收集箱中，并將5-20L pH為7.5的50mM磷酸緩沖液裝入該系統(tǒng)中。從系統(tǒng)中排出沖洗緩沖液并與殘余物結(jié)合。將超過(guò)濾濃縮液通過(guò)一個(gè)預(yù)過(guò)濾器和一個(gè)終端為0.22mm的過(guò)濾器，濾入一個(gè)預(yù)先高壓滅菌的Nalgene瓶中。通常每瓶裝濃縮液800ml，冷凍保存。
如前所述，這種特殊的重組生產(chǎn)系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)方法不在本發(fā)明范圍內(nèi)。上面討論的系統(tǒng)和方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能使用的許多方案中具有代表性的，本文包括它們僅為了詳細(xì)說(shuō)明發(fā)明目的。例如，從攪拌釜反應(yīng)器中得到的介質(zhì)同樣適合作為用于本發(fā)明的條件培養(yǎng)基的來(lái)源物。本發(fā)明的主題是對(duì)純化方法作常規(guī)修改，將其用多種重組補(bǔ)體受體蛋白和補(bǔ)體受體類(lèi)似蛋白的純化，與怎樣生產(chǎn)或培養(yǎng)的這些蛋白無(wú)關(guān)。
應(yīng)用本發(fā)明的方法所獲得的純化補(bǔ)體受體蛋白具有以下特性1)CR蛋白大于95％重量百分比；2)在4℃下蛋白分解作用可保持穩(wěn)定至少三個(gè)月；3)低內(nèi)毒素(每mg蛋白＜1E.U.)；4)低DNA(每mg蛋白＜1pg)；5)非CR蛋白小于5％；6)病毒滅活。
下列實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不作為對(duì)權(quán)利要求的限制。
實(shí)施例I內(nèi)容介紹下面概括的方法可以用于從細(xì)胞條件培養(yǎng)基濃縮物中分離和純化可溶性補(bǔ)體受體-1(sCR1)。設(shè)計(jì)此方法為當(dāng)去掉來(lái)源于宿主細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基或其它原料的雜質(zhì)時(shí)可以制備出蛋白純度大于95％的sCR1。此回收方法由九步組成，其中包括陽(yáng)離子和陰離子交換、固定的金屬親合、疏水性相互作用和分子排阻層析，以及二種病毒滅活處理。每一步詳細(xì)描述如下，包括原料、方法和所期望的結(jié)果。1至3步在2-8℃下完成，6-9步在18-25℃下完成。所有的緩沖液在使用之前均用WFI調(diào)制并且經(jīng)過(guò)一個(gè)10,000 MWCO過(guò)濾器的過(guò)濾。通過(guò)柱上顯示的280nm紫外吸光度和傳導(dǎo)性調(diào)節(jié)所有柱。在使用前潔凈并平衡柱，每次使用后用NaOH潔凈并在其中保存。
將此方法規(guī)模化以適應(yīng)含有100G粗sCR1的近1000L培養(yǎng)基的需要，完成此套方法需7-14天，具體根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模而定。第一步介質(zhì)的預(yù)處理邊攪拌邊以1-3L/min的速度加入1M乙酸，使1000L細(xì)胞外條件培養(yǎng)基的pH值下降到5.2。所需乙酸的體積約為介質(zhì)體積的3％，需要加15-30分鐘。此后不斷監(jiān)測(cè)pH值。pH值的調(diào)節(jié)會(huì)產(chǎn)生大量沉淀。經(jīng)過(guò)兩串聯(lián)(0.5微米)的Millipore 30英寸Polygard-CR過(guò)濾器微過(guò)量而澄清。在濾液中回收sCR1，當(dāng)濾液積累到50-100L時(shí)開(kāi)始第二步?？墒惯^(guò)濾和裝載同時(shí)進(jìn)行。
將非sCR1蛋白和非蛋白類(lèi)物質(zhì)從酸化和過(guò)濾的介質(zhì)濃縮物中去掉，將含有濾液的sCR1調(diào)整到適于隨后進(jìn)行的凝膠層析的pH值。第二步PHARMCIAS瓊脂糖快流速層析以150cm/hr的流速(一直如此)將pH5.2的濾液裝在用緩沖液A平衡過(guò)的PHARMCIA S瓊脂糖凝膠柱上。以150cm/hr的流速用3-5個(gè)層容積的緩沖液A沖洗柱，之后用5-10個(gè)層容積的緩沖液B沖洗。用3-5個(gè)層容積的緩沖液C洗脫sCR-1。收集所有的洗脫峰值直到吸收度降到所觀察到的最大吸收度的5％為止。sCR1洗脫物約為1.5-2個(gè)層容積。
用0.5N NaOH處理至少1小時(shí)后用WFI沖洗并用緩沖液A平衡，以使注保持干凈并能重復(fù)使用。不用時(shí)將柱保存于0.01N NaOH中。
S瓊脂糖層析去掉大部分源于雜質(zhì)(特殊蛋白)的細(xì)胞和介質(zhì)，緩沖液C柱中的sCR1濃縮物洗脫物為下一步使用。第三步使用TOYOPEARL AF-CHELATE 650M的IMAC第一部分用銅裝IMAC柱以及該柱的平衡將銅裝于柱上的方法如下用3個(gè)柱容積的WFI沖洗柱之后，將6-8個(gè)柱容積的0.2％硫酸銅穿過(guò)此柱。當(dāng)蘭色明顯遍及整層時(shí)停止裝載，多余的銅從洗脫液中流出。然后用1-2個(gè)層容積的WFI沖洗該柱，之后用3-5個(gè)層容積的緩沖液C沖洗該柱。第二部分IMAC柱的裝載、沖洗、洗脫及產(chǎn)生裝載、平衡后，以150cm/hr(一直如此)的流速將S瓊脂糖洗脫物加于IMAC柱上(參看第三步第一部分)。用3-5個(gè)層容積的緩沖液C以150cm/hr的流速?zèng)_洗柱，之后用5-10個(gè)層容積的緩沖液D沖洗。在用緩沖液D沖洗完成后，趕緊用3-5個(gè)容積的緩沖液C沖洗柱，以使pH恢復(fù)到8，否則在使用緩沖液E時(shí)將會(huì)出現(xiàn)明顯的銅浸出。用3-5個(gè)層容積的緩沖液E洗脫sCR1，收集全部洗脫峰值直到吸收度降到所觀察到的最大吸收度的5％為止，sCR-1洗脫物約為2個(gè)層容積。因?yàn)殂~與0.5M NaOH洗滌劑不相容，所以用5個(gè)層容積的50mM EDTA將銅去掉。必須收集濃縮后的銅流出物，按照當(dāng)?shù)氐囊?guī)定對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚怼?br> 用0.5N NaOH處理至少1小時(shí)后用WFI沖洗并用緩沖液C平衡，以使柱保持干凈并能重復(fù)使用。不用時(shí)將柱保存于0.01N NaOH中。
IMAC層析去掉源于雜質(zhì)(特殊蛋白和DNA)的細(xì)胞和介質(zhì)。第四步用胍滅活病毒以及硫酸銨的加入第一部分加入胍(在2-8℃下進(jìn)行)加入半個(gè)容積的冷的緩沖液，并連續(xù)攪拌10-15分鐘，使冷的IMAC洗脫物經(jīng)過(guò)胍的處理。加完緩沖液F后，經(jīng)過(guò)液面下的移液管將溶液移入第二個(gè)器皿中，并放置6分鐘。第二部分加入硫酸銨(在2-8℃下進(jìn)行)立即用相同容積的冷緩沖液G稀釋經(jīng)第四步第一部分處理過(guò)的溶液，連接攪拌10-15分鐘。所得的溶液含1.0M胍，含0.9M硫酸銨。在進(jìn)行第五步之前，將此溶液在2-8℃下保存。
胍處理使病毒滅活，加入硫酸銨以制備供Toyopearl BUTYL層析使用的溶液。第五步TOYOPEARL BUTYL-650M層析(2-8℃下)先用緩沖液H平衡Toyopearl Butyl-650M柱，然后以150cm/hr的流速將從第4步得到的溶液裝于柱上。緩沖液和柱在2-8℃下，這很關(guān)鍵。裝完后，用3-5個(gè)層容積的緩沖液H沖洗柱，用緩沖液I洗脫結(jié)合的sCR1。sCR1洗脫物為1.5-3個(gè)層容積，用0.2N NaOH反萃取柱。在一個(gè)可測(cè)定的峰值下，堿洗洗脫出蛋白雜質(zhì)，進(jìn)行中和反應(yīng)，保留為進(jìn)一步測(cè)定。
用0.5N NaOH處理至少1小時(shí)后用WFI沖洗并用緩沖液H平衡，以使柱保持干凈并能重復(fù)使用。不用時(shí)將柱保存于0.01N NaOH中。第六步在pH為11下使病毒失活并對(duì)流過(guò)濾加2.5M NaOH將丁基洗脫液的pH調(diào)到11。立即通過(guò)液面下的導(dǎo)管將溶液移入第二個(gè)器皿中，pH為11保持16分鐘后，用2.5MHCl將pH調(diào)到9.0。在一個(gè)裝有30kD MWCO低蛋白結(jié)合膜的切向流儀器(如Filtron Omega Series)中，經(jīng)過(guò)pH11處理后的溶液與緩沖液J連續(xù)對(duì)流過(guò)濾。持續(xù)對(duì)流過(guò)濾直到有4-5個(gè)容積的溶液進(jìn)入滲透器，殘余物的傳導(dǎo)率≤2mS/cm。
pH11處理使病毒滅活，對(duì)流過(guò)濾制備出用于DEAE層析的sCR1溶液。第七步TOYOPEARL DEAE-650S層析將從第6步中得到的溶液以150cm/hr的流速裝于用緩沖液J平衡過(guò)的Toyopeal DEAE-650S柱。裝完后用3-5個(gè)層容積的緩沖液J沖洗柱。用5個(gè)柱容積的線性梯度洗脫結(jié)合sCR1，開(kāi)始為100％緩沖液J，然后為100％緩沖液K。收集整個(gè)洗脫峰直到吸收度降為所觀察到的最大吸收度的20％為止。然后將峰尾的收集液轉(zhuǎn)入另一個(gè)容器中。應(yīng)該洗脫出1-2個(gè)層容積的sCR-1。用3個(gè)層容積的緩沖液L沖洗反萃取柱。
用0.5N NaOH處理至少1小時(shí)后用WFI沖洗并用緩沖液J平衡，以使柱保持干凈并能重復(fù)使用。不用時(shí)將柱保存于0.01N NaOH中。
DEAE層析可去掉蛋白質(zhì)、DNA和潛在的病毒雜質(zhì)。第8步TOYOPEARL HW-55F層析將DEAE洗脫液以20cm/hr的流速裝于用緩沖液M平衡過(guò)的Toyopearl HW-55F柱。所裝的容積應(yīng)該小于等于整層容積的10％，所裝的濃度應(yīng)該小于等于5mg/ml。收集整個(gè)峰直到吸收度降為最大吸收度的10％。將峰尾的收集液裝入另一個(gè)容器。如果需要重復(fù)注入，將峰的各部分集中起來(lái)?，F(xiàn)在此物可用于最后的濃縮。
用0.5N NaOH處理至少1小時(shí)后用WFI沖洗并用緩沖液M平衡，以使柱保持干凈并能重復(fù)使用。不用時(shí)將柱保存于0.01N NaOH中。
排阻層析去掉了最后微量低分子蛋白雜質(zhì)，并將sCR1轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N含有與最終緩沖液N制劑相容組分的溶液。第9步濃縮和最后的過(guò)濾用一個(gè)切向流超過(guò)濾裝置將HW-55F洗脫液濃縮為5-6mg/ml，這個(gè)裝置的大小適于最后所需的容積(如Pharmacia Minisette超過(guò)濾裝置或Millipore CUF裝置)，并且與Filtron Omega Series30kD或100kD MWCO膜相配。濃縮后，將此溶液與5個(gè)容積的緩沖液N連續(xù)地對(duì)流過(guò)濾。將此濃縮后的sCR-1通過(guò)一個(gè)微孔為0.2微米的Millipak過(guò)濾器過(guò)濾入無(wú)菌的容器中。緩沖液緩沖液A 20mM磷酸鈉，60mM NaCl，pH5.2緩沖液B 20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH6.0緩沖液C 100mM磷酸鈉，500mM NaCl，pH8.0緩沖液D 100mM乙酸，1M HaCl，pH4.0緩沖液E 50mM咪唑，100mM磷酸鈉，500mM NaCl，pH8.0緩沖液F 6M鹽酸胍，100mM磷酸鈉，pH7.0緩沖液G 1.8M硫酸銨，100mM磷酸鈉，pH7.0緩沖液H 0.9M硫酸銨，100mM磷酸鈉，pH7.0緩沖液I 100mM磷酸鈉，pH7.0緩沖液J 50mM Tris/Tris，HCl，pH9.0緩沖液K 50mM Tris/Tris，HCl，0.2M NaCl，pH9.0緩沖液L 50mM Tris/Tris，HCl，1.0M NaCl，pH9.0緩沖液M 10mM磷酸鈉，0.9％w/v NaCl，pH7.0緩沖液N 16.3mM磷酸鉀，2.5mM NaCl，2％(w/v)甘露糖醇，pH6.9溶液WFI2.5M氫氧化鈉0.5M氫氧化鈉0.2M氫氧化鈉0.01M氫氧化鈉2.5M鹽酸1M乙酸0.2％(w/v)硫酸銅五水合物(CuSO4·5H2O)50mM乙二胺四乙酸的二鈉或四鈉鹽(Na2EDTA或者Na4EDTA)。柱的參數(shù)
純化表步驟容積 [sCR-1] 蛋白sCR-1總 …蛋白 累積回(L)(G/L) (G/L) 量(G) (G)收率(％)介質(zhì)905 0.05 未檢測(cè)出 46.2 未檢測(cè)出 100SSFF洗脫物 45.70.952.4943.311.894IMAC洗脫物 43.41.001.8244.181.996Buryl洗脫物 21.62.102.2445.250.198DEAE洗脫物 10.04.083.9440.839.489HW-55F 21.71.681.6536.435.879洗脫物純化的sCR-1 6.8 5.335.1836.335.379用HPLC測(cè)定的sCR-1用280nm的吸光度測(cè)定的蛋白質(zhì)(ε＝1.10mLmg-1cm-1)
權(quán)利要求
1.一種從一個(gè)含有一種補(bǔ)體受體蛋白的混合物中純化這種補(bǔ)體受體蛋白的方法，將所述的混合物依次與一種陽(yáng)離子層析支持劑、金屬親合層析支持劑、一種分子排阻層析支持劑相接觸并從每個(gè)支持劑中選擇性地洗脫出蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中受體從CR1、CR2、CR3和CR4中選擇。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中受體是CR1及其片段。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其中受體是一個(gè)CR1的可溶性片段。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中受體是TP10HD。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中陽(yáng)離子層析支持劑選自于CM-23-、CM-32-、CM-52-纖維素；CM-和SP-交聯(lián)葡聚糖，CM-和S-瓊脂糖以及CM-650 S TOYOPEARL中，并且用加入一個(gè)緩沖過(guò)的鹽溶液進(jìn)行洗脫。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中支持劑是S-瓊脂糖，鹽是氯化鈉。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中鹽溶液是100mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，pH8.0。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中金屬親合支持劑選自于硅膠，瓊脂糖以及聚乙烯異丁烯酸共聚物中。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中取代基從IDA和TED中選擇。
11.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中支持劑為T(mén)OYOPEARLAF-CHELATE 650M。
12.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中金屬親合支持劑為T(mén)OYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一個(gè)咪唑鹽緩沖液選擇性洗脫補(bǔ)體受體。
13.按照權(quán)利要求12所述的方法，其中咪唑鹽洗脫緩沖液由50mM咪唑，100mM磷酸鈉，500mM氯化鈉組成，pH為8.0。
14.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中分子排阻層析劑從SEPHACRYL，UTROGEL，F(xiàn)RACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55-F中選擇。
15.按照權(quán)利要求14所述的方法，其中支持劑為T(mén)OYOPEARLHW55-F并且洗脫液為10mM磷酸鈉，0.9％(w/v)的氯化鈉，pH為7。
16.一種從含有一種補(bǔ)體受體蛋白組分的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化這種補(bǔ)體受體蛋白的方法，對(duì)介質(zhì)依次進(jìn)行(a)陽(yáng)離子交換層析，(b)固定的金屬親合層析，(c)疏水性相互作用層析，(d)陽(yáng)離子交換層析，和(e)分子排阻層析。
17.按照權(quán)利要求16所述的方法，其中陽(yáng)離子交換層析所使用的支持劑是CM-23-、CM-32-、CM-52-纖維素；CM-和SP-交聯(lián)葡聚糖，CM-和S-瓊脂糖以及CM-650 STOYOPEARL中的一種，并且通過(guò)一個(gè)緩沖過(guò)的鹽溶液洗脫。
18.按照權(quán)利要求17所述的方法，其中支持劑是S-瓊脂糖，鹽是氯化鈉。
19.按照權(quán)利要求18所述的方法，其中鹽溶液是100mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，pH8.0。
20.按照權(quán)利要求17所述的方法，其中金屬親合支持劑是選自于硅膠，瓊脂糖以及聚乙烯異丁烯酸共聚物中。
21.按照權(quán)利要求20所述的方法，其中取代基從IDA和TED中選擇。
22.按照權(quán)利要求21所述的方法，其中支持劑為T(mén)OYOPEARLAF-CHELATE 650M。
23.按照權(quán)利要求16所述的方法，其中金屬親合支持劑為T(mén)OYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一個(gè)咪唑鹽緩沖液選擇性洗脫補(bǔ)體受體。
24.按照權(quán)利要求23所述的方法，其中咪唑鹽洗脫緩沖液由50mM咪唑，100mM磷酸鈉，500mM氯化鈉組成，pH為8.0。
25.按照權(quán)利要求16所述的方法，其中疏水性相互作用層析支持劑選自于烷基C2-C8-瓊脂糖、芳基瓊脂糖、烷基硅膠、烷基-有機(jī)聚合物樹(shù)脂中。
26.按照權(quán)利要求25所述的方法，其中支持劑選自于丁基-、苯基-和辛基-瓊脂糖以及丁基-、苯基-和醚-TOYOPEARL中。
27.按照權(quán)利要求26所述的方法，其中支持劑為丁基-TOYOPEARL。
28.按照權(quán)利要求20所述的方法，其中支持劑為丁基-TOYOPEARL并且用一個(gè)低濃度鹽緩沖液選擇性地洗脫蛋白。
29.按照權(quán)利要求28所述的方法，其中選擇性地洗脫蛋白的緩沖液含100mM磷酸鈉，pH7.0。
30.按照權(quán)利要求16所述的方法，其中陰離子交換層析所使用的支持劑是DEAE-纖維素，DEAE-，QAE-交聯(lián)葡聚糖，DEAE-，Q-瓊脂糖以及TOYOPEARL DEAE 650S中的一種。
31.按照權(quán)利要求30所述的方法，其中所說(shuō)的支持劑為T(mén)OYOPEARL DEAE 650S。
32.按照權(quán)利要求16所述的方法，其中分子排阻層析所使用的支持劑是SEPHACRYL，UTROGEL，F(xiàn)RACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55F中的一種。
33.按照權(quán)利要求32所述的方法，其中支持劑為T(mén)OYOPEARLHW55F。
34.一種從一種細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化一種補(bǔ)體受體蛋白的方法，包括(a)濃縮細(xì)胞條件培養(yǎng)基；(b)在一種陽(yáng)離子層析支持劑上吸附補(bǔ)體受體蛋白；(c)用至少一種緩沖液沖洗吸附后的蛋白；(d)在一種固定的金屬親合層析支持劑上洗脫沖洗后的蛋白；(e)吸附從步驟中洗脫后的蛋白；(f)用至少一種緩沖液沖洗吸附后的蛋白；(g)洗脫沖洗后的蛋白；(h)在一種疏水性相互作用層析支持劑上吸附從步驟(g)中洗脫過(guò)的蛋白；(i)選擇性地洗脫這種蛋白；(j)在一種陰離子交換支持劑上吸附從步驟(h)中洗脫過(guò)的蛋白；(k)洗脫吸附后的蛋白；(l)對(duì)來(lái)源于步驟(k)中的洗脫物進(jìn)行分子排阻層析；(m)由此回收這種蛋白。
35.按照權(quán)利要求34所述的方法，包括能夠如果存在的任何病毒滅活的步驟。
36.按照權(quán)利要求35所述的方法，其中所說(shuō)的病毒滅活步驟在步驟(i)之后步驟(j)之前和/或在步驟(g)之后步驟(h)之前進(jìn)行。
37.按照權(quán)利要求36所述的方法，其中所說(shuō)的病毒滅活步驟包括用堿或鹽酸胍對(duì)洗脫液進(jìn)行處理。
38.按照權(quán)利要求34所述的方法，其中步驟(b)的陽(yáng)離子交換支持劑為磺酸鹽取代的瓊脂糖。
39.按照權(quán)利要求34所述的方法，其中固定的金屬親合支持劑為T(mén)OYOPEARL AF-CHELATE 650M。
40.按照權(quán)利要求34所述的方法，其中步驟(j)的陰離子交換支持劑選自于二乙氨乙基，季氨基乙基和季銨取代的樹(shù)脂，交聯(lián)葡聚糖，瓊脂糖或TOYOPEARL中。
41.按照權(quán)利要求40所述的方法，其中陰離子交換支持劑為二乙氨乙基取代的TOYOPEARL。
42.按照權(quán)利要求34所述的方法，其中步驟(h)的疏水性相互作用層析劑選自于烷基C2-C8-瓊脂糖、芳基-瓊脂糖、烷基硅膠、烷基-有機(jī)聚合物樹(shù)脂中。
43.按照權(quán)利要求42所述的方法，其中支持劑選自于丁基-、苯基-和辛基-瓊脂糖以及苯基-，醚-和丁基-TOYOPEARL中。
44.按照權(quán)利要求43所述的方法，其中支持劑為T(mén)OYOPEARL650。
45.按照權(quán)利要求44所述的方法，其中分子排阻層析使用的是TOYOPEARL HW55F。
46.按照權(quán)利要求34所述的方法，其中所說(shuō)的經(jīng)過(guò)層析步驟(1)的蛋白用沉淀、濃縮和超過(guò)濾回收。
47.一種從一個(gè)含有一種補(bǔ)體受體蛋白的混合物中純化這種補(bǔ)體受體蛋白的方法，將所說(shuō)的混合物吸附于一個(gè)固定金屬親合支持劑上，沖洗吸附后的蛋白，洗脫并且回收此蛋白。
48.按照權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于在固定親合層析支持劑吸附之前或之后，加入一步或多步蛋白純化步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及固定的金屬親合層析法在補(bǔ)體受體蛋白純化中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/715GK1130353SQ94193182
公開(kāi)日1996年9月4日 申請(qǐng)日期1994年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月9日
發(fā)明者T·M·史密夫, G·福倫納-瓦澤曼 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司