ol, 266:227-258, 1996)。在用于計算百分一致性的DNA序列的FASTA中，所用的優(yōu)選 參數(shù)被優(yōu)化：BL50矩陣15:-5, k-tuple = 2 ;鄰接罰分=40,優(yōu)化=28 ;空位罰分-12,空 位長度罰分=-2 ;以及寬度=16。
[0103] 適用于測定序列百分一致性和序列百分相似性的算法的另一個優(yōu)選的實例為 BLAST和BLAST 2.0算法（分別參見Altschul et al·，NucAcids Res, 25:3389-3402, 1977; and Altschul et al·，J Mol Biol, 215:403-410, 1990)。使用 BLAST 和 BLAST 2.0,其參 數(shù)如本文所述，從而測定本發(fā)明公開的核酸和蛋白質的序列百分一致性。用于進行ABLST 分析的軟件可以通過國家生物技術信息中心（the National Center forBiotechnology Information)的網站公共獲得。該算法涉及首先通過識別查詢序列中長度為W的短字段 (word)來識別高比值片段對（HSPs)，其中當所述的字段與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字段 比對時，其匹配或滿足一些正值的閾值得分T。T稱為相鄰字段得分閾值。這些最初相鄰字 段的相似性區(qū)段（hit)作為引發(fā)搜索以找到包含該相似性區(qū)段的更長的HSPs的種子。字 段的相似性區(qū)段沿著每個序列的2個方向延伸，直至累積比對得分可以增加。對于核苷酸 序列，使用參數(shù)M(對于匹配的殘基對，給分；總是>0)和N(對于錯配的殘基，罰分；總是 〈〇)來計算累積得分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。在以下情況下，在 各方向上的字段的相似性區(qū)段的延伸被中止：當累積比對得分由其取得的最大值跌落數(shù)量 X時；當累積得分由于一個或多個負評分殘基比對的累積而達到〇或〇以下時；或者當達到 序列的任一個末端時。BLAST算法參數(shù)W，T和X測定了比對的敏感性和速度。BLASTN程序 (對于核苷酸序列）使用字段長度（W) :11、期望值（E) :10、M = 5、N = -4、和雙鏈的比較作 為缺省值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字段長度：3、期望值（E) :10,以及BL0SUM62 評分矩陣（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915, 1989)比對（B): 50、期望值（E) : 10、M = 5、N = -4、和雙鏈比較作為缺省值。
[0104] BLAST算法還對2個序列之間的相似性進行統(tǒng)計學分析（例如參見Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993)。BLAST 算法提供的相似性的一 個量度為最小合計概率（P(N))，其提供了 2條核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概 率的指示。例如如果在測試核酸與參照核酸的比較中，最小合計概率小于大約〇. 2,更優(yōu)選 的是小于大約0. 01或者最優(yōu)選的是小于大約0. 001，則認為核酸與參照序列相似。
[0105] 有用的算法的另一個實例為PILEUP。PILEUP使用漸進性成對比對由一組相關 的序列創(chuàng)建多個序列比對，以顯示關系和序列百分一致性。此外，還繪制了樹或樹形圖 (dendogram)，其示出了用于創(chuàng)建比對的聚類關系。PILEUP使用了漸進性比對方法的簡化方 法（Feng and Doolittle，J Mol Evol, 35:351-360, 1987)，其使用了與公開的方法類似的 方法（Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153,1989)。所述的程序可以比對 300 個序列， 每個序列的最大長度為5000核苷酸或氨基酸。多個比對過程開始于2個最相似序列的成 對比對，從而產生2個比對序列的聚類。然后，將該聚類與下一個最相關的序列或比對序列 的聚類比對。通過簡單地延伸2個單獨序列的成對比對來比對序列的2個聚類。通過一系 列漸進性成對比對而取得最終的比對。通過指定特定的序列以及序列比較區(qū)域的氨基酸或 核苷酸坐標并通過指定程序參數(shù)來運行程序。使用PILEUP，使用以下參數(shù)將參照序列與其 他測試序列比較，從而測定序列的百分一致性關系：缺省空位加權（3. 00)、缺省空位長度 加權（0. 10)和加權的末端空位。PILEUP可以得自可以得自GCG序列分析軟件包，例如7.0 版（Devereaux et al·，Nuc Acids Res, 12:387_395, 1984)〇
[0106] 適用于多個DNA和氨基酸序列比對的算法的另一個優(yōu)選實例為CLUSTALW程序 (Thompson et al·，Nucl Acids. Res, 22:4673-4680, 1994)。ClustalW在多組序列之間實施 多個成對比較，并基于同源性將它們集合至多個比對中?？瘴婚_放罰分和空位延伸罰分分 別為10和0. 05。對于氨基酸比對而言，BLOSUM算法可以用作蛋白質加權矩陣（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915-10919, 1992)。
[0107] 本發(fā)明公開的多核苷酸進一步這樣的多核苷酸，其編碼表4中的多肽的保守改性 的變體以及SEQS ID NO: 1-23的核酸和氨基酸序列。如本文所用，"保守改性的變體"包含 使用化學相似的氨基酸取代氨基酸的單個突變。提供功能相似的氨基酸的保守取代的表是 本領域公知的。此類保守改性的變體在本發(fā)明公開的多態(tài)性變體、種間類似物和等位基因 之外，并且不排除多態(tài)性變體、種間類似物和等位基因。以下8組包含用于彼此保守取代的 氨基酸。1.丙氨酸（A)，甘氨酸（G) ;2.天冬氨酸（D)，谷氨酸（E) ;3.天冬酰氨（N)，谷氨 酰胺（Q) ;4.精氨酸（R)，賴氨酸⑷；5.異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)，蛋氨酸（M)，纈氨酸 (V) ;6.苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W) ;7.絲氨酸（S)，蘇氨酸（T);和8.半胱氨 酸（C)，蛋氨酸（M)。
[0108] 當術語"衍生自"或"由……衍生"用于指核酸或蛋白質時，其是指該序列與所關注 的有機體的序列是一致的或基本一致的。
[0109] 當術語"相應的"用于指藍細菌時，其是指與所關注的藍細菌同屬且同種的的藍細 菌。例如關于包含編碼ALS和ALDC的重組多核苷酸的細長聚球藻，"相應的藍細菌"為缺乏 重組多核苷酸的細長聚球藻（野生型、親代或其他可比較的）。
[0110] 當術語"降低"、"減少"和"減低"用于指生物功能（例如酶活性、化合物的制備、蛋 白質的表達等）時，其是指功能可測量地減小優(yōu)選為至少10%、更優(yōu)選為至少50%、還要更 優(yōu)選為至少75%并且最優(yōu)選為至少90%。根據(jù)功能，減低可以為10%至100%。術語"基 本減低"等是指減低至少50% ,75% ,90% ,95%或100%。
[0111] 當術語"增加"、"提高"和"升高"用于指生物功能（例如酶活性、化合物的制備、 蛋白質的表達等）時，其是指功能可測量地增大優(yōu)選為至少10%、更優(yōu)選為至少50%、還要 更優(yōu)選為至少75%并且最優(yōu)選為至少90%。根據(jù)功能，升高可以為10%至100% ;或者至 少10倍、100倍或1000倍直至100倍、1000倍或10000倍更或高。術語"基本升高"等是 指升高至少 50%，75%，90%，95%或 100%。
[0112] 如本文所用，術語"分離的"和"純化的"是指與至少一種成分分離的材料，其中所 述的成分與所分離的材料是天然相關的（即與原始環(huán)境分離）。當術語"分離的"用于指生 物合成制備的化學品時，其是指已經與細菌（制備化學品）的培養(yǎng)基分離的化學品。因此， 分離的化學品不含外來的或不需要的化合物（例如基質分子、細菌成分等）。
[0113] 如本文所用，除非另作說明，單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包含復數(shù)參照物。例如 "an" ALD包含一種或多種ALD。
[0114] 如本文所用，短語"包含"是無限度的，表明此類實施方案可以包含其他的元素。相 反，短語"由......組成"是封閉性的，表明此類實施方案不包含其他的元素（除了痕量雜 質以外）。短語"基本由......組成"是部分封閉性的，表明此類實施方案可以進一步包含 不會大幅改變此類實施方案的基本特征的元素。應該理解的是本發(fā)明中以"包含"來描述 的方法和實施方案包含"由這些方面和實施方案組成"和/或"基本上由這些方面和實施方 案組成"。 實施例
[0115] 為了更好地促進對本發(fā)明公開的實施方案的理解，提供以下實施例。以下實施例 僅是示例性的，并且無意于以任何方式限定本發(fā)明公開的任何實施方案。
[0116] 簡寫：ALDC(乙酰乳酸脫羧酶）；ALS (乙酰乳酸合成酶）；sADH(仲醇脫氫酶）；和 23BD(2, 3-丁二醇）。
[0117] 實施例1-重組微生物有機體中乙偶姻和2, 3- 丁二醇的制備
[0118] 以下實施例描述了在示例性光合微生物有機體（例如細長聚球藻）中異源乙偶姻 和2, 3- 丁二醇生物合成途徑的改造，以及這些大宗化學品由二氧化碳和光能的成功制備。
[0119] 材料和方法
[0120] 試劑?；瘜W品（R, R) _2, 3-丁一醇，meso-2, 3-丁一醇，（S, S)-2, 3-丁一醇和乙 偶姻得自 Sigma_Aldrich(St· Louis, MO)。NADH 和 IPTG 得自 Fisher Scientific(Hanover Park, IL)。Phusion 聚合酶購自 NEB(Ipswich, MA)。KOD 聚合酶和 NADPH 購自 EMD4Biosciences(San Diego, CA)。慶大霉素購自 Teknova(Hollister,CA)。寡核昔酸由 Integrated DNA Technologies, Inc. (San Diego, CA)合成。
[0121] 菌株和質粒。本發(fā)明所述的菌株列于表1中，而本發(fā)明所述的質粒列于表2中。 除了 PAL60以外，所有的質粒均是使用序列和不依賴連接酶的克?。⊿LIC) (50)在E. coli XLl-Blue中構建的（Agilent Technologies, Santa Clara, CA)。用于構建和基因型證明的 引物列于表3中。
[0122] 表1 :微生物有機體菌株
【主權項】
1. 一種包含重組多核苷酸的藍細菌，其中所述的重組多核苷酸編碼了乙酰乳酸合成酶 (ALS)和乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)，其中所述的ALS和所述的ALDC的表達與相應的缺乏所述 的多核苷酸的藍細菌相比，制備的乙偶姻增加。
2. -種包含重組多核苷酸的藍細菌，其中所述的重組多核苷酸編碼了乙酰乳酸合成酶 (ALS),乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)和仲醇脫氫酶（sADH)，其中所述的ALS、所述的ALDC和所述 的sADH的表達與相應的缺乏所述的多核苷酸的藍細菌相比，制備的乙偶姻和/或2, 3- 丁 二醇（23BD)增加。
3. 權利要求1所述的藍細菌或權利要求2所述的藍細菌，其中在權利要求1所述的藍 細菌中，所述的ALS為細菌ALS，所述的ALDC為細菌ALDC或真菌ALDC;其中在權利要求2所 述的藍細菌中，所述的ALS為細菌ALS，所述的ALDC為細菌ALDC或真菌ALDC，所述的sADH 為細菌sADH或真菌sADH。
4. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的ALS為芽孢桿菌屬菌種ALS。
5. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的ALDC選自腸桿菌屬菌種ALDC，芽孢桿菌屬菌 種ALDC，氣單胞菌屬菌種ALDC，和葡糖醋桿菌屬菌種ALDC。
6. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的ALDC選自產氣腸桿菌ALDC，陰溝腸桿菌 ALDC，地衣芽孢桿菌ALDC，枯草芽孢桿菌ALDC，嗜水氣單胞菌ALDC，和木葡糖酸醋桿菌 ALDCo
7. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的sADH選自假絲酵母菌種sADH，明串珠菌屬菌 種sADH,梭菌屬菌種sADH,和高溫厭氧桿菌屬菌種sADH。
8. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的sADH選自近平滑假絲酵母sADH，假腸膜明串 珠菌sADH,拜氏梭菌sADH和布氏熱厭氧桿菌sADH。
9. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的ALS和所述的ALDC的表達、或者所述的ALS、 所述的ALDC和所述的sADH的表達由誘導型啟動子驅動。
10. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的多核苷酸穩(wěn)定地整合至所述的藍細菌的基 因組中。
11. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的藍細菌選自念珠藻屬菌種，聚球藻屬菌種， 集胞藻屬菌種和Thermosynechococcussp。
12. 權利要求11所述的藍細菌，其中所述的藍細菌為聚球藻屬菌種。
13. 權利要求12所述的藍細菌，其中所述的藍細菌為細長聚球藻細胞。
14. 權利要求3所述的藍細菌，其中在恒定光照下培養(yǎng)所述的藍細菌的結果是形成乙 偶姻和2, 3-丁二醇（23BD)的制備。
15. 權利要求3所述的藍細菌，其中在重碳酸鹽存在下培養(yǎng)所述的藍細菌的結果是形 成乙偶姻和2, 3- 丁二醇（23BD)的制備。
16. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的ALDC對氧氣基本不敏感。
17. 權利要求3所述的藍細菌，其中所述的sADH對氧氣基本不敏感，并且是NADPH依賴 的。
18. -種制備乙偶姻的方法，該方法包括： a) 提供權利要求1所述的藍細菌； b) 在包含CO2和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)所述的藍細菌，由此所述的ALS和所述的ALDC 的表達使得乙偶姻得到制備。
19. 權利要求18所述的方法，其中所述的乙偶姻的制備比在相同條件下通過培養(yǎng)相應 的缺乏所述的多核苷酸的藍細菌而產生的乙偶姻達到更高的水平。
20. -種制備2, 3- 丁二醇的方法，該方法包括： a) 提供權利要求2所述的藍細菌； b) 在包含CO2和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)所述的藍細菌，由此所述的ALS、所述的ALDC和 所述的sADH的表達使得2, 3- 丁二醇得到制備。
21. 權利要求20所述的方法，其中所述的2, 3-丁二醇的制備比在相同條件下通過培養(yǎng) 相應的缺乏所述的多核苷酸的藍細菌而產生的2, 3- 丁二醇達到更高的水平。
【專利摘要】本發(fā)明公開提供了具有乙酰乳酸合成酶活性和乙酰乳酸脫羧酶活性的重組藍細菌，以及具有乙酰乳酸合成酶活性、乙酰乳酸脫羧酶活性和仲醇脫氫酶活性的重組藍細菌。此外，還提供了重組藍細菌的制備方法，以及該藍細菌由二氧化碳和光制備乙偶姻和2,3-丁二醇的用途。
【IPC分類】C12R1-01, C12P7-26, C12P7-18, C12N1-21
【公開號】CN104822825
【申請?zhí)枴緾N201380060941
【發(fā)明人】渥美正太, J·W·K·奧利弗, I·M·P·馬查多
【申請人】加州大學評議會
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2013年9月27日
【公告號】DE112013004785T5, US20150259711, WO2014052920A2, WO2014052920A3