的alsD多核苷酸和得自近平滑假絲酵母的adh多核苷酸。在一些實(shí)施方案 中，重組多核苷酸包含得自枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得自嗜水氣單胞菌的alsD多核 苷酸和得自假腸膜明串珠菌的adh多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，重組多核苷酸包含得自 枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得自嗜水氣單胞菌的alsD多核苷酸和得自拜氏梭菌的adh 多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，重組多核苷酸包含得自枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得 自嗜水氣單胞菌的alsD多核苷酸和得自布氏熱厭氧桿菌的adh多核苷酸。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，重組多核苷酸包含得自枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得自 木葡糖酸醋桿菌的alsD多核苷酸和得自近平滑假絲酵母的adh多核苷酸。在一些實(shí)施方 案中，重組多核苷酸包含得自枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得自木葡糖酸醋桿菌的alsD 多核苷酸和得自假腸膜明串珠菌的adh多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，重組多核苷酸包含 得自枯草芽孢桿菌的alsS多核苷酸、得自木葡糖酸醋桿菌的alsD多核苷酸和得自拜氏梭 菌的adh多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，重組多核苷酸包含得自枯草芽孢桿菌的alsS多核 苷酸、得自木葡糖酸醋桿菌的alsD多核苷酸和得自布氏熱厭氧桿菌的adh多核苷酸。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的重組多核苷酸被引入至宿主有機(jī)體中。在一些 實(shí)施方案中，宿主有機(jī)體為E. coli。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主有機(jī)體為藍(lán)細(xì)菌。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，宿主有機(jī)體為細(xì)長聚球藻。將重組多核苷酸引入至宿主有機(jī)體中可以轉(zhuǎn)化宿 主，從而制備轉(zhuǎn)化的有機(jī)體。
[0075] 如本文所用，"轉(zhuǎn)化的"有機(jī)體為已經(jīng)提供有重組多核苷酸分子的那些有機(jī)體。轉(zhuǎn) 染的有機(jī)體由此不同于野生型有機(jī)體，因?yàn)樗鼈儼庠催z傳信息。通過該定義，轉(zhuǎn)染的有 機(jī)體還為重組有機(jī)體。轉(zhuǎn)染宿主有機(jī)體的方法在實(shí)施例1中詳細(xì)說明。但是，本領(lǐng)域的任 一技術(shù)人員將意識到可以存在其他的轉(zhuǎn)染方法，并且在合適的情況下可以用于本發(fā)明公開 的方法和組合物中。
[0076] 在本發(fā)明公開的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的有機(jī)體制備乙偶姻。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，轉(zhuǎn)染的有機(jī)體制備比野生型有機(jī)體更高水平的乙偶姻。在本方面公開的優(yōu)選的實(shí)施方 案中，轉(zhuǎn)染的有機(jī)體制備2, 3-丁二醇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的有機(jī)體制備比野生型 有機(jī)體更高水平的2, 3- 丁二醇。
[0077] 制備乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方法
[0078] 在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明公開中提供了制備乙偶姻的方法。所述的方法涉及 提供具有重組載體的藍(lán)細(xì)菌、從而形成轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌的步驟，其中所述的重組載體包含與 啟動子可操作地連接的乙酰乳酸合成酶（ALS)和乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)的編碼序列。所 述的方法進(jìn)一步涉及在包含CO 2和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，由此ALS和ALDC 的表達(dá)得以制備乙偶姻。
[0079] 在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明公開中提供了制備2, 3-丁二醇的方法。所述的方法 涉及提供具有重組載體的藍(lán)細(xì)菌、從而形成轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌的步驟，其中所述的重組載體包 含與啟動子可操作地連接的乙酰乳酸合成酶（ALS)、乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)和仲醇脫氫酶 (sADH)的編碼序列。所述的方法進(jìn)一步涉及在包含CO 2和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的藍(lán) 細(xì)菌，由此ALS、ALDC和sADH的表達(dá)得以制備2, 3- 丁二醇。
[0080] 在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明公開的重組多核苷酸中的乙酰乳酸合成酶編碼序 列、乙酰乳酸脫羧酶編碼序列和仲醇脫氫酶編碼序列得自細(xì)菌或真菌來源。在一些實(shí)施方 案中，乙酰乳酸合成酶（ALS)為細(xì)菌ALS或真菌ALS。在一些實(shí)施方案中，乙酰乳酸脫羧酶 (ALDC)為細(xì)菌ALDC或真菌ALDC。在一些實(shí)施方案中，仲醇脫氫酶（sADH)為細(xì)菌sADH或 真菌sADH。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，ALS為細(xì)菌來源的。在一些實(shí)施方案中，ALS為得自芽孢桿菌 屬菌種的ALS。在一些實(shí)施方案中，ALS為得自枯草芽孢桿菌的ALS。
[0082] "細(xì)菌"或"真細(xì)菌"是指原核有機(jī)體領(lǐng)域。本發(fā)明公開的重組多核苷酸和編碼序 列可以是細(xì)菌來源的。細(xì)菌包含以下至少11個(gè)不同的類：（1)革蘭氏陽性（gram+)細(xì)菌， 在該細(xì)菌中存在2個(gè)主要的亞類：（1)高G+C亞類（放線菌綱、分枝桿菌、微球菌屬等），和 (2) 低G+C亞類（芽孢桿菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬、葡萄球菌、鏈球菌、支原體屬）；(2)變 形桿菌門，例如紫色光合+非光合革蘭氏陰性細(xì)菌（包含最"普通"的革蘭氏陰性細(xì)菌）； (3) 藍(lán)細(xì)菌，例如產(chǎn)氧光養(yǎng)型；(4)螺旋菌和相關(guān)菌種；（5)浮霉?fàn)罹鷮伲?6)類桿菌屬、黃桿 菌們；（7)衣原體屬；(8)綠色硫細(xì)菌；(9)綠色非硫細(xì)菌（也稱為厭氧光養(yǎng)型）；（10)抗輻 射的微球菌和相關(guān)菌種；（11)熱袍菌和熱腔菌的嗜熱生物（例如參見US 2011/0250060)。 [0083] "真菌類"或"真菌"是指一大類真核有機(jī)體的成員，包含酵母菌、霉菌和蘑菇。真菌 類是落入真菌門類別的豐富多樣的有機(jī)體。本發(fā)明公開的重組多核苷酸和編碼序列可以是 真菌來源的。重組多核苷酸的真菌來源可以得自真菌類，包含得自Blastocladiomycetes, 壺菌，球囊菌綱，微孢子蟲門，新美鞭菌門，子囊菌，和擔(dān)子菌亞中的菌種。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，sADH為真菌sADH。在一些實(shí)施方案中，sADH為子囊菌類sADH、 厚壁菌sADH或酵母菌sADH。
[0085] 本發(fā)明公開涉及藍(lán)細(xì)菌，其為光能自養(yǎng)型細(xì)菌。光能自養(yǎng)型細(xì)菌通常為革蘭氏陰 性桿菌，其通過光合作用的過程由日光獲得它們的能量。在該過程中，日光能量用于碳水化 合物的合成中，在重組光合自養(yǎng)生物中，該碳水化合物可以進(jìn)一步用作生物燃料合成的中 間體。在其他的實(shí)施方案中，光能自養(yǎng)型生物作為非光合微生物有機(jī)體（例如重組E. coli) 使用的碳水化合物的來源，從而通過代謝改造的微生物有機(jī)體制備生物燃料。被稱為不產(chǎn) 氧光能自養(yǎng)型生物的某些光能自養(yǎng)型生物僅在厭氧條件下生長，并且既不使用水作為氫的 來源也不會由光合作用制備氧氣。其他光能自養(yǎng)型細(xì)菌為產(chǎn)氧光能自養(yǎng)生物。這些細(xì)菌 通常為藍(lán)細(xì)菌。它們使用葉綠素顏料并在類似于藻類和復(fù)雜植物的光合過程中進(jìn)行光合作 用。在該過程中，它們使用水作為氫的來源，并且制備氧氣作為光合作用的產(chǎn)物（例如參見 US 2011/0250060)〇
[0086] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開提供了藍(lán)細(xì)菌，其包含用于制備乙偶姻和2, 3-丁 二醇的重組多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，藍(lán)細(xì)菌為聚球藻屬。在一些實(shí)施方案中，聚球藻 屬為細(xì)長聚球藻。在一些實(shí)施方案中，細(xì)長聚球藻為長聚球藻PCC7942。本領(lǐng)域的任一技 術(shù)人員將意識到可以根據(jù)本發(fā)明公開使用其他的藍(lán)細(xì)菌。其他示例性藍(lán)細(xì)菌的實(shí)例包含： 海洋藍(lán)細(xì)菌，例聚球藻屬WH8102 ;耐高溫藍(lán)細(xì)菌，例如Thermosynechococcus elongatus BP-I ;光合異養(yǎng)型藍(lán)細(xì)菌，例如集胞藻屬PCC6803 ;以及絲狀藍(lán)細(xì)菌，例如念珠藻（Nostoc punctiforme)〇
[0087] 藍(lán)細(xì)菌包含多種細(xì)菌桿菌和球菌、以及某些絲狀形式。所述的細(xì)胞包含類囊體，其 為包含葉綠素的細(xì)胞質(zhì)層狀膜。有機(jī)體制備異形細(xì)胞，其為特化細(xì)胞，據(jù)信在氮化合物的固 定中發(fā)揮功能（例如參見US 2011/0250060)。
[0088] 如本文所用，"光合環(huán)境"是指其中環(huán)境條件適于使光合細(xì)胞實(shí)施光合作用的任何 環(huán)境。注意的是，此類環(huán)境包含足量的二氧化碳（CO2)和光照，從而允許光合作用發(fā)生。
[0089] 可以以多種手段向有機(jī)體提供C02。CO2天然存在于大氣中，這樣可以不必向有機(jī) 體額外地補(bǔ)充該化合物，只要有機(jī)體周圍的環(huán)境包含足量的CO 2，從而允許光合有機(jī)體實(shí)施 光合作用即可。這是優(yōu)選的，因?yàn)樵摲椒ǔチ谁h(huán)境中的CO2，并且其在大宗化學(xué)品的生物 合成中用作起始分子。
[0090] 在本發(fā)明公開的方法中使用的光照可以為任何光質(zhì)、任何光量，并且得自本領(lǐng)域 已知的足以使光合有機(jī)體進(jìn)行光合作用的任何來源。所用的光質(zhì)可以為可見光光譜內(nèi)的任 何波長（例如400nm至800nm)，或者適用于促進(jìn)光合作用的任何其他光質(zhì)。光合環(huán)境中的 光量可以為任何光量，只要該光量足以允許光合作用發(fā)生即可。適用于在本發(fā)明公開的方 法中的光量在實(shí)施例1中提供。但是，這些光量僅是示例性的，并且絕不是限定在所公開的 方法中使用的光量。本領(lǐng)域的任一技術(shù)人員可以容易地理解適用于所公開的方法中的光量 的范圍。
[0091] 光源可以得自任何發(fā)光來源，使得光照足以促進(jìn)光合有機(jī)體中的光合作用。光照 可以得自熒光燈或發(fā)光二極管。備選地，光照可以得自天然日光。任一技術(shù)人員可以容易 地理解許多不同的光源可以用于本發(fā)明公開的方法中。可行的光源在實(shí)施例1中提供，但 是這些光源僅是可能性的，并且卻不是限定用于本發(fā)明公開的方法的光源范圍。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，在恒定光照下，培養(yǎng)本發(fā)明公開的重組藍(lán)細(xì)菌的結(jié)果是制備 乙偶姻和/或2, 3- 丁二醇。任一技術(shù)人員可以容易地意識到恒定的光能是提供驅(qū)動光合 作用的光照的唯一一種方法。此外，其他的光照延續(xù)時(shí)間方案也用于本發(fā)明公開中，并且對 于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，在重碳酸鹽存在下，培養(yǎng)本發(fā)明公開的重組藍(lán)細(xì)菌的結(jié)果是 制備乙偶姻和/或2, 3-丁二醇。
[0094] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的方法制備轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，該藍(lán)細(xì)菌在相同的 條件下比缺乏所述的重組多核苷酸的對照藍(lán)細(xì)菌制備更高水平的乙偶姻。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，本發(fā)明公開的方法制備轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，該藍(lán)細(xì)菌在相同的條件下比缺乏所述的重組 多核苷酸的對照藍(lán)細(xì)菌制備更高水平的2, 3- 丁二醇。
[0095] 如本文所用，對照藍(lán)細(xì)菌是指與重組藍(lán)細(xì)菌基本相同的藍(lán)細(xì)菌，但是該對照藍(lán)細(xì) 菌缺乏在本發(fā)明公開所述的重組藍(lán)細(xì)菌的重組多核苷酸。對照藍(lán)細(xì)菌的實(shí)例包含與所述的 重組藍(lán)細(xì)菌相同菌種的野生型藍(lán)細(xì)菌。此類野生型藍(lán)細(xì)菌包含重組藍(lán)細(xì)菌的親代。其他對 照藍(lán)細(xì)菌包含攜帶本發(fā)明公開的載體的那些，但是不具有定位于載體中的重組多核苷酸。 其他類型的對照藍(lán)細(xì)菌或有機(jī)體對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0096] 檢測由有機(jī)體得到的乙偶姻和2, 3- 丁二醇濃度的示例性方法在實(shí)施例1中提供。 但是，本領(lǐng)域的任一技術(shù)人員將意識到檢測代謝物濃度的許多不同方法是已知的并予以實(shí) 施?？梢远繕悠分械囊遗家龊?或2, 3- 丁二醇濃度的任何方法都可以用于本發(fā)明公開 中。
[0097] 2,3_ 丁二醇分子具有2個(gè)不對稱碳，并因此在各立構(gòu)中心可以具有不同的手 性。在本發(fā)明公開的方法中制備的2, 3-丁二醇可以為（R，R)-2, 3-丁二醇，其可以為 (S，S) -2, 3- 丁二醇，或者其可以為meso-2, 3- 丁二醇，其中所述的分子的一個(gè)不對稱碳具 有S-構(gòu)造，并且所述的分子的一個(gè)不對稱碳具有R-構(gòu)造。
[0098] 補(bǔ)充信息
[0099] 除非另作說明，否則本發(fā)明公開的實(shí)施將使用分子生物學(xué)（包含重 組技術(shù)）、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這都是本領(lǐng) 域的技術(shù)范圍內(nèi)。此類技術(shù)將在文獻(xiàn)中充分說明，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989) ；01igonucleotide Synthesis(Gait,ed.,1984) ；Animal Cell Culture(Freshney,ed.,1987) ；Handbook of Experimental Immunology(ffeir&Blackwell, eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller&Calos,eds.,1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds. , 1987) ；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al.,eds. , 1994) ；Current Protocols in Immunology(Coligan et al.,eds. , 1991)； The Immunoassay Handbook(Wild ed. , Stockton Press NY, 1994) ；Bioconjugate Te chniques (Hermanson, ed. , Academic Press, 1996)；以及 Methods of Immunological Analysis(Masseyeff, Albert, and Staines, eds.，Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993) 〇
[0100] 在2個(gè)序列之間的百分一致性為考慮了空位的數(shù)量和各空位的長度的、序列所共 有的一致位置的數(shù)量的函數(shù)，需要引入該函數(shù)用于2個(gè)序列的最佳比對。為了進(jìn)行序列比 較，通常一個(gè)序列作為參照序列，測試序列與該序列比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測試 和參照序列輸入計(jì)算機(jī)中，如果需要，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法的程序參數(shù)。可以 使用缺省的程序參數(shù)，或者可以指定備選的參數(shù)。序列比價(jià)算法隨后根據(jù)程序參數(shù)來計(jì)算 測試序列相對于參照序列的序列百分一致性。當(dāng)比較2個(gè)序列的一致性時(shí)，序列不必是連 續(xù)的，但是任何空位都戴有罰分，其將降低總體的百分一致性。對于blastn而言，缺省的參 數(shù)為空位開放罰分=5,并且空位拓展罰分=2。對于blastp而言，缺省參數(shù)為空位開放罰 分=11，并且空位擴(kuò)增罰分=1。
[0101] 如本文所用，"比較窗"包含涉及任意一種數(shù)量的連續(xù)位置的節(jié)段，其中所述的任 意一種數(shù)量選自20至600,通常為大約50至大約200,更通常為大約100至大約150,其中 在2個(gè)序列最佳排列后，可以將序列與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參照序列比較。用于比較的 序列的比對方法是本領(lǐng)域公知的。可以使用已知的算法來實(shí)施用于比較的序列的最佳比對 (例如 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法，Adv Appl Math, 2:482, 1981 ;Needleman 和 Wunsch的同源性比對算法，J Mol Biol, 48:443, 1970 ;Pearson和Lipman的相似性搜索方 法，Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988;計(jì)算機(jī)實(shí)施的以下這些算法FASTDBdntelli genetics), BLAST(National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA, 和 TFASTA (在 Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, Madison, WI)中），或者通過人工比對和肉眼檢查）。
[0102] 適用于測定序列百分一致性和序列百分相似性的算法的優(yōu)選實(shí)例為FASTA算法 (Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988 ；and Pearson, Methods Enzym