專利名稱：轉(zhuǎn)基因光合微生物和光生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及轉(zhuǎn)基因微生物和它們培養(yǎng)的方法及裝置。背景為滿足全球增加的能源需求，要尋求化石燃料應(yīng)用的有效而環(huán)境上合理的替代方 案?？蓮闹参锷锪可a(chǎn)替代燃料，例如乙醇或生物柴油。例如，當(dāng)前方法中用于生產(chǎn)乙醇 的關(guān)鍵成分稱為可發(fā)酵糖。最常見的可發(fā)酵糖是蔗糖、葡萄糖或高果糖玉米糖漿的形式。目 前培養(yǎng)以產(chǎn)生這種生物量的植物包括玉米、甘蔗、大豆、油菜、麻風(fēng)樹(jatropha)，等等。然 而，用于產(chǎn)生可發(fā)酵糖的許多植物生物量需要大量能量密集型預(yù)處理。此外，利用這種植物 生物量會(huì)導(dǎo)致土壤耗竭、侵蝕和食物供應(yīng)的轉(zhuǎn)變。已知一些藍(lán)細(xì)菌通過蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶的作用產(chǎn)生蔗糖，其作 為滲透保護(hù)劑(osmoprotectant)而得到廣泛研究。對(duì)于鹽耐受性，藍(lán)細(xì)菌可分成三 組。耐受性低(低于700mM)的菌株合成蔗糖(例如，細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942)或稱為海藻糖的另一種二糖[Blumwald 等，Proc Natl Acd Sci USA(1983) 80 :2599-2602 和 Reed 等，F(xiàn)EMS MicrobiolRev (1986) 39 :51-56]。具有中等耐鹵 性(halotolerance) (0. 7-1. 8mM)的菌株，例如集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)PCC 6803 產(chǎn)生葡糖基甘油。甘氨酸甜菜堿(glycine betaine)或谷氨酸甜菜堿(glutamate betaine) 的累積導(dǎo)致高鹽耐受性(高達(dá)2. 5M)。然而，Miao等人[FEMS Microbiol Lett (2003) 218 71-77]測(cè)定到，當(dāng)agp基因缺失阻斷葡糖基甘油的生物合成時(shí)，集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803產(chǎn)生蔗 糖作為其滲透保護(hù)劑。干旱耐受性藍(lán)細(xì)菌在對(duì)基質(zhì)水分應(yīng)激(matric water stress)的反 應(yīng)中也產(chǎn)生蔗糖和海藻糖[Hershkovitz 等，ApplEnviron Microbiol (1991) 57 :645-648]。對(duì)集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 (ATCC 27184)和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942 (ATCC 33912) 研究較多，有遺傳學(xué)工具可用并且已知它們的基因組序列(參見，例如Koksharov^O.A.和 Wol k，C.P.2002. Appl Microbiol Biotechnol58,123-137 ；Ikeuchil, Μ.和 Satoshi Tabata, S.2001.PhotosynthesisResearch 70,73-83 ；Golden, S. S. , Brusslan, J.禾口 Haselkorn, R. 1987. Methods in Enzymology 153,215-231 ；Friedberg, D. 1988. Methods inEnzymology 167,736-747 ；Kaneko, Τ.等.1996. DNA Research 3，109—136)。許多應(yīng)用需要商品化培養(yǎng)光合微生物，所述光合微生物例如是極大螺旋藻(Spirulina maximum)、純頂螺方寵藻(Spirulina platensis)、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、布朗葡萄藻(Botrycoccus braunii)、小球藻(Chlorellavulgaris)、蛋白核小 求藻(Chlorella pyrenoidosa)、羊角月芽藻(Serenastrumcapricomutum)、四 1 }藻 (Scenedesmus auadricauda)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、急尖権藻(Scenedesmus acutus)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、項(xiàng)圈藻 (Anabaenopsis)、管鏈藻屬(Aulosira)、柱抱藻屬(Cylindrospermum)、Scenecoccus sp.、 Scenecosystis sp.和底棲藍(lán)藻(Tolypothrix)，所述應(yīng)用包括精細(xì)化學(xué)品、藥物、化妝顏 料、脂肪酸、抗氧化劑、具有預(yù)防作用的蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、抗生素、維生素和多糖的生產(chǎn)。低 劑量的藻類生物量(algic biomass)也可用于替代或降低動(dòng)物飼料中的抗生素水平或用作 蛋白質(zhì)來源。此外，可通過熱處理使得以濕潤(rùn)形式(與干燥形式相對(duì))提供的藻類生物量 發(fā)酵或液化以提供燃料。因此，增加這種有機(jī)體的培養(yǎng)效率的能力極其令人感興趣。一般而言，目前的光合生物反應(yīng)器依賴于在液相系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物以產(chǎn)生生物 量。這些系統(tǒng)通常是露天池型反應(yīng)器(open-air pond-type reactor)或封閉的罐型反應(yīng) 器(tank-type reactor)。然而，通常認(rèn)為封閉的生物反應(yīng)器在許多方面比池型反應(yīng)器有改 進(jìn)。重要的是，封閉系統(tǒng)提供了抵御環(huán)境污染的屏障。此外，這些系統(tǒng)能更好地控制液體介 質(zhì)的溫度和氣體含量。封閉的光生物反應(yīng)器的應(yīng)用仍受限于光合微生物對(duì)光的需求(即，光化射線提供 光合微生物將二氧化碳固定成有機(jī)分子所需的能量)。因此，光化微生物的充足照射是必 須滿足的要求。然而，隨著液相光生物反應(yīng)器中細(xì)胞密度的增加，光線透射入介質(zhì)的能力降 低，從而通常限制了可能達(dá)到的細(xì)胞密度。此外，為防止有機(jī)體的不良沉降，通常需要對(duì)液 體介質(zhì)作某些類型的攪拌，該過程需要能量輸入?，F(xiàn)已作了多種嘗試來設(shè)計(jì)將光線帶到液相系統(tǒng)中有機(jī)體的方法。例如，一些系統(tǒng) 包括使液體培養(yǎng)基經(jīng)透明管道循環(huán)。其它嘗試包括將光源置于介質(zhì)內(nèi)或者將反射顆粒弓I入 培養(yǎng)基以調(diào)節(jié)該培養(yǎng)物的射線吸收度(radiationabsorbance)。盡管作出了這些嘗試，但在 細(xì)胞密度較高時(shí)，液相系統(tǒng)中培養(yǎng)有機(jī)體的能力尚未達(dá)到顯著增加。除了上述對(duì)光的需求，液相光生物反應(yīng)器的應(yīng)用還需要為光合微生物提供足夠的 二氧化碳以供光合作用。這些系統(tǒng)通常整合了某些類型的額外通氣系統(tǒng)以增加溶解于介質(zhì) 的二氧化碳濃度。如果無需通氣將極大簡(jiǎn)化該系統(tǒng)，從而降低操作成本。液相光生物反應(yīng)器還往往不能良好適用于常規(guī)的連續(xù)生產(chǎn)方法。大體積液體的轉(zhuǎn) 移通常是復(fù)雜而繁重的。此外，由于液相系統(tǒng)通常需要循環(huán)、攪拌、通氣等機(jī)械裝置，只操作 一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)大型培養(yǎng)裝置而非多個(gè)較小的裝置通常更簡(jiǎn)單而且成本效率更高。因此， 目前實(shí)施的方法涉及處理較大的批次(即，培養(yǎng)一批光合微生物，然后收獲得到的所有生 物量)。因此，本領(lǐng)域極其需要推進(jìn)光合生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)。提供的新型光合生物反應(yīng)器 能有效培養(yǎng)并收獲較高密度的光合微生物而無需大量水或其它液體介質(zhì)，無需上述非常措 施來供應(yīng)充足光線和二氧化碳，并且成本合理，這代表了本領(lǐng)域的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步，并有助于工 業(yè)和消費(fèi)者，等等。發(fā)明概述本文提供經(jīng)工程改造以積累碳水化合物，例如二糖的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌。還提供了培養(yǎng)光合微生物的光生物反應(yīng)器，其包括適于為光合微生物提供營(yíng)養(yǎng)物和水分的非膠狀的固體 培養(yǎng)支持物和覆蓋該培養(yǎng)支持物表面的至少一部分的物理屏障。公開了整合有光生物反應(yīng) 器的大規(guī)模和連續(xù)培養(yǎng)光合微生物的裝置以及使用方法。還公開了利用本發(fā)明的光生物反 應(yīng)器從光合微生物產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法。一方面提供了培養(yǎng)光合微生物的光生物反應(yīng)器。該光生物反應(yīng)器包括非膠狀的 固體培養(yǎng)支持物，該支持物適于為在其表面的至少一部分上的光合微生物提供營(yíng)養(yǎng)物和水 分，其中當(dāng)該表面的所述部分非水平定位時(shí)，該表面的所述部分的形狀允許光合微生物粘 附其上；以及覆蓋該培養(yǎng)支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中該物理屏障設(shè)置成 允許接種該培養(yǎng)支持物表面的所述部分，形成并維持適于培養(yǎng)這種光合微生物和收獲這種 培養(yǎng)的光合微生物的環(huán)境。在一些實(shí)施方式中，該光生物反應(yīng)器包含在該培養(yǎng)支持物表面的所述部分上的光 合微生物。在一些實(shí)施方式中，該光生物反應(yīng)器還包含經(jīng)工程改造以累積二糖的細(xì)胞，如下 文進(jìn)一步描述，其中該細(xì)胞粘附于該固然培養(yǎng)支持物。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)支持物表 面的所述部分能以每升當(dāng)量至少約50克干生物量的密度培養(yǎng)光合微生物。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)支持物是柔性的。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)支持物包 含一種或多種剛性材料。在一些實(shí)施方式中，該光生物反應(yīng)器的培養(yǎng)支持物包含至少兩層， 第一層毗連第二層，其中所述至少兩層的材料是相同或不同的材料。在一些實(shí)施方式中，所 述第一層包含高表面積生長(zhǎng)材料，所述第二層包含可滲透的材料。在一些實(shí)施方式中，該光 生物反應(yīng)器的培養(yǎng)支持物包含柔性連接的剛性部分，其中所述剛性部分由一種或多種剛性 材料構(gòu)成。在一些實(shí)施方式中，該光生物反應(yīng)器包含單個(gè)培養(yǎng)支持物。在一些實(shí)施方式中， 該光生物反應(yīng)器包含多個(gè)培養(yǎng)支持物。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)支持物包含織物。在一些實(shí)施方式中，所述織物由天然 的、改性天然的、合成的纖維或它們的組合構(gòu)成。在一些實(shí)施方式中，所述織物是紡織織物、 編織織物、氈、交聯(lián)纖維聚合物構(gòu)成的篩網(wǎng)或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，所述天然纖 維選自棉花、羊毛、大麻纖維、樹纖維、其它纖維素纖維和它們的組合。在一些實(shí)施方式中， 所述改性天然纖維選自硝酸纖維素、醋酸纖維素、磺酸纖維素、交聯(lián)的淀粉和它們的組合。 在一些實(shí)施方式中，所述合成纖維選自聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚酰胺、聚砜和它們的組合。

在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)支持物包被有水分吸附聚合物。在一些實(shí)施方式中，所 述織物、織物的纖維或二者包被有水分吸附聚合物。在一些實(shí)施方式中，水分吸附聚合物選 自瓊脂、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚胺、聚乙二醇、改性淀粉和它們的組合。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器的物理屏障對(duì)于固體顆粒和液體至少是實(shí)質(zhì)性 不可滲透的，但不阻止氣體或蒸氣向和從培養(yǎng)支持物表面所述部分附近的空間的運(yùn)輸，也 不阻止培養(yǎng)支持物表面的所述部分的光化射線。在一些實(shí)施方式中，物理屏障對(duì)于水蒸氣 的不滲透性足夠，從而潤(rùn)濕的培養(yǎng)支持物會(huì)保留足夠的水分，因此光合微生物在培養(yǎng)期間 能維持充分的水合。在一些實(shí)施方式中，所述屏障設(shè)置成封閉培養(yǎng)支持物和其上的任何光 合微生物，并設(shè)置成能在至少光合微生物的培養(yǎng)的部分期間可松脫地密封。在一些實(shí)施方 式中，物理屏障是柔性的。在一些實(shí)施方式中，物理屏障還包含對(duì)于固體顆粒、液體、氣體和 蒸氣至少基本上不可滲透的第一部分，和對(duì)于氣體和蒸氣可滲透，但對(duì)于固體顆粒和液體至少基本上不可滲透的第二部分。在一些實(shí)施方式中，屏障的第二部分的氣體或蒸氣交換 率是至少約5葛爾萊秒(Gurley second)到不超過約10，000葛爾萊秒。在一些實(shí)施方式 中，屏障的第二部分包含選擇性膜，該選擇性膜含有烯烴纖維或聚乙烯纖維材料、聚四氟乙 烯過濾介質(zhì)、纖維素過濾材料、纖維玻璃過濾材料、聚酯過濾材料、聚丙烯酸酯過濾材料、聚 砜膜或尼龍膜。在一些實(shí)施方式中，第一部分對(duì)于光化射線至少是基本上透明的，且第二部 分對(duì)于光化射線不是至少基本上透明的，以及第一和第二部分相對(duì)于彼此和培養(yǎng)支持物表 面的至少所述部分的設(shè)置應(yīng)具有充足量的光化射線和氣體交換以支持光合微生物的光合 作用。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器還包括置于培養(yǎng)支持物和物理屏障之間的光化 射線源。在一些實(shí)施方式中，物理屏障在培養(yǎng)支持物和光化射線源之間，其對(duì)于這種光化射 線足夠透明并具有足夠的氣體透過性從而允許光合微生物在培養(yǎng)期間進(jìn)行光合作用。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器還包括在培養(yǎng)支持物上、其內(nèi)或同時(shí)在其上和 其內(nèi)的水、營(yíng)養(yǎng)物或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器還包括一個(gè)或多個(gè)連接 點(diǎn)以便連接所述光生物反應(yīng)器與某構(gòu)件。在一些實(shí)施方式中，固體培養(yǎng)支持物還包括一個(gè) 或多個(gè)連接點(diǎn)以便連接該培養(yǎng)支持物。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器還包括液體供應(yīng) 系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)系統(tǒng)、氣體供應(yīng)系統(tǒng)和微生物供應(yīng)系統(tǒng)中的至少一種。另一方面提供培養(yǎng)光合微生物的裝置。此類裝置包括至少一個(gè)上述光生物反應(yīng)器 和與所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器相連的構(gòu)件，該構(gòu)件將所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器的至少 一個(gè)培養(yǎng)支持物非水平地定位。在一些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器懸掛在該 構(gòu)件上。在一些實(shí)施方式中，物理屏障基本上覆蓋該構(gòu)件。在一些實(shí)施方式中，該構(gòu)件包括 傳送系統(tǒng)或其組件，從而所述至少一個(gè)培養(yǎng)支持物能沿著該傳送系統(tǒng)的路徑傳送。在一些 實(shí)施方式中，該裝置還包括以下的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)接種站，從而在各培養(yǎng)支持物沿著傳 送系統(tǒng)的路徑傳送時(shí)可用光合微生物接種；培養(yǎng)站，從而在各培養(yǎng)支持物沿著傳送系統(tǒng)的 路徑傳送時(shí)培養(yǎng)各接種的培養(yǎng)支持物上的光合微生物；和將培養(yǎng)支持物傳送到的收獲站， 從而可自各培養(yǎng)支持物收獲培養(yǎng)的光合微生物的至少一部分。在一些實(shí)施方式中，接種站 和收獲站基本上彼此毗連或者基本上是共存的(coextensive)。在一些實(shí)施方式中，該裝置 還包括誘導(dǎo)站以誘導(dǎo)各培養(yǎng)支持物上的光合微生物合成可發(fā)酵糖。在一些實(shí)施方式中，該 裝置還包括液體供應(yīng)系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)系統(tǒng)、氣體供應(yīng)系統(tǒng)或微生物供應(yīng)系統(tǒng)中的至少一 種。在一些實(shí)施方式中，該裝置還包括粘附于固體培養(yǎng)支持物上的光合微生物。在一些實(shí) 施方式中，該裝置還包括經(jīng)工程改造以累積二糖的細(xì)胞，如下所述，其中該細(xì)胞粘附于所述 固體培養(yǎng)支持物。另一方面提供經(jīng)工程改造以累積二糖的轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)基因光合 微生物細(xì)胞包含以5’到3’的轉(zhuǎn)錄方向操作性相連的組分在光合微生物細(xì)胞中起作用的 啟動(dòng)子；包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽選自 二糖磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶(disaccharid印hosphate phosphatase)；和轉(zhuǎn)錄終止序 列；其中與不含DNA構(gòu)建物的光合微生物細(xì)胞相比，該轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞累積的二糖 水平增高。在一些實(shí)施方式中，該轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞包含含有第一核苷酸序列和第二核 苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而所述第二核苷酸序列編碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。在一些實(shí)施方式中，其包含含有核苷 酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的 多肽。在一些實(shí)施方式中，其包含編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽的第一核苷酸序列；編 碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第二核苷酸序列；和編碼具有二糖磷酸合酶活性和二 糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第三核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，該轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞的多核苷酸選自(a)包含編碼選 自下列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性 的SEQ ID NO :2或與其95%相同的序列；具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO :4或 與其95%相同的序列；具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 6與其95%相同的 序列；具有海藻糖磷酸合酶(TPQ活性的SEQ ID NO :77或與其有95%相同的序列；具有海 藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 79或與其有95%相同的序列；具有葡糖基甘油 磷酸合酶(GPQ活性的SEQ ID NO 81或與其有95%相同的序列；具有葡糖基甘油磷酸磷 酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 83或與其有95%相同的序列；具有甘露糖基果糖磷酸合酶 (MPS)活性的SEQ ID NO :85或與其有95%相同的序列；和具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶 (MPP)活性的SEQ ID NO :87或與其有95%相同的序列；(b)分離多核苷酸，其包含編碼蔗 糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :1或與其有95%相同的序列；編碼 蔗糖磷酸合酶(SPQ活性的SEQ ID NO :3或與其有95%相同的序列；編碼蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)活性的SEQ ID NO 5或與其有95%相同的序列；編碼海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的 SEQ ID NO: 76或與其有95%相同的序列；編碼海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO: 78或與其有95%相同的序列；編碼葡糖基甘油磷酸合酶(GPQ活性的SEQID NO 80或與 其有95%相同的序列；編碼葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 82或與其有 95%相同的序列；編碼甘露糖基果糖磷酸合酶(MPQ活性的SEQ ID NO :84或與其有95% 相同的序列；和編碼甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID N0:86或與其有95% 相同的序列；(c)在嚴(yán)格條件下與選自如下的核酸序列雜交的分離多核苷酸SEQ IDNO :1, 其中該分離多核苷酸編碼具有ASF活性的多肽；SEQ ID NO :3，其中該分離多核苷酸編碼具 有SPS活性的多肽；SEQ ID NO :5，其中該分離多核苷酸編碼具有SPP活性的多肽；SEQ ID NO :76，其中該分離多核苷酸編碼具有TPS活性的多肽；SEQ ID NO :78，其中該分離多核苷 酸編碼具有TPP活性的多肽；SEQ ID NO :80，其中該分離多核苷酸編碼具有GPS活性的多 肽；SEQ ID NO :82，其中該分離多核苷酸編碼具有GPP活性的多肽；SEQ ID NO :84，其中該 分離多核苷酸編碼具有MPS活性的多肽；SEQID NO :86，其中該分離多核苷酸編碼具有MPP 活性的多肽；其中所述嚴(yán)格條件包括在65°C下，在包含6X SSC (0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬 酸鈉)的溶液中溫育；和(d)分離多核苷酸，其與(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所累積二糖的單體對(duì)于細(xì)胞是內(nèi)源性的。在一些實(shí)施方式中， 所累積二糖的一種或多種單體對(duì)于細(xì)胞是外源性的，且這些單體的表達(dá)經(jīng)工程改造進(jìn)入細(xì) 胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞、光合細(xì)菌或綠藻。在一些實(shí)施方式 中，所述細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是選自聚球藍(lán)細(xì)菌或集胞藍(lán)細(xì)菌 的藍(lán)細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子可由選自溫度、PH、代謝物、光、滲透劑、重金屬或抗生素等因素誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所 述啟動(dòng)子選自 carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA 禾Π λ ra。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞的DNA構(gòu)建物包含選自下列的核苷酸序列SEQ ID 吣19(編碼38€的？1^匕八1^11) ；SEQ ID NO :20 (編碼 asf 的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44(編 碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO 45 (編碼 asf 的 pLybAL16) ；SEQ ID NO 46 (編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO :47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO :48 (編碼 asf 的 pLybAL 19) ；SEQID NO :49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO :50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO :51(編碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO :52 (編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO :53(編 碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO 65 (編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69 (編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ ID NO :118 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO 121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO 123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :126 (編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ IDNO :130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24)；禾口 SEQ ID NO 133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞累積至少約0.1微克二糖/分鐘/克干生物量。在一些 實(shí)施方式中，細(xì)胞累積至少約0.1微克二糖/分鐘/克干生物量到多達(dá)約10微克二糖/分 鐘/克干生物量。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞不包含選自下列的核苷酸序列SEQ ID NO :70、SEQ ID N0:72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，還且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧 還蛋白(sucraseferridoxin)活性的核苷酸變體。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞不表達(dá)選 自如下的多肽序列:SEQ ID N0:71、SEQ ID NO :73和SEQ ID NO :75，或與它們有至少95% 相同，且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的多肽變體。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì) 胞表達(dá)小干擾RNA，所述小干擾RNA對(duì)選自下列的核苷酸序列有特異性SEQID NO :70、SEQ ID N0:72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧還 蛋白活性的核苷酸變體。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還包含分離多核苷酸，該多核苷酸包含編碼活性通 道蛋白多肽的SEQ ID NO :94或與其有95%相同的序列；編碼多肽的分離多核苷酸，該多 肽包含SEQ ID NO 95或與其有95%相同的序列并具有通道蛋白活性；或包含SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的pLybAL32)的分離多核苷酸；其中累積的二糖是蔗糖，該細(xì)胞表達(dá)通道 蛋白，且表達(dá)的通道蛋白將累積的蔗糖從細(xì)胞中分泌。另一方面提供人工DNA構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，人工DNA構(gòu)建物包含至少 一條選自如下的序列SEQ ID NO :19(編碼asf的pLybALll) ；SEQID NO :20 (編碼asf的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44 (編碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO :45 (編碼 asf 的 pLybAL16)； SEQ ID NO :46(編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO :47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO 48(編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID NO :49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO 50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO 51(編碼 asf 的 pLybAL 13f) ；SEQID NO 52(編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO :53(編碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO :54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO :65 (編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69 (編碼 asf 的 pLybAL8f)；SEQ ID NO 118(編碼 和 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO 121(編碼 和 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO :122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO :123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :1 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO :130(編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24) ；SEQ ID NO :133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33) ；SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的 pLybAL32) ； SEQ ID NO 102 (編碼 SS-UPP 的 pLybAL3f) ； SEQ ID NO: 103(編碼 SE-UPP 的 pLybAL5f) ； SEQ ID NO :106(編碼 SE-UPP 的 pLybAL4f) ； SEQ ID NO 107 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL9f) ； SEQ ID NO 109 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL6fb) ； SEQ ID NO: 110(編碼 SE-UPP 的 pLybALlOfb)；和 SEQ ID NO 91 (編碼通道蛋白的 pLybAL32)。另一方面提供培養(yǎng)光合微生物的方法。培養(yǎng)光合微生物的方法可利用上述的任何 光生物反應(yīng)器或裝置。該方法包括用光合微生物接種培養(yǎng)支持物；在接種的培養(yǎng)支持物上 培養(yǎng)該光合微生物；和從該培養(yǎng)支持物上收獲至少一部分培養(yǎng)的光合微生物。在一些實(shí)施 方式中，該方法還包括接種培養(yǎng)支持物后密封光生物反應(yīng)器的物理屏障，從而在培養(yǎng)光合 微生物的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分的同時(shí)維持物理屏障密封。在一些實(shí)施方式中，該物理屏障可 松脫地密封。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將各培養(yǎng)支持物輸送至接種站、培養(yǎng)站和收 獲站。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括以下的至少一種為培養(yǎng)支持物提供液體；為培養(yǎng) 支持物供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物；或?yàn)榕囵B(yǎng)支持物供氣。在一些實(shí)施方式中，光合微生物培養(yǎng)至每升當(dāng)量 至少約50克干生物量的密度。在一些實(shí)施方式中，光合微生物包含經(jīng)工程改造以累積二糖 的轉(zhuǎn)基因光合微生物，如上所述。另一方面提供產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法。產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法可利用上述任何光生物 反應(yīng)器或裝置。產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法包括用能累積可發(fā)酵糖的光合微生物接種培養(yǎng)支持 物；在接種的培養(yǎng)支持物上培養(yǎng)光合微生物；分離累積的可發(fā)酵糖。在一些實(shí)施方式中，可 發(fā)酵糖累積在光合微生物內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，分離累積的可發(fā)酵糖包括從培養(yǎng)支持物 上收獲至少一部分培養(yǎng)的光合微生物；和從收獲物回收可發(fā)酵糖。在一些實(shí)施方式中，累積 的可發(fā)酵糖從光合微生物分泌，并從培養(yǎng)基中分離。在一些實(shí)施方式中，分離累積的可發(fā)酵 糖包括從培養(yǎng)基分離累積的可發(fā)酵糖。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在接種培養(yǎng)支持 物后可松脫地密封光生物反應(yīng)器的物理屏障，從而在培養(yǎng)光合微生物的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分 的同時(shí)維持物理屏障密封。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括以下的至少一種為培養(yǎng)支持 物供應(yīng)液體；為培養(yǎng)支持物供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物；或?yàn)榕囵B(yǎng)支持物供氣。在一些實(shí)施方式中，該方法 還包括將各培養(yǎng)支持物輸送至接種站、培養(yǎng)站和收獲站中的至少一種。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括通過光合微生物誘導(dǎo)可發(fā)酵糖合成。在一些實(shí) 施方式中，誘導(dǎo)可發(fā)酵糖合成包括使光合微生物接觸選自以下的誘導(dǎo)因素溫度、PH、代謝 物、光、滲透劑、重金屬和抗生素。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)可發(fā)酵糖合成包括用鹽化合物處 理光合微生物。在一些實(shí)施方式中，鹽化合物是氯化鈉。在一些實(shí)施方式中，鹽化合物的添 加濃度是約0. OlmM-L 5M或約0. 2-0. 9M。在一些實(shí)施方式中，通過氣溶膠噴霧將誘導(dǎo)因素 施加于生長(zhǎng)表面。在一些實(shí)施方式中，將光合微生物培養(yǎng)至每升當(dāng)量至少約50克干生物量 的密度。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵糖包括選自下列的至少一種糖葡萄糖、果糖、蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵糖包括選自蔗糖或海藻糖的 至少一種糖。
在一些實(shí)施方式中，所述光合微生物包括天然光合微生物。在一些實(shí)施方式中，所 述光合微生物包括遺傳修飾的光合微生物。在一些實(shí)施方式中，所述光合微生物包括藍(lán)細(xì) 菌。在一些實(shí)施方式中，所述光合微生物包括選自聚球藍(lán)細(xì)菌或集胞藍(lán)細(xì)菌的藍(lán)細(xì)菌。在 一些實(shí)施方式中，所述光合微生物包括經(jīng)工程改造以累積二糖的轉(zhuǎn)基因光合微生物，如上 所述。從下文可部分明白并部分指出了其它目的和特征。附圖簡(jiǎn)述本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道下述附圖只是出于說明目的。附圖不是要以任何方式限制 本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。

圖1顯示本發(fā)明光生物反應(yīng)器的正視圖，包括固體培養(yǎng)支持物、透明的保護(hù)性外 屏障層、選擇面板、可再密封的閉合器和用于懸掛該裝置的支持部件。圖2顯示本發(fā)明光生物反應(yīng)器的側(cè)視圖，包括固體培養(yǎng)支持物、透明的保護(hù)性外 屏障層、選擇面板、可再密封的閉合器和用于懸掛該裝置的支持部件。圖3顯示多個(gè)本發(fā)明光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物的一種配置，這些光生物反應(yīng)器 或培養(yǎng)支持物沿著多個(gè)閉環(huán)輸送系統(tǒng)從共同的接種和收獲中心向外輻射狀擴(kuò)散，從而構(gòu)成 光生物反應(yīng)器場(chǎng)(photobioreactor farm)。圖4是描繪藍(lán)細(xì)菌中光合產(chǎn)生蔗糖的草圖。圖5是集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803(Ssp6803)蔗糖磷酸合酶(SPQ和蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)蛋白與細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942(Selo7942)活性SPS/SPP融合物(ASF)的多肽序列 比對(duì)。Ssp6803含有編碼SPS和SPP活性的不同基因。集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的SPS蛋白具 有推定的無活性SPP結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樵S多活性殘基不是保守的。經(jīng)典的HAD水解酶活性位點(diǎn) 殘基示于以上比對(duì),其中保守件氨基酸如下劃線所示和非保守件殘基則標(biāo)上雙下劃線。斜 體字顯示了集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 SPS的無活性SPP結(jié)構(gòu)域內(nèi)的八氨基酸插入。關(guān)于方法 的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例4。圖6是pLybALll的示意圖。pLybALll能構(gòu)建藍(lán)細(xì)菌DNA文庫(kù)并選擇啟動(dòng)子序列。 無啟動(dòng)子的asf基因在雙向終止子后，由多克隆位點(diǎn)(MCS)隔開。oriV能在大多數(shù)革蘭氏 陰性生物中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制。oriT能在pRK2013輔助質(zhì)粒的幫助下將大腸桿菌的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn) 移至選擇的藍(lán)細(xì)菌(或其它有機(jī)體)。存在內(nèi)酰胺酶基因(bla)以供在大腸桿菌中選 擇?？蓪⑺{(lán)細(xì)菌基因組DNA克隆入MCS而在大腸桿菌中構(gòu)建DNA文庫(kù)。然后可通過接合或 直接轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)移至藍(lán)細(xì)菌。隨后可通過氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)表達(dá)選擇 氯霉素抗性來分離活性啟動(dòng)子?？赏ㄟ^檢驗(yàn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和直接檢測(cè)蔗糖產(chǎn)量來 評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度。關(guān)于方法的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例5。圖7是pLybAL12的示意圖。pLybAL12能分析預(yù)先選擇的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)asf表達(dá)的 能力。pLybAL12和pLybALll之間的唯一差別是在氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)之前有活 性啟動(dòng)子存在?？蓪腜CR擴(kuò)增的藍(lán)細(xì)菌染色體DNA中分離的特定DNA序列克隆入MCS。 氯霉素和氨芐青霉素均可用于在大腸桿菌中選擇。然后可通過接合或直接轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒文 庫(kù)轉(zhuǎn)移至藍(lán)細(xì)菌。隨后可通過氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)表達(dá)選擇氯霉素抗性來分離攜 帶質(zhì)粒的藍(lán)細(xì)菌。可通過檢驗(yàn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和直接檢測(cè)蔗糖產(chǎn)量來評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng) 度。關(guān)于方法的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例5。
圖8是描繪構(gòu)建藍(lán)細(xì)菌啟動(dòng)子文庫(kù)的草圖。關(guān)于方法的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例8。圖9是描繪pSMART-LCKan的示意圖。關(guān)于方法的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例8。圖10是顯示細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 794hsf中可能的啟動(dòng)子的序列表。顯示的是 含有克隆到氯霉素抗性標(biāo)記上游的細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的asf基因的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。 分別以單下劃線和雙下劃線顯示編碼蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶多肽活性的asf區(qū) 域。所有DNA元件以斜體字顯示并在上方標(biāo)出。起始和終止分別表示起始和終止密碼子。 SD表示Siine-Delgarno序列。推定啟動(dòng)子的_35和-10區(qū)域以灰色突出顯示。關(guān)于方法 的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例8。圖11是描繪藍(lán)細(xì)菌基因組中基因無標(biāo)記缺失的兩步方法的示意圖。該方案假定 所用的藍(lán)細(xì)菌菌株缺失其UPP基因。UPP基因在蔗糖生物合成插入期間缺失。必須鑒定已 靶向缺失的感興趣基因。起始菌株耐受5-氟尿嘧啶，但對(duì)卡那霉素敏感。通過插入含有卡 那霉素抗性標(biāo)記和活性u(píng)pp的表達(dá)盒來完全或部分刪除該基因，從而使得該菌株耐受卡那 霉素，但對(duì)5-氟尿嘧啶敏感。然后可除去upp和卡那霉素抗性標(biāo)記，從而使得該菌株再次 對(duì)5-氟尿嘧啶耐受，但對(duì)卡那霉素敏感。關(guān)于方法的其它細(xì)節(jié)見實(shí)施例12。圖12是光生物反應(yīng)器實(shí)施方式的示意圖。圖12A是正視圖，而圖12B是側(cè)視圖。 該光生物反應(yīng)器包括懸掛元件(6)；培養(yǎng)基供應(yīng)(8)；氣體供應(yīng)(10)；生長(zhǎng)表面O)；外屏障 層(7)；快速連接器；和產(chǎn)物收獲管線(9)。圖13是單一材料形式(圖13A)和雜合材料形式(圖13B)的生長(zhǎng)表面示意圖。發(fā)明詳述本申請(qǐng)涉及可發(fā)酵糖累積性光合微生物，固相光反應(yīng)器裝置和各自的使用方法。在累積可發(fā)酵糖的光合微生物中，優(yōu)選產(chǎn)生二糖，其通常不被該光合微生物利用 因而能累積在培養(yǎng)的生物量?jī)?nèi)(例如，蔗糖、海藻糖)。在一些實(shí)施方式中，光合微生物經(jīng)遺 傳工程改造以合成通常按照滲透應(yīng)力途徑產(chǎn)生的二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，從而該糖能 在沒有滲透應(yīng)力存在下或其水平降低下產(chǎn)生。與較高等植物相比，由于培養(yǎng)光合微生物的 效率更高而環(huán)境影響更低，該方法在可持續(xù)性上相對(duì)于目前的生物燃料生產(chǎn)實(shí)踐有重要改 進(jìn)。有利的是，合成二糖的以上方法已適于在本發(fā)明光生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行。本文所述光生物反應(yīng)器利用固體培養(yǎng)支持物。有利的是，提供充足光照的困難至 少部分緩解。在光生物反應(yīng)器中利用上述固體培養(yǎng)支持物能培養(yǎng)和生長(zhǎng)光合微生物，其細(xì) 胞密度高于商業(yè)規(guī)模的液相生物反應(yīng)器(例如，細(xì)胞密度超過每升當(dāng)量200克干生物量)。 此外，與常規(guī)商業(yè)規(guī)模液相光生物反應(yīng)器相比，本文所述光生物反應(yīng)器的各種實(shí)施方式操 作起來使用更少的能源并且更簡(jiǎn)便。與常規(guī)液相光生物反應(yīng)器相比，本文所述光生物反應(yīng)器的諸實(shí)施方式提供額外的 益處。例如，液相系統(tǒng)通常需要特定的設(shè)備以遞送足夠濃度/量的二氧化碳至光合微生物 以支持它們的生長(zhǎng)和光合作用。相比之下，通過在固體培養(yǎng)支持物上培養(yǎng)微生物，可以相對(duì) 簡(jiǎn)單、成本較低的方式提供二氧化碳，例如接觸周圍的空氣。如果需要額外的二氧化碳，可 容易地通過，例如將其加入圍繞或接觸培養(yǎng)支持物的氣氛(例如，空氣)中來遞送。另一益 處是便于輸送。液相光生物反應(yīng)器可以是池(完全固定的)或大體積的槽或多個(gè)管道。相 比之下，在各種實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器是平坦而柔性的，從而能將其或多個(gè)生物反應(yīng)器 堆疊、卷起、折疊和/或以相似方式配置從而較易運(yùn)輸。在各種實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器的配置方式應(yīng)使其自某系統(tǒng)懸掛下來從而允許便于將一個(gè)或多個(gè)光生物反應(yīng)器從一個(gè)位 置輸送至另一位置。可在商業(yè)規(guī)模上利用這種便攜性，從而能采用有效方法以連續(xù)方式處 理和加工大量光生物反應(yīng)器。本申請(qǐng)一方面涉及利用光合微生物產(chǎn)生可發(fā)酵糖原料的方法?？砂l(fā)酵糖優(yōu)選可發(fā) 酵二糖?？砂l(fā)酵二糖的例子包括但不限于蔗糖和海藻糖?？砂l(fā)酵糖可以是光合微生物通常 不利用的二糖。例如，藍(lán)細(xì)菌通常不利用海藻糖，因此可累積在培養(yǎng)的生物量?jī)?nèi)而不被內(nèi)源 性代謝途徑實(shí)質(zhì)性降解。可發(fā)酵糖可以是光合微生物通?？衫玫亩恰?duì)于不用作基礎(chǔ) 能源的二糖，即使有內(nèi)源性代謝途徑存在，該二糖亦?？衫鄯e至足夠水平。如果內(nèi)源性降解 途徑是目標(biāo)可發(fā)酵糖特異性的，可工程改造該光合微生物以降低或消除這種活性。例如，可 對(duì)經(jīng)工程改造以累積蔗糖的藍(lán)細(xì)菌作進(jìn)一步改造以降低或消除蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性。在各種實(shí) 施方式中，可利用對(duì)滲透或基質(zhì)水分應(yīng)激起反應(yīng)而合成可發(fā)酵二糖的光合微生物菌株。在 其它實(shí)施方式中，光合微生物的轉(zhuǎn)基因菌株經(jīng)工程改造從而在沒有滲透應(yīng)力存在或其水平 降低情況下累積可發(fā)酵二糖。有利的是，合成可發(fā)酵二糖的前述方法可適于在本文所述光 生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行。與較高等植物相比，由于培養(yǎng)光合微生物的效率更高而環(huán)境影響更低，本文所述 的組合物、裝置和方法在可持續(xù)性上相對(duì)于目前的生物燃料生產(chǎn)實(shí)踐有重要改進(jìn)。光合微生物本文提供經(jīng)遺傳學(xué)改造以累積二糖的光合微生物。所述光合微生物可以是，例如 天然光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合細(xì)菌。累積的二糖的例 子包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在各種實(shí)施方式中，在宿主光 合微生物(例如，藍(lán)細(xì)菌)中工程改造一種或多種基因從而導(dǎo)致所需二糖的累積，所述基因 編碼負(fù)責(zé)從相應(yīng)的磷酸化單體產(chǎn)生所需二糖的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，工程改造宿主 光合微生物的內(nèi)源性途徑從而累積二糖。例如，可工程改造藍(lán)細(xì)菌中的滲透蔗糖途徑從而 在沒有滲透應(yīng)力下累積蔗糖。在一些實(shí)施方式中，在藍(lán)細(xì)菌中工程改造外源性二糖途徑從 而累積二糖。例如，可工程改造大腸桿菌的滲透海藻糖途徑以在藍(lán)細(xì)菌中累積海藻糖。合酶和磷酸酶可轉(zhuǎn)化光合微生物使之具有用于所需二糖的合酶活性和磷酸酶活性。例如，可工 程改造藍(lán)細(xì)菌使之具有蔗糖磷酸合酶活性和蔗糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍(lán) 細(xì)菌使之具有海藻糖磷酸合酶活性和海藻糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍(lán)細(xì)菌 使之具有葡糖基甘油磷酸合酶活性和葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍(lán) 細(xì)菌使之具有甘露糖基果糖磷酸合酶活性和甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性。預(yù)計(jì)可在其它 光合微生物中類似地工程改造這些活性?？山柚骰颍环N編碼具有合酶活性的多肽而另一種編碼具有磷酸酶活性的多 肽；或通過同時(shí)編碼合酶活性和磷酸酶活性的一個(gè)基因而將合酶活性和磷酸酶活性工程改 造入光合微生物。例如，合酶活性或磷酸酶活性可存在于融合多肽中。所需二糖的單體糖可以是光合微生物內(nèi)源性或外源性的。如果所需二糖的單體糖 是內(nèi)源性的，可工程改造該光合微生物以產(chǎn)生水平升高的這種單體。如果所需二糖的單體 糖是外源性的，可工程改造該光合微生物以產(chǎn)生這種外源性單體?？晒こ谈脑旃夂衔⑸飶亩谝欢òl(fā)育階段后，或經(jīng)誘導(dǎo)后連續(xù)合成和累積所需二糖。根據(jù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的作用，誘導(dǎo)二糖合成可與本文進(jìn)一步詳細(xì)討論的所編碼的合酶 或磷酸酶和誘導(dǎo)劑相關(guān)。在一些實(shí)施方式中，本文所述的轉(zhuǎn)化藍(lán)細(xì)菌可累積每分鐘每克干生物量至少約 0.1微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn) 化的藍(lán)細(xì)菌可累積每分鐘每克干生物量至少約0. 1到高達(dá)約10微克二糖(例如，蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌可累積每分鐘每克干生物量至少 約0. 2、至少約0. 3、至少約0. 4、至少約0. 5、至少約0. 6、至少約0. 7、至少約0. 8、或至少約 0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在其它實(shí)施方式中，各 種轉(zhuǎn)化的光合微生物累積相似量的二糖。預(yù)計(jì)各種實(shí)施方式將累積以上限定的數(shù)值范圍內(nèi)的二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡 糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，一些轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌可累積每分鐘每克干生物量至少約 0.1到高達(dá)約0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每 克干生物量至少約0. 1到高達(dá)約0. 8微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖 基果糖)；每分鐘每克干生物量至少約0.1到約0.7微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基 甘油或甘露糖基果糖)，等等。類似地，一些轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌可累積每分鐘每克干生物量至少 約0.2到高達(dá)約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘 每克干生物量至少約0. 3到高達(dá)約1. 0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露 糖基果糖)；每分鐘每克干生物量至少約0.4到高達(dá)約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、 葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克干生物量至少約0. 5到高達(dá)約1. 0微克二糖(例 如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克干生物量至少約0. 6到高達(dá)約 1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克干生物量至 少約0.7到高達(dá)約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分 鐘每克干生物量至少約0. 8到高達(dá)約1. 0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘 露糖基果糖)；或每分鐘每克干生物量至少約0.9到高達(dá)約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。測(cè)定宿主細(xì)胞中糖累積的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的(參見，例如實(shí)施例10)。宿主經(jīng)遺傳工程改造以累積二糖的宿主可以是任何光合微生物。所述光合微生物可以 是，例如天然光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合細(xì)菌。天然具有 光合作用或經(jīng)工程改造具有光合作用的示范性微生物包括但不限于細(xì)菌；真菌；古細(xì)菌； 原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動(dòng)物，例如浮游生物、渦蟲(planarian)和變形蟲。天然 光合微生物的例子包括但不限于極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏藻、布朗葡萄藻、小球 藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、斜生柵藻、項(xiàng)圈藻、管 鏈藻屬、柱孢藻屬、Scenecoccus sp.、Scenecosystis sp.禾口 /或底棲藍(lán)藻。宿主光合微生物優(yōu)選藍(lán)細(xì)菌。藍(lán)細(xì)菌也稱為藍(lán)-綠藻，其是廣泛的產(chǎn)氧光自 養(yǎng)生物。宿主藍(lán)細(xì)菌可以是藍(lán)藻門的任何光合微生物。宿主藍(lán)細(xì)菌可以是單細(xì)胞或菌 落(例如，絲狀、片狀或球狀)形態(tài)。宿主藍(lán)細(xì)菌優(yōu)選是單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌?？晒こ谈脑?以累積二糖的藍(lán)細(xì)菌的例子包括但不限于以下屬集胞藍(lán)細(xì)菌、聚球藍(lán)細(xì)菌、熱聚球藍(lán) 細(xì)菌(Thermosynechococcus)、念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc)、原綠球藻(Prochlorococcu)、微囊藍(lán)細(xì)菌(Microcystis)、魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena)、螺旋藍(lán)細(xì)菌(Spirulina)和粘桿菌 (Gloeobacter)。宿主藍(lán)細(xì)菌優(yōu)選集胞藍(lán)細(xì)菌或聚球藍(lán)細(xì)菌。宿主藍(lán)細(xì)菌更優(yōu)選細(xì)長(zhǎng)聚球 藍(lán)細(xì)菌 PCC 7942 (ATCC 33912)和 / 或集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC 6803 (ATCC 27184)。蔗糖可通過依次起作用的兩種酶活性，蔗糖磷酸合成酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)的催化作用實(shí)現(xiàn)在光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌中生物合成蔗糖(參見，例如圖4)。這 種活性存在于適應(yīng)滲透和基質(zhì)水分應(yīng)激的一些藍(lán)細(xì)菌(參見，例如Lurm，J. Ε. 2002. Plant Physiol 128,1490-1500)?？稍谒{(lán)細(xì)菌中工程改造這些活性之一或二者從而導(dǎo)致蔗糖累 積。工程改造光合微生物以累積蔗糖的特別感興趣的基因是細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的活性sps/spp融合(asf)基因。Asf具有sps和spp生物合成功能(參見，例如實(shí) 施例4)。在一些實(shí)施方式中，ASF-編碼核苷酸序列從其天然來源(例如細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC 7942)克隆，并插入宿主藍(lán)細(xì)菌(參見，例如實(shí)施例4-9)。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的 宿主光合微生物包含SEQ ID NO :1所示asf多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，用編碼SEQ ID NO 2所示ASF多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化光合微生物。在另外的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的宿主光合 微生物包含與SEQ ID NO :1有至少約80%序列同一性的核苷酸序列或編碼具有sps和spp 活性并與SEQ ID NO :2有至少約80%序列同一性的多肽的核苷酸序列。例如，轉(zhuǎn)化的宿主 光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌可包含與SEQ ID NO :1有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)化的宿主顯示ASF、SPS和/或SPP活性和 /或累積蔗糖。例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :2有至少約85%、至 少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)化的宿 主顯示ASF、SPS和/或SPP活性和/或累積蔗糖。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含 在嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下在SEQ ID NO 1的全長(zhǎng)上與SEQ ID NO 1雜交的核苷酸序列，該核苷 酸序列編碼活性SPS/SPP融合(ASF)多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含任何上 述序列的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，蔗糖磷酸合酶(sps)(參見，例如SEQ ID NO :3編碼sps基因， SEQ ID NO :4編碼SPS多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中表達(dá)或過量 表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :3所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，從而表達(dá)蔗糖磷 酸合酶。再例如，可用與SEQ IDNO :3具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，所述SEQ ID NO :3編碼具有 蔗糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQID NO :4具有至少 約85 %、至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所 述轉(zhuǎn)化的宿主顯示SPS活性和/或累積蔗糖。在一些實(shí)施方式中，蔗糖磷酸磷酸酶(spp)(參見，例如SEQ ID NO 5編碼spp基 因和SEQ ID NO :6編碼SPP多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中表達(dá)或 過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌，從 而表達(dá)蔗糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO: 5具有至少約80%、至少約85%、至少 約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，所述SEQ ID NO :5編碼具有蔗糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :6具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多 肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示SPP活性和/或累積蔗糖。在一些實(shí)施方式中，光合微生物經(jīng)工程改造以表達(dá)ASF、SPS和/或SPP中的一種 或多種。例如，可工程改造光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌，以表達(dá)ASF和SPS ；ASF和SPP ；SPS和 SPP ；或 ASF、SPS 禾口 SPP0海藻糖可通過依次起作用的兩種酶活性，海藻糖磷酸合成酶(tps)和海藻糖磷酸磷酸酶 (tpp)的催化作用實(shí)現(xiàn)生物合成海藻糖。可在光合微生物中工程改造這些活性之一或二者 從而導(dǎo)致海藻糖累積。一些光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌中天然不發(fā)生海藻糖的生物合成。在一些實(shí)施方式中，海藻糖磷酸合酶(tps)(參見，例如SEQ ID NO :76編碼tps基 因，SEQ ID NO :77編碼TPS多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中表達(dá)或 過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :76所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌， 從而表達(dá)海藻糖磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :76具有至少約80%、至少約85%、 至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，所述SEQ ID NO :76編碼具有海藻糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含編碼與 SEQ ID NO :77具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多 肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示TPS活性和/或累積海藻糖。在一些實(shí)施方式中，海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)(參見，例如SEQ ID NO 78編碼tpp 基因，SEQ ID NO :79編碼TPP多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中表達(dá) 或過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :78所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán)細(xì)菌， 從而表達(dá)海藻糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :78具有至少約80%、至少約85%、 至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，所述SEQ ID NO :78編碼具有海藻糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物可包含 編碼與SEQ ID NO :79具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一 性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示TPP活性和/或累積海藻糖。葡糖基甘油在一些實(shí)施方式中，葡糖基甘油磷酸合酶(gps)(參見，例如SEQ ID NO 80編碼 gps基因，SEQ ID NO 81編碼GPS多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中 表達(dá)或過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :80所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán) 細(xì)菌，從而表達(dá)葡糖基甘油磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :80具有至少約80%、至少 約85 %、至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物， 所述SEQ ID NO :80編碼具有葡糖基甘油磷酸合酶的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物 可包含編碼與SEQ ID NO :81具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序 列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示GPS活性和/或累積葡糖基甘油。在一些實(shí)施方式中，葡糖基甘油磷酸磷酸酶(gpp)(參見，例如SEQ IDNO 82編碼 gpp基因，SEQ ID NO 83編碼GPP多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中 表達(dá)或過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :82所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán) 細(xì)菌，從而表達(dá)葡糖基甘油磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :82具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，所述SEQ ID NO :82編碼具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿 主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :83具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示GPP活性和/或累 積葡糖基甘油。甘露糖基果糖在一些實(shí)施方式中，甘露糖基果糖磷酸合酶(mps)(參見，例如SEQ IDNO 84編碼 mps基因，SEQ ID NO 85編碼MPS多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物中 表達(dá)或過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :84所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán) 細(xì)菌，從而表達(dá)甘露糖基果糖磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :84具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微 生物，所述SEQ ID NO :84編碼具有甘露糖基果糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿主光 合微生物可包含編碼與SEQ ID NO 85具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少 約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示MPS活性和/或累積甘 露糖基果糖。在一些實(shí)施方式中，甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(mpp)(參見，例如SEQ IDNO 86編 碼mpp基因，SEQ ID NO 87編碼MPP多肽)或其同源物經(jīng)工程改造而在轉(zhuǎn)化的光合微生物 中表達(dá)或過量表達(dá)。例如，可用具有SEQ ID NO :86所示序列的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微生物，如藍(lán) 細(xì)菌，從而表達(dá)甘露糖基果糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :86具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉(zhuǎn)化光合微 生物，所述SEQID NO :86編碼具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉(zhuǎn)化的宿 主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :87具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主顯示MPP活性和/或累 積甘露糖基果糖。分子工程改造本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計(jì)、制備和檢驗(yàn)與asf序列具有以上所需同一性百分比并保 留所表達(dá)蛋白質(zhì)的所需活性和/或糖累積表型的變體核苷酸和它們編碼的多肽。例如，可 根據(jù)參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行突變體的定向進(jìn)化和快速分離，所述參考文獻(xiàn)包括但不限于 Link 等· (2007) Nature Reviews 5 (9)，680-688 ；Sanger 等.(1991) Gene 97 (1)，119-123 ； Ghadessy 等.Q001)Proc Natl AcadSci USA 98 (8) 4552-4557。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能制 備大量與本文所述參比序列具有，例如至少95-99%同一性的核苷酸(例如，asf、sps、spp、 tps、tpp、gps、gpp、mps 或 mpp)和 / 或多肽(例如，ASF、SPS、SPP、TPS、TPP、GPS、GPP、MPS 或MPP)變體，并根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法從其中篩選包括二糖累積在內(nèi)的表型。通?？稍谌?何位置作出保守性取代，只要能保留所需活性。核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(％ )應(yīng)理解為當(dāng)比對(duì)兩條序列時(shí)，相比于 參比序列，與候選序列中的核苷酸或氨基酸殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基百分比。為測(cè) 定同一性百分比，可比對(duì)序列，且如果需要，可引入空位以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比。測(cè) 定同一性百分比的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？衫霉姵？捎玫挠?jì)算機(jī)軟 件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)軟件比對(duì)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 決定檢測(cè)比對(duì)的合適參數(shù)，包括在所比較序列的全長(zhǎng)獲得最大比對(duì)所需的任何算法。比對(duì)序列時(shí)，給定序列A與給定序列B的序列同一性百分比(或可表述成與給定序列B具有或 包含與給定序列A的一定序列同一性百分比)可計(jì)算為序列同一性百分比=X/Y100，其 中X是通過比對(duì)A和B的序列比對(duì)程序或算法評(píng)分為相同匹配的殘基數(shù)，Y是B中的殘基總 數(shù)。如果序列A的長(zhǎng)度不等于序列B的長(zhǎng)度，A相對(duì)于B的序列同一性百分比不等于B相 對(duì)于A的序列同一性百分比?！案邍?yán)謹(jǐn)性雜交條件”定義為在65°C，在6Χ SSC緩沖液(即，0.9M氯化鈉和 0.09M檸檬酸鈉)中雜交。在這些條件下，通過計(jì)算兩條序列之間的DNA雙螺旋的解鏈 溫度(Tm)可測(cè)定給定的一組序列是否會(huì)雜交。如果在6XSSC的鹽條件下，特定雙螺旋的 解鏈溫度低于65°C，則兩條序列不會(huì)雜交。另一方面，如果相同鹽條件下的解鏈溫度高 于65°C，則序列會(huì)雜交。通?？衫孟率綔y(cè)定任何雜交的DNA:DNA序列的解鏈溫度Tm = 81. 5°C +16. 6 (Iog10 [Na+]) +0. 41 (G/C 含量分?jǐn)?shù))-0. 63(% 甲酰胺)-(600/1)。此外，核苷酸 同一性每降低1%, DNADNA雜交體的Tm降低1-1. 5°C (參見，例如Sambrook和Russel， 2006)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見，例如Sambrook和 Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分 子克隆的精簡(jiǎn)方案實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，ISBN-IO :0879697717 ；Ausubel ^ . (2002) Short Protocols in MolecularBiology (分子生物學(xué)簡(jiǎn)便方案)，第 5 版， Current Protocols (最新方案)，ISBN-10 :0471250929 ;Sambrook 和 Russel (2001) Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室 出版社，ISBN-10 :0879695773 ；Elhai, J.和 Wolk，C. P. 1988. Methods in Enzymologyl67, 747-7 )。此類技術(shù)包括但不限于病毒感染、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微量注射介 導(dǎo)的遞送、受體介導(dǎo)的攝取、細(xì)胞融合、電穿孔等。可選擇和繁殖轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以提供包含穩(wěn) 定整合入宿主細(xì)胞基因組的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子可將上述核苷酸序列中(^i^[J,asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)的一
種或多種操作性連接于可在宿主光合微生物中起作用的啟動(dòng)子。如果宿主是藍(lán)細(xì)菌，啟動(dòng) 子最好可在藍(lán)細(xì)菌和細(xì)菌，例如大腸桿菌中有效起作用。啟動(dòng)子選擇能在各種條件下表達(dá) 所需的基因產(chǎn)物。可在其中插入載體構(gòu)建物的光合微生物宿主細(xì)胞，例如藍(lán)細(xì)菌中選擇起最佳作用 的啟動(dòng)子。還可根據(jù)它們的調(diào)節(jié)特征選擇啟動(dòng)子。此類特征的例子包括轉(zhuǎn)錄活性和可誘導(dǎo) 性升高。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，可根據(jù)溫度、pH、激素、代謝物(例如，乳糖、甘 露糖、氨基酸)、光(例如，波長(zhǎng)特異性的)、滲透勢(shì)(例如，鹽誘導(dǎo)的)、重金屬或抗生素誘導(dǎo) 啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。例如，λ啟動(dòng)子是可在藍(lán)細(xì) 菌中起作用的溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。令人意外的是，λ啟動(dòng)子起作用的溫度不同于當(dāng)其在 大腸桿菌中起作用時(shí)的溫度。在大腸桿菌中，λ啟動(dòng)子在42°C最有活性，該溫度高于藍(lán)細(xì) 菌的正常存活范圍。一般而言，在大腸桿菌中，約30°C-35°C時(shí)，λ啟動(dòng)子的表達(dá)增加約 5% -10%，約37°C時(shí)，表達(dá)增加約20% ；但在約37°C _42°C，表達(dá)增加約100%。在藍(lán)細(xì)菌中，λ啟動(dòng)子在約30°C _35°C最有活性，其是藍(lán)細(xì)菌的理想生長(zhǎng)溫度范圍，并且該范圍遠(yuǎn)低 于λ啟動(dòng)子在大腸桿菌中的最佳表達(dá)。因此，λ啟動(dòng)子在藍(lán)細(xì)菌中提供二糖生物合成活 性的有效表達(dá)?？刹迦胭|(zhì)粒的啟動(dòng)子的例子包括但不限于carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA和 λ ΡΚ(參見，例如實(shí)施例6)。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可在藍(lán)細(xì)菌和大腸桿菌中有效起作 用。在一些實(shí)施方式中，asf編碼區(qū)包含啟動(dòng)子及所述編碼區(qū)(參見，例如實(shí)施例8)。例 如，asf編碼區(qū)可在asf的SPP結(jié)構(gòu)域之前包含啟動(dòng)子(參見，例如圖10)。這種內(nèi)部啟動(dòng) 子可在asf編碼區(qū)起點(diǎn)處攜帶或不攜帶啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“嵌合的”應(yīng)理解為指兩個(gè)或更多個(gè)不同多核苷酸分子的部分的融合產(chǎn)物。 “嵌合啟動(dòng)子”應(yīng)理解為指通過操作已知啟動(dòng)子或其它多核苷酸分子產(chǎn)生的啟動(dòng)子。例如， 可通過融合第一啟動(dòng)子的異源增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域與第二啟動(dòng)子及其自身的部分或完整調(diào)節(jié)元 件，從而將此類嵌合啟動(dòng)子與可賦予或調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件的基因表達(dá)的增 強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域組合。因此，本發(fā)明包括按照本文公開的方法設(shè)計(jì)、構(gòu)建和利用嵌合啟動(dòng)子以調(diào) 節(jié)操作性連接的多核苷酸序列的表達(dá)?？赏ㄟ^多種方法設(shè)計(jì)或工程改造新型嵌合啟動(dòng)子。例如，可通過融合第一啟動(dòng)子 的增強(qiáng)子與第二啟動(dòng)子來產(chǎn)生嵌合啟動(dòng)子。相對(duì)于該第一或第二啟動(dòng)子，得到的嵌合啟動(dòng) 子可具有新型表達(dá)特性?？蓸?gòu)建新型嵌合啟動(dòng)子使得第一啟動(dòng)子的增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域融合在第 二啟動(dòng)子5’端、3’端或內(nèi)部任何位置。構(gòu)建物可在構(gòu)建物中提供任何上述可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子序列。本發(fā)明構(gòu)建物通常包含在 宿主光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌中起作用的，操作性連接于上述二糖生物合成的可轉(zhuǎn)錄多核 苷酸分子(^iJ$n，asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)，^iJ$nSEQ ID N0:l、3、5、76、 78、80、82、84和86所示及其變體的啟動(dòng)子。示范性啟動(dòng)子如上所述。還可在重組構(gòu)建物中提供一個(gè)或多個(gè)額外的啟動(dòng)子。這 些啟動(dòng)子可操作性與上述任何可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子序列連接。術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建物”應(yīng)理解為指任何重組多核苷酸分子，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù) 制的多核苷酸分子、噬菌體、或線形或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，它們衍 生自任何來源，能進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制并包含多核苷酸分子，其中一個(gè)或多個(gè)多核 苷酸分子已按照功能上的操作性方式連接，即操作性連接。術(shù)語(yǔ)“載體”或“載體構(gòu)建物”應(yīng) 理解為指可為轉(zhuǎn)化目的使用的任何重組多核苷酸構(gòu)建物，即，將異源DNA引入宿主光合微 生物，例如藍(lán)細(xì)菌中。此外，構(gòu)建物可包括但不限于來自感興趣基因的非翻譯區(qū)的額外多核苷酸分子。 這些額外的多核苷酸分子可衍生自相對(duì)于構(gòu)建物中存在的其它元件為天然或異源的來源。質(zhì)粒在一些實(shí)施方式中，用基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化宿主光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌 (參見，例如實(shí)施例幻。編碼感興趣基因的質(zhì)粒優(yōu)選包含啟動(dòng)子，例如上述那些中的一個(gè)或 多個(gè)。對(duì)于基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選能在大腸桿菌和藍(lán)細(xì)菌中起作用的宿主范圍廣的質(zhì)粒，該 質(zhì)粒提供在能有效轉(zhuǎn)移入最終宿主(藍(lán)細(xì)菌)的方便快速生長(zhǎng)熟知系統(tǒng)(大腸桿菌)中起 作用的優(yōu)勢(shì)。在一些實(shí)施方式中，可聯(lián)用基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和染色體整合，其中質(zhì)粒方案用于設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)基因變體，然后進(jìn)行所鑒定變體的染色體整合。可通過本領(lǐng)域已知的許多方法(參見，例如Mudier (2005) Protein ExprPurif. 41(1), 207-234 ;Gellissen 編，(2005)Production of RecombinantProteins Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems (重組蛋白生產(chǎn)新型微生物和 真核表達(dá)系統(tǒng))，ffiley-VCH, ISBN-IO :3527310363 ；Baneyx (2004) Protein Expression ^Technologies (蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù))，Taylor 和 Francis，ISBN-10 :0954523253)評(píng)估按照本 文所述方法開發(fā)的宿主菌株。本文提供用于編碼sps、spp和/或asf的質(zhì)粒構(gòu)建物的核苷酸序列。編碼sps、 spp和/或asf的質(zhì)粒構(gòu)建物的例子包括但不限于=PLybALll (SEQ ID NO 19)(參見，例如 圖6)和pLybAL12(SEQ ID NO :20)(參見，例如圖7)。本文還提供用于編碼tps和tpp的質(zhì) 粒構(gòu)建物的核苷酸序列。編碼tps和tpp的質(zhì)粒構(gòu)建物的例子包括但不限于PLybAL23 (SEQ ID NO :118)。技術(shù)人員應(yīng)知道可為累積其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的 生物合成基因制備類似構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物包含pLybALll (SEQ ID N0:19)或 pLybAL12(SEQ ID NO :20)。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物包含pLybAL23 (SEQ ID NO :118)。例如，轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌可包含 pLybALll(SEQ ID NO 19)、pLybAL12 (SEQ ID NO: 20)或 pLybAL23(SEQ ID NO :118)。包含二糖生物合成基因的質(zhì)粒構(gòu)建物還可包含啟動(dòng)子。包含sps、spp和/或 asf及啟動(dòng)子的質(zhì)粒構(gòu)建物的例子包括但不限于pLybAL7f (SEQ ID NO :65) ；pLybAL8f, 包含卡那霉素抗性(SEQ ID NO 69) ；pLybAL13f (SEQ IDNO 51), pLyAL13r(SEQ ID NO: 52), pLybAL14f (SEQ ID NO :53)，pLybAL14r(SEQ ID NO :54)，pLybAL15(SEQ ID NO: 44), pLybAL16(SEQ ID NO :45)，pLybAL17(SEQ ID NO :46)，pLybAL18(SEQ ID NO :47)， pLybAL19(SEQ ID NO :48)，pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL22(SEQ ID NO :50)。包 含tps和tpp及啟動(dòng)子的質(zhì)粒構(gòu)建物的例子包括但不限于PLybAL23 (SEQ ID NO :118)、 pLybAL28(SEQ ID NO :121)、pLybAL29(SEQ ID NO :122)和 pLybAL30(SEQ ID NO :123)。技 術(shù)人員應(yīng)知道可為累積其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的生物合成基因制 備類似的含啟動(dòng)子構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的宿主藍(lán)細(xì)菌包含pLybAL7f(SEQ ID NO :65)；
pLybAL8f(SEQIDNO :69) ；pLybAL13f(SEQIDNO51)，pLyAL13r(SEQIDNO:52),pLybAL14f(SEQIDNO53)，pLybAL14r(SEQIDNO54)，pLybAL15(SEQIDNO:44),pLybAL16(SEQIDNO45)，pLybAL17(SEQIDNO 46)，pLybAL18(SEQIDNO:47),
pLybAL19 (SEQ ID NO :48)，pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL22 (SEQ ID NO :50)。在一 些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的宿主藍(lán)細(xì)菌包含pLybAL28(SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO: 122)、pLybAL30(SEQ ID NO :123)和 pLybAL23(SEQ ID NO :118)。糖分泌在各種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的二糖累積的光合微生物可將累積的二糖自細(xì)胞內(nèi)分泌 入其生長(zhǎng)環(huán)境。二糖分泌可以是轉(zhuǎn)化光合微生物以累積二糖的固有作用，或者可進(jìn)一步工 程改造光合微生物以分泌二糖。例如，經(jīng)轉(zhuǎn)化以累積海藻糖的一些藍(lán)細(xì)菌本身從細(xì)胞中分 泌海藻糖(參見，例如實(shí)施例19-20)。再例如，可進(jìn)一步工程改造經(jīng)轉(zhuǎn)化以累積蔗糖的藍(lán)細(xì)菌以從細(xì)胞中分泌蔗糖(參見，例如實(shí)施例16)?？蛇M(jìn)一步工程改造宿主光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌以分泌二糖。在一些實(shí)施方式 中，轉(zhuǎn)化的宿主光合微生物經(jīng)工程改造以表達(dá)所累積二糖特異性的通道蛋白。例如，可進(jìn) 一步工程改造經(jīng)工程改造以累積蔗糖的藍(lán)細(xì)菌，從而表達(dá)蔗糖通道蛋白(參見，例如實(shí)施 例16)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的二糖累積性藍(lán)細(xì)菌包含scrY核酸，例如SEQ ID NO 94。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的二糖累積性藍(lán)細(xì)菌包含編碼scrY多肽，例如SEQ ID NO: 95的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的二糖累積性藍(lán)細(xì)菌包含含有scrY的質(zhì)粒，例如 pLybAL32(SEQ ID NO :91)。預(yù)計(jì)類似的方法可應(yīng)用于其它光合微生物或其它靶二糖。糖降解的調(diào)節(jié)在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步工程改造宿主光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌，通過調(diào)節(jié)降解 活性以提高二糖產(chǎn)量(參見，例如實(shí)施例14)。在一些實(shí)施方式中，可下調(diào)或消除轉(zhuǎn)化的光 合微生物中的轉(zhuǎn)化酶同源物。例如，可下調(diào)或消除轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌中集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的 轉(zhuǎn)化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO 70 ；多肽序列SEQ ID NO 71)。再例如，可下調(diào)或消 除轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌中細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的轉(zhuǎn)化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO 72 ； 多肽序列SEQ ID NO :73)。在一些實(shí)施方式中，下調(diào)或消除轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌中蔗糖酶鐵氧還蛋 白-樣蛋白。例如，可下調(diào)或消除轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌中集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的蔗糖酶鐵氧還蛋 白-樣蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO 74 ；多肽序列SEQ ID NO 75) (Machray G. C.等.1994. FEBS Lett 354,123-127).可采用，例如圖11所述的無標(biāo)記缺失方案(參見，例如實(shí)施例 12-13)刪除這些基因。經(jīng)工程改造以在藍(lán)細(xì)菌中累積的其它二糖可采取類似的方法。本領(lǐng)域已知下調(diào)以上基因或使之沉默的其它方法。例如，可利用反義寡核 苷酸、蛋白質(zhì)適配體、核苷酸適配體和RNA干擾(RNAi)(例如，小干擾RNA(siRNA)、短 發(fā)夾 RNA(shRNA)禾口 微小 RNA (miRNA)(參見，例如 Fanning 禾口 Symonds Q006) Handb Exp Pharmacol. 173，289-303G，描述 了錘頭核酶和小發(fā)夾 RNA ;Helene，C.等，(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 ；Maher (1992)Bioassays 14(12) :807-15,描述 了靴向 脫氧核糖核苷酸序列；Lee等.Q006)Curr Opin Chem Biol. 10，1-8，描述了適配體； Reynolds 等，Q004)Nature Biotechnology 22 (3)，3洸_330，描述了 RNAi ;Pushparaj 和 Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33 (5-6), 504-510，描述了 RNAi ;Dillon 等.Q005) Annual Review of Physiology 67，147_173，描 述了 RNAi ;Dykxhoorn 禾口 Lieberman (2005) Annual Review ofMedicine 56，401—423，描述 了 RNAi)下調(diào)或消除二糖降解活性。RNAi分子可商品化購(gòu)自各種來源(例如，德克薩斯州 安變公司(Ambion，TX)；密蘇里州西格瑪阿爾德里奇公司(Sigma Aldrich, M0)；英杰公司 (Invitrogen)) 0采用各種算法的幾種siRNA分子設(shè)計(jì)程序是本領(lǐng)域已知的(參見，例如 Cenix 算法，安變公司；BLOCK-iT RNAi Designer，英杰公司；siRNAWhitehead Institute Design !"ools，生物信息學(xué)和研究計(jì)算公司(Bioinofrmatics&Research Computing))。確 定最佳siRNA序列的特性影響包括siRNA末端的G/C含量、siRNA的特定內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的Tm、 siRNA長(zhǎng)度、CDS(編碼區(qū))內(nèi)靶序列的位置和3’突出端的核苷酸含量。在一些實(shí)施方式中，可進(jìn)一步工程改造宿主光合微生物以促進(jìn)二糖從細(xì)胞中分 泌。例如，可進(jìn)一步工程改造藍(lán)細(xì)菌以促進(jìn)蔗糖從細(xì)胞中分泌(參見，例如實(shí)施例15-16)。 處于低滲環(huán)境時(shí)，蔗糖可從細(xì)胞中自動(dòng)除去，如一些生物從高鹽轉(zhuǎn)入低鹽環(huán)境時(shí)滲透保護(hù)劑所作的那樣(Schleyer, M.，Schmidt, R.和 Bakker，E. P. 1993. Arch Microbiol 160， 424-43 ；Koo, S. P.，Higgins, C. F.和 Booth, I. R. 1991. J Gen Microbiol 137，2617-2625 ； Lamark, Τ.，Styrvold,0.B.和 Strgim, A. R. 1992. FEMS Microbiol. Lett 96，149-154)?？?工程改造蔗糖通道蛋白使之在轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)(參見，例如實(shí)施例16)?？砂凑丈鲜黾?術(shù)克隆這些基因并轉(zhuǎn)化入藍(lán)細(xì)菌。這些方法可適用于其它光合微生物。在一些實(shí)施方式中，通過穩(wěn)定整合入宿主的染色體來轉(zhuǎn)化宿主光合微生物。例如， 宿主藍(lán)細(xì)菌通過穩(wěn)定整合入宿主的染色體來轉(zhuǎn)化(參見，例如實(shí)施例11-1 。染色體整合 可確保靶基因安裝在有機(jī)體內(nèi)而沒有采用質(zhì)?；虮磉_(dá)有時(shí)會(huì)發(fā)生的逐出風(fēng)險(xiǎn)。染色體整 合還可降低或消除為維持靶基因而對(duì)抗生素的需求。染色體整合方案優(yōu)選將基因靶向插入染色體中稱為upp的基因座(參見，例如實(shí) 施例11-1 。該位點(diǎn)編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(UPRT酶)，其是嘧啶生物合成中的清 除酶。采用該方案允許通過可除去未整合有機(jī)體的5-氟尿嘧啶(5-FU)選擇候選對(duì)象。通 常在藍(lán)細(xì)菌系統(tǒng)中采用分離方法，因?yàn)檫@些有機(jī)體含有它們的染色體的多個(gè)拷貝(例如， 對(duì)于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803多達(dá)12拷貝，對(duì)于細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942是16拷貝)。該方 案對(duì)于藍(lán)細(xì)菌特別有吸引力，因?yàn)樵摲椒杀苊獠捎靡蕾囉糜诔晒Ψ蛛x的選擇性壓力和統(tǒng) 計(jì)學(xué)積分的傳統(tǒng)分離技術(shù)。利用5-FU作為篩選劑更有效，因?yàn)樗芊乐鼓呐潞幸粋€(gè)活性 upp基因的任何有機(jī)體生長(zhǎng)。以此方式，與傳統(tǒng)技術(shù)所需的過程相比，可在較少生長(zhǎng)周期中 快速選擇完全整合的候選對(duì)象。固相光合生物反應(yīng)器本文提供培養(yǎng)光合微生物的光生物反應(yīng)器，其包括固相培養(yǎng)支持物以供光合微生 物生長(zhǎng)。固相培養(yǎng)支持物或固體培養(yǎng)支持物或固體支持物等通常理解成表示既非液體也 非氣體的培養(yǎng)支持物。雖然該支持物本身是固體的，但可選擇該支持物結(jié)構(gòu)以便吸附液體 (例如，生長(zhǎng)培養(yǎng)基)、氣體或二者。在下文更全面描述的某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體支 持物可吸收水分以供微生物在培養(yǎng)期間使用。本文所述光生物反應(yīng)器的各種實(shí)施方式可支持光合微生物生長(zhǎng)。在光生物反應(yīng) 器中生長(zhǎng)的光合微生物可以是，例如天然光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌，或工程改造的光合微生 物，例如人工光合細(xì)菌。天然具有光合作用或經(jīng)工程改造具有光合作用的示范性微生物包 括但不限于細(xì)菌；真菌沽細(xì)菌；原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動(dòng)物，例如浮游生物、 渦蟲和變形蟲。天然光合微生物的例子包括但不限于極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏 藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、 斜生柵藻、項(xiàng)圈藻、管鏈藻屬、柱孢藻屬、聚球藍(lán)細(xì)菌、集胞藍(lán)細(xì)菌和/或底棲藍(lán)藻。優(yōu)選配置生物反應(yīng)器以支持接種、培養(yǎng)和/或收獲如上所述經(jīng)轉(zhuǎn)化以累積二糖的 藍(lán)細(xì)菌。所述光生物反應(yīng)器可以是下文更全面描述的開放式或封閉式系統(tǒng)。在各種實(shí)施方 式中，光生物反應(yīng)器包括固相培養(yǎng)支持物、保護(hù)屏障層和懸掛元件。光生物反應(yīng)器的一些實(shí) 施方式可包括遞送和/或除去氣體、液體、營(yíng)養(yǎng)物和/或光合微生物的系統(tǒng)。遞送系統(tǒng)可以 是，例如標(biāo)準(zhǔn)管道附件。各種管路的任一種可包括快速連接的管道附件。光生物反應(yīng)器可具 有氣體遞送管線，其能遞送例如遞送二氧化碳或普通空氣。光生物反應(yīng)器可具有液體遞送 管線。液體遞送管線優(yōu)選與滴流或滴液系統(tǒng)連接，所述滴流或滴液系統(tǒng)將液體(例如，水)運(yùn)送至固相培養(yǎng)支持物。光生物反應(yīng)器可具有營(yíng)養(yǎng)遞送管線。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能配制 用于光合微生物生長(zhǎng)和維持的營(yíng)養(yǎng)組合物。在一些實(shí)施方式中，可以合并營(yíng)養(yǎng)和液體遞送 管線，例如以供應(yīng)基于液體的營(yíng)養(yǎng)混合物。在一些實(shí)施方式中，液體遞送管線或營(yíng)養(yǎng)遞送管 線可以是將液體培養(yǎng)基分配在生長(zhǎng)表面上的噴霧裝置。在這種噴霧裝置中，光生物反應(yīng)器 應(yīng)足夠大，從而能，例如在外層，如屏障層和固相培養(yǎng)支持物之間容納噴霧裝置。營(yíng)養(yǎng)物通 常以水基組合物供應(yīng)。可有利地提供不同的水遞送管線和營(yíng)養(yǎng)物遞送管線以便獨(dú)立控制水 分和營(yíng)養(yǎng)物水平。光生物反應(yīng)器可具有產(chǎn)物收獲管線以便收集光合微生物和/或液體懸浮 /可溶性產(chǎn)物。光生物反應(yīng)器可具有接種管線以便接種光合微生物。在一些實(shí)施方式中，可 合并液體、營(yíng)養(yǎng)物和/或接種管線。圖1(正視圖)和圖2 (側(cè)視圖)描述了固相光生物反應(yīng)器的一個(gè)實(shí)施方式。在這 些實(shí)施方式中，保護(hù)屏障7包圍固相培養(yǎng)支持物2。圖2顯示固體培養(yǎng)支持物在構(gòu)成保護(hù)屏 障7的保護(hù)屏障層3之間。固體培養(yǎng)支持物2提供在其上培養(yǎng)光合微生物的表面。構(gòu)成保 護(hù)屏障7的保護(hù)屏障層3是透明的，從而光化射線能達(dá)到固體培養(yǎng)支持物2的表面以支持 光合微生物生長(zhǎng)?？芍貜?fù)密封的外罩4使得保護(hù)屏障7可松脫地密封。氣體和蒸氣交換通 過結(jié)合入保護(hù)屏障7的材料的選擇性面板5進(jìn)行?？赏ㄟ^支持元件6將光生物反應(yīng)器1懸 掛成垂直或非水平方向。固相光生物反應(yīng)器的另一實(shí)施方式描述于圖12A(正視圖)和圖12B(側(cè)視圖)中。 可將反應(yīng)器1設(shè)計(jì)成分段形式，這種形式有助于維修和將表面和/或管路的污染可能性降 低到最小。各段可經(jīng)各種供應(yīng)和產(chǎn)物收獲管線的管路(例如，快速連接形管路)與反應(yīng)器 連接。可通過懸掛元件6將反應(yīng)器支撐在，例如軌道上，從而反應(yīng)器1能懸在空中并有助于 各段的快速維修。外部保護(hù)屏障7可以是能使光線穿透的透明材料，從而有助于生長(zhǎng)表面 2上的光合作用，且防止環(huán)境污染和水分因蒸發(fā)而損失。生長(zhǎng)表面2可由能保持水分、供應(yīng) 營(yíng)養(yǎng)物、除去產(chǎn)物和/或能使光合微生物高密度生長(zhǎng)的材料構(gòu)成?？赏ㄟ^管路供應(yīng)生長(zhǎng)表 面2，該管路通過液體培養(yǎng)基提供連續(xù)補(bǔ)料/從該表面收獲產(chǎn)物。培養(yǎng)基管道8可以是將液 體滲至表面2的多孔軟管，培養(yǎng)基可因重力而濾過生長(zhǎng)表面2。液體可通過收獲管9在反應(yīng) 器底部收獲，該管收獲產(chǎn)物和過量的液體培養(yǎng)基以運(yùn)出反應(yīng)器1?？赏ㄟ^氣體分散管10將 氣體，例如二氧化碳和空氣供應(yīng)給反應(yīng)器。氣體供應(yīng)管10可提供正壓環(huán)境，預(yù)計(jì)能以受控 而有效的方式提供生長(zhǎng)所需的氣體。氣體供應(yīng)管線10還可通過濕化進(jìn)入的氣流而有助于 將水分損失降至最少。反應(yīng)器中的過量氣體可由可呼吸面板5(在相反側(cè)，未示出)排出， 該面板是能使氣體通過但最小化或消除環(huán)境污染的多孔材料。通過過濾供應(yīng)管線10遞送 的進(jìn)入氣體，反應(yīng)器1的正壓配置預(yù)計(jì)能使污染程度最小化。正壓還通過提供給氣流由內(nèi) 向外的途徑而能防止環(huán)境污染。在圖12B描述的實(shí)施方式中，反應(yīng)器1的結(jié)構(gòu)元件以相對(duì)于生長(zhǎng)表面的方向描述。 允許過量氣體溢出反應(yīng)器1的可呼吸面板5可面向該裝置的底部安置，以提供氣體穿過生 長(zhǎng)表面2轉(zhuǎn)移的途徑。將可呼吸面板5定位在屏障表面7底部還能最小化或防止二氧化碳 因其密度高于空氣而隔開和聚集的可能性?？筛鶕?jù)培養(yǎng)表面2上最佳生長(zhǎng)要求的氣體流動(dòng) 速度來確定可呼吸面板5的尺寸。固相培養(yǎng)支持物本文所述光生物反應(yīng)器的固相培養(yǎng)支持物提供光合微生物在其上和/或其中能生長(zhǎng)的表面。固相培養(yǎng)支持物優(yōu)選包含為有機(jī)體提供水分和/或營(yíng)養(yǎng)物或有助于提供和/ 或保留水分和/或營(yíng)養(yǎng)物的材料，從而促進(jìn)和維持生長(zhǎng)。本發(fā)明的實(shí)施方式不限于可培養(yǎng) 的光合微生物的類型或菌株。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道細(xì)胞生長(zhǎng)所需的水分的量和營(yíng)養(yǎng) 物的用量及組成將根據(jù)待培養(yǎng)的光合微生物的類型或菌株和應(yīng)用而變化。通常應(yīng)避免對(duì)光 合微生物的生長(zhǎng)具有有害作用的材料(或那些材料中或其上所含的物質(zhì))?？刹捎脝喂馍锓磻?yīng)器培養(yǎng)一種類型或多種類型或菌株的光合微生物。此外，固 體培養(yǎng)支持物可包含適合一個(gè)培養(yǎng)周期或多個(gè)培養(yǎng)周期的一種或多種材料，培養(yǎng)周期之間 可以進(jìn)行或不進(jìn)行滅菌。還有，可將光生物反應(yīng)器配置成在一個(gè)或多個(gè)固體支持物上培養(yǎng) 一種類型或菌株的微生物或多種類型或菌株的微生物。在一些實(shí)施方式中，可以在一個(gè)培 養(yǎng)支持物上同時(shí)培養(yǎng)不同光合微生物的群體，或光合和非光合微生物的群體，而不是純性 培養(yǎng)。單光生物反應(yīng)器還可包含多個(gè)培養(yǎng)支持物。因此，在另一實(shí)施方式中，單保護(hù)屏障內(nèi) 的多個(gè)培養(yǎng)支持物可同時(shí)培養(yǎng)一種或多種類型或菌株的光合微生物。固體培養(yǎng)支持物優(yōu)選包含相對(duì)多孔的材料。相對(duì)多孔的材料通常具有較大表 面積，可比相對(duì)非多孔的材料保留和/或吸附更多水分。還優(yōu)選具有質(zhì)地粗糙或形貌 (topographical)表面的固體培養(yǎng)支持物。與質(zhì)地相對(duì)不粗糙或平滑的表面相比，質(zhì)地粗糙 或形貌表面能提高細(xì)胞密度。雖然通常對(duì)支持材料和表面形貌作出選擇以增強(qiáng)微生物與支 持物的粘附作用，但通常需要該生物不是非常緊密地粘附以致于妨礙它們的移動(dòng)或收獲。 在一些實(shí)施方式中，固體培養(yǎng)支持物包含適合微生物粘附和生長(zhǎng)的材料。在一些實(shí)施方式 中，固體培養(yǎng)支持物包含減少或消除生物膜形成的材料。據(jù)信，本文所述光生物反應(yīng)器的固相支持物不同于本領(lǐng)域所用的固體支持物(例 如，微生物生長(zhǎng)最常用的固相支持物是瓊脂)。瓊脂通常澆鑄在剛性形態(tài)的物體中，例如培 養(yǎng)皿，并在其中使用以維持其物理完整性，因?yàn)榄傊诮佑|最低水平的應(yīng)力、應(yīng)變或二者時(shí) 易破碎或撕裂。相比之下，所述培養(yǎng)支持物的各種實(shí)施方式足夠強(qiáng)且耐用，從而能用于光生 物反應(yīng)器中同時(shí)維持其物理完整性而無需更強(qiáng)、更耐用的“框架”。或者從另一方面講，現(xiàn)有 技術(shù)涉及與實(shí)質(zhì)上更強(qiáng)、更耐用材料(例如，培養(yǎng)皿)接觸，從而形成復(fù)合體的弱瓊脂支持 物的充足部分。因此，所述光生物反應(yīng)器的各種實(shí)施方式的固相支持物本身適合于培養(yǎng)微 生物，并且足夠強(qiáng)而耐用。下文描述了固相支持物的其它所需的物理特征和/或操作參數(shù)。例如，支持物可 以是相對(duì)平坦和剛性的(類似平板)，或者其可由通過，例如絞鏈、彈簧、金屬絲、絲帶等柔 性連接的多個(gè)平坦而剛性的部件構(gòu)成。合適的剛性材料包括但不限于各種金屬、聚合物、 陶瓷及其復(fù)合材料。剛性材料優(yōu)選具有提高光合微生物與其粘附性的表面形貌。此外，剛性 材料可以所需水平的多孔性形成，以增強(qiáng)遞送水分和/或營(yíng)養(yǎng)物至光合微生物的能力。此 外，剛性材料可包被有吸附劑或超級(jí)吸附聚合物制劑(見下文)?；蛘撸С治锟苫旧嫌?柔性材料，例如織物構(gòu)成。用于固相支持物中的織物包括但不限于棉、聚酯和/或棉聚酯 摻混物，任選包被有吸附劑或超級(jí)吸附劑聚合物制劑。培養(yǎng)支持物的柔性是極為有利的，因 為它使得培養(yǎng)支持物可以折疊、扭轉(zhuǎn)、懸掛或卷起以便儲(chǔ)存、運(yùn)輸或處理。此外，固相培養(yǎng)支持物優(yōu)選其結(jié)構(gòu)在高溫下(例如，約120°C和更高)穩(wěn)定，例如高 壓滅菌器消毒期間通常會(huì)遇到的，并且不會(huì)如瓊脂般融化。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，可通 過高壓滅菌法消毒該培養(yǎng)支持物，然后置于本發(fā)明的保護(hù)屏障內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，該培
本發(fā)明的固體培養(yǎng)支持物可包含支持光合微生物生長(zhǎng)的任何材料或由其制備。例 如，該支持物可由天然材料、修飾的天然材料、合成材料或它們的任何組合構(gòu)成。天然材料 包括但不限于棉、羊毛、加工的紡織植物纖維和天然多糖(例如，瓊脂、淀粉、纖維素)。修 飾的天然材料可包括但不限于化學(xué)修飾的植物纖維，例如硝酸纖維素或纖維素酯，除與聚 酯或聚酰胺纖維共同紡織的或摻混的天然纖維外。合成材料包括但不限于由尼龍、纖維玻 璃、聚硅氧烷、聚酯、聚烯烴、聚酰胺、共聚酯、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚磺酸酯構(gòu)成的纖維。 固體培養(yǎng)支持物材料的其它例子包括但不限于絲網(wǎng)、聚氨酯泡沫、氯乙烯泡沫、玻璃碳泡 沫、聚酯/聚乙烯泡沫、聚酰亞胺泡沫、聚異氰酸酯泡沫、聚苯乙烯泡沫和聚酯泡沫或它們 的組合。在各種實(shí)施方式中，固體培養(yǎng)支持物是織物?？赏ㄟ^以下方法形成織物，例如，但 不限于紡織、編織、制氈和將纖維或聚合物鍵合或交聯(lián)在一起?？梢詷?gòu)建松散的或開放式 的織物?；蛘?，可以緊密構(gòu)建織物。即，具有明顯質(zhì)地、表面積、形貌可變性和/或粗糙度的 織物可將光合微生物更多地機(jī)械鍵合或粘附于培養(yǎng)支持物，因此在用有機(jī)體接種支持物和 /或其培養(yǎng)和/或收獲過程期間對(duì)光生物反應(yīng)器進(jìn)行操作、運(yùn)輸或者移動(dòng)的實(shí)施方式中是 特別優(yōu)選的。在大多數(shù)情況中，有機(jī)體與基板的粘附性不宜太大，以致于過分阻礙在收獲操 作期間移動(dòng)它們。此外，可通過選擇通常是疏水性、親水性織物或這些織物的混合物來控制 織物保留有機(jī)體所用水分和/或營(yíng)養(yǎng)物的能力。這些特性使得固體支持物能保留和/或運(yùn) 送水分和/或溶解于其中的營(yíng)養(yǎng)物，從而這些水分和/或營(yíng)養(yǎng)物能為表面生長(zhǎng)的微生物所 用?？蛇x用能增強(qiáng)光合微生物生長(zhǎng)的材料包被支持物來提高培養(yǎng)支持物的特性，特別 是水分和/或營(yíng)養(yǎng)物保留。例如，可用瓊脂或超級(jí)吸附劑聚合物，如修飾的纖維素酯、丙烯 酸酯或丙烯酸酯/多胺共聚物摻混物包被培養(yǎng)支持物。這些包被材料通常能吸附和保留超 過其干重10-100倍的水。在一些實(shí)施方式中，這些材料配制成在離子性培養(yǎng)基組分存在下 將保留它們的超級(jí)吸附特性。包被材料可包被培養(yǎng)支持物表面，或織物的纖維(如果使用 的話)，或二者。在一個(gè)實(shí)施方式中，在瓊脂中包被作為培養(yǎng)支持物的毛巾布樣品。當(dāng)如此 包被固體培養(yǎng)支持物時(shí)，如果光合微生物與其相連，則培養(yǎng)支持物的“表面”包括包被物的 表面。為使培養(yǎng)支持物薄、柔軟和輕，包被物優(yōu)選薄的，例如不超過約100微米。然而，還可 依據(jù)所需應(yīng)用，或固體培養(yǎng)支持物和所選包被材料的組合利用較厚包被物。所述固相培養(yǎng)支持物可以是復(fù)合分層結(jié)構(gòu)。固相培養(yǎng)支持物可包含布置成毗鄰的 至少兩層。多層固相培養(yǎng)支持物可偶聯(lián)，例如通過鍵合、縫合、粘合、壓制或任何其它合適的 方法。各層可各自獨(dú)立選自上述幾種材料。例如，所述固相培養(yǎng)支持物可包含織物第一材 料層，其鍵合至合成泡沫第二材料層。再例如，所述固相培養(yǎng)支持物可包含合成泡沫第一材 料層，其鍵合至密度相同或不同的合成泡沫第二材料層。所述固相培養(yǎng)支持物優(yōu)選復(fù)合分 層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)至少包含由高表面積生長(zhǎng)材料構(gòu)成的第一層和由可滲透型材料構(gòu)成的第二 層。除了提供水分、營(yíng)養(yǎng)物和表面以供附著，培養(yǎng)支持物可提供捕獲光化射線的表面。 因此，在一些實(shí)施方式中，固體培養(yǎng)支持物的尺寸是片狀的。即，所述支持物的深度小于支持物的長(zhǎng)度和寬度。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)支持物是保護(hù)屏障的薄膜樣層之間的片 狀層。這種平的生物反應(yīng)器可如平板那樣懸掛。在另一實(shí)施方式中，培養(yǎng)支持物恰如光生 物反應(yīng)器的外層屏障所封閉的幕布那樣懸掛。傳統(tǒng)固相支持物，例如瓊脂的薄片易裂開，可 能不能如此懸掛。因此，優(yōu)選單獨(dú)的固體培養(yǎng)支持物在懸掛時(shí)，甚至在用液體飽和時(shí)能維持 其完整性。如本文所示，毛巾布類型編織的織物可提供合適的固體支持物(參見，例如實(shí)施 例1)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道其它天然的、經(jīng)修飾天然的和合成材料也可接受。毛巾布提 供許多據(jù)信是本發(fā)明固體支持物的理想特性。例如，當(dāng)在常規(guī)條件下(例如，溫度)，采用非 破壞性技術(shù)(例如，彎曲、折疊、扭轉(zhuǎn)或卷曲)操作時(shí)，其柔軟，不易撕裂、扯開、破碎或破裂。 類似地，當(dāng)適度拉伸時(shí)(甚至用液體飽和時(shí))，毛巾布通常不易撕裂、扯開或破碎。此外，毛 巾布常是高度質(zhì)地粗糙的，因?yàn)槠溆稍S多纖維環(huán)構(gòu)成。這為微生物粘附提供了大表面積，從 而增加了可在任何給定尺寸的支持物上生長(zhǎng)的微生物數(shù)量。此外，棉毛巾布通常吸附至少 約3倍其本身的重量，從而織物支持物能保留水分和溶解于其中的任何營(yíng)養(yǎng)物，使得它們 為支持物表面生長(zhǎng)的微生物所用。因此，各種實(shí)施方式提供固體培養(yǎng)支持物，該固體培養(yǎng)支 持物是薄的或片狀尺寸，懸掛時(shí)能支持其本身的濕重，柔性的，易彎曲的、具有吸附性、質(zhì)地 高度粗糙或它們的任何組合。上述支持物可以(在許多應(yīng)用中優(yōu)選)反復(fù)使用，更優(yōu)選的是，只要它們結(jié)構(gòu)合理 并提供足以支持單次使用后沉積的微生物生長(zhǎng)的表面，從而能降低操作成本和廢料。即，某 些應(yīng)用中可以優(yōu)選單用支持物，例如培養(yǎng)用于產(chǎn)生藥物產(chǎn)品，如小有機(jī)分子或治療蛋白和 肽的重組光合微生物。為降低這種單用支持物的成本以及鑒于不會(huì)再使用它們的事實(shí)，此 類支持物無需耐用，因此可用成本較低和耐用性較差的方法和/或材料制備或構(gòu)建。例如， 由類似于紙巾纖維的紙纖維構(gòu)成的支持物可能適合。固相培養(yǎng)支持物的幾種實(shí)施方式描述于圖13。圖13A描述的固相培養(yǎng)支持物材料 是可提供可維持表面以供有機(jī)體生長(zhǎng)、水分和營(yíng)養(yǎng)物通路、有機(jī)體附著點(diǎn)和/或除去培養(yǎng) 產(chǎn)物的一種材料。該材料允許液體滲濾和平衡擴(kuò)散，從而在表面和有機(jī)體之間交換營(yíng)養(yǎng)物、 水分和產(chǎn)物。該結(jié)構(gòu)構(gòu)造圖是可作尺寸和形狀優(yōu)化的高表面積材料的一種實(shí)例。圖13B所 述固相培養(yǎng)支持物材料是由各自對(duì)于生長(zhǎng)表面具有特定功能的多層材料組成的混合材料。 基底層可以是使得經(jīng)材料滲濾而有效供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物和水分以及除去產(chǎn)物的多孔材料?；撞?料還可為生長(zhǎng)表面提供物理支持。外層要求與基底層連接，并可作優(yōu)化以提供有機(jī)體的附 著點(diǎn)。就表面積和與培養(yǎng)的微生物的相容性而言，表面層可更多地控制表面生長(zhǎng)環(huán)境。保護(hù)屏障本文所述的光生物反應(yīng)器可包含保護(hù)固體培養(yǎng)支持物和生長(zhǎng)表面免遭污染和/ 或水分喪失的屏障。同時(shí)，光生物反應(yīng)器將光化射線(陽(yáng)光或人工光)和二氧化碳提供給 光合微生物。在各種實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器包括培養(yǎng)光合微生物的至少一個(gè)固體支持 物和保護(hù)屏障。保護(hù)免遭物理操作和/或污染為防止污染，保護(hù)性物理屏障可至少部分覆蓋固體培養(yǎng)支持物。在某些實(shí)施方式 中，物理屏障可包含培養(yǎng)支持物。保護(hù)性屏障還可控制(至少部分控制)水分從支持物和/ 或光生物反應(yīng)器內(nèi)的空氣中散失到光生物反應(yīng)器外的空氣中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，可依據(jù)所需的本發(fā)明實(shí)施方式從多種類型的材料中的任一種構(gòu)建保護(hù)屏障。所述保護(hù)屏障可完全包圍培養(yǎng)支持物。如果保護(hù)屏障是永久密封的，必須破壞、切 割、撕開屏障，或作相似處理才能取得其內(nèi)的培養(yǎng)支持物。因此，在一些實(shí)施方式中，從保護(hù) 屏障到培養(yǎng)支持物和微生物生長(zhǎng)表面提供了通路。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保護(hù)屏障可松脫地密封?？伤擅撁芊饪梢允嵌喾N密封類 型中的任一種，包括但不限于拉鏈-型密封，例如Ziploc 儲(chǔ)存袋(sc強(qiáng)生公司(sc Johnson Company))、鉤環(huán)型扣件(例如，威克羅美國(guó)公司(Velcro USA，Inc.))、扭結(jié)(twist ties)、尼龍扣條(zipties)、撳鈕、夾具、壓敏背襯粘合劑表面(pressure sensitive adhesive backed surfaces)和該領(lǐng)域已知的所有等同方式。然而，不一定需要完全密封； 不完全密封外層屏障可能更有效，從而更易于取得培養(yǎng)支持物。光生物反應(yīng)器可在保護(hù)屏障內(nèi)包含一個(gè)培養(yǎng)支持物或多個(gè)培養(yǎng)支持物。在一些實(shí) 施方式中，在一個(gè)保護(hù)屏障內(nèi)包含一個(gè)培養(yǎng)支持物。例如，塑料袋可形成其中包含了一個(gè)固 體培養(yǎng)支持物的保護(hù)屏障(參見，例如圖1)。在其它實(shí)施方式中，一個(gè)保護(hù)屏障可包含多個(gè) 固體培養(yǎng)支持物。例如，溫室型結(jié)構(gòu)可形成其中包含了多個(gè)固體培養(yǎng)支持物的保護(hù)屏障。光化射線的傳遞光生物反應(yīng)器可將光化射線(陽(yáng)光或人工光)傳遞至光合微生物。但本發(fā)明的保 護(hù)屏障無需透光。如果其中提供光合微生物生長(zhǎng)所需的足夠光源，一些實(shí)施方式可包含包 圍在不透明保護(hù)屏障內(nèi)的培養(yǎng)支持物。提供透明的屏障以利用陽(yáng)光，例如作為光源可能更 理想、更簡(jiǎn)單、更經(jīng)濟(jì)等。優(yōu)選的實(shí)施方式提供包含以下材料的透明屏障，例如但不限于玻璃或任何類型 的透明或通常可見光能穿透的聚合物，例如聚乙烯、丙烯酸聚合物、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇 酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯或它們的共聚物或它們的組合。透明屏障可以選自耐用且不易扯 開、撕裂、破裂、磨損、粉碎或其它類似物理?yè)p壞的材料?？梢罁?jù)耐受高壓滅菌器消毒或其它 接觸極端溫度的能力選擇透明屏障材料。此外，可選擇耐受長(zhǎng)期接觸陽(yáng)光或其它輻射而不 脫色或退化的透明屏障材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道耐受光氧化的特定涂層或制劑可能特 別有用。此外，可選擇紅外反射或吸收涂層以降低和/或調(diào)節(jié)本發(fā)明光生物反應(yīng)器內(nèi)的溫 度累積。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道透明屏障材料的厚度會(huì)根據(jù)機(jī)械性能規(guī)模而有所不同。例 如，透明屏障材料可以為約IOmil厚度的工業(yè)/海運(yùn)業(yè)類型塑料，或者可以為家用塑料袋類 型，g卩，約anil厚。在一個(gè)實(shí)施方式中，透明屏障材料薄而柔韌。例如，透明屏障材料可以 低于約IOrni 1。在一些實(shí)施方式中，屏障形成覆蓋薄的、柔韌的固體培養(yǎng)支持物兩側(cè)的保護(hù)層或 薄膜。該實(shí)施方式的裝配光生物反應(yīng)器將是柔韌的，可以彎曲、卷曲、折疊、扭轉(zhuǎn)等以便儲(chǔ) 存、運(yùn)輸、運(yùn)送或處理。在另一實(shí)施方式中，透明屏障材料是剛性的。例如，屏障可以是玻璃 溫室。溫室玻璃的厚度最可能優(yōu)選與建筑實(shí)踐相一致，但也可能改變。出于實(shí)踐目的，此類 實(shí)施方式的光生物反應(yīng)器將是固定的，但可在一個(gè)保護(hù)性透明屏障的空間內(nèi)對(duì)多個(gè)固體支 持物進(jìn)行操作、運(yùn)輸、運(yùn)送，等等。雖然可選擇保護(hù)屏障以提供足夠的光線供光合微生物生長(zhǎng)，但無需整個(gè)屏障是透 明的。因此，在一些實(shí)施方式中，屏障的諸部分，例如一條或多條邊緣由非透明材料制成。所述非透明材料可以由以下材料構(gòu)成，包括但不限于聚乙烯纖維材料(Tyvek )、聚四氟 乙烯過濾介質(zhì)、纖維素過濾材料、玻璃纖維過濾材料、聚酯過濾材料和聚丙烯酸酯過濾材料 和它們的組合?？梢蚰陀眯赃x擇非透明材料。在此類實(shí)施方式中，可進(jìn)一步保護(hù)屏障的透 明部分以免被耐用的非透明部分導(dǎo)致的撕裂、撕開、磨損、脫落等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，非 透明部分提供或包含連接結(jié)構(gòu)和/或加強(qiáng)結(jié)構(gòu)，從而通過進(jìn)一步包含安裝或連接點(diǎn)(例如， 孔、環(huán)、鉤、索環(huán)或其它技術(shù)上的等同裝置、開口或凹槽)和/或?qū)⒃摴馍锓磻?yīng)器固定于某 結(jié)構(gòu)的某機(jī)構(gòu)而懸掛該光生物反應(yīng)器。雖然任何此類安裝點(diǎn)不一定要位于非透明部分中或 其上，但它們可包含在該屏障的非透明部分內(nèi)或其上，屏障的透明部分內(nèi)或其上，或屏障的 非透明和透明部分內(nèi)或其上。該連接結(jié)構(gòu)還可包含在該固體培養(yǎng)支持物內(nèi)或其上，或穿過 該固體培養(yǎng)支持物。在一些實(shí)施方式中，該裝置具有可分辨的前側(cè)和后側(cè)。該裝置的前側(cè)表示面對(duì)光 源，因此前側(cè)上的屏障部分優(yōu)選透明的，而偏離光源側(cè)的保護(hù)屏障部分不必需是透明的。提供氣體交換在光合作用期間，光合微生物消耗二氧化碳并釋放氧。本文所述的光生物反應(yīng)器 可提供足以產(chǎn)生所需量的光合作用的二氧化碳。將二氧化碳供應(yīng)到光生物反應(yīng)器內(nèi)的一種 方式是允許在該光生物反應(yīng)器內(nèi)的空氣和其周圍空氣之間的直接氣體交換。例如，可在保 護(hù)屏障中提供洞、通氣孔、窗或其它此類開口，從而該系統(tǒng)對(duì)于周圍的空氣是開放的。但當(dāng)考慮到光合微生物的污染時(shí)，這種開放式構(gòu)形可能不理想。為解決該問題，保 護(hù)屏障可將一個(gè)或多個(gè)固體支持物完全密封在內(nèi)以隔開外部空氣。在此類實(shí)施方式中，可 通過將二氧化碳引入該封閉外殼中來維持所需濃度。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道來自二 氧化碳?jí)嚎s罐的管路或管道使得二氧化碳混合入封閉在光生物反應(yīng)器內(nèi)的空氣中。此外， 已知可利用工廠、工業(yè)設(shè)備、發(fā)電站等的排放物作為光合微生物的二氧化碳源，因而能減少 碳排放。在一個(gè)實(shí)施方式中，供氣管線可將二氧化碳提供至生長(zhǎng)表面局部區(qū)域。提供氣體可透過的選擇性屏障來利用大氣二氧化碳可能是理想的、更簡(jiǎn)單、更經(jīng) 濟(jì)等。因此，一些光生物反應(yīng)器實(shí)施方式提供選擇性屏障，其允許在保護(hù)屏障內(nèi)封閉的環(huán)境 與周圍空氣之間交換氣體和蒸氣，但仍能提供密封物理屏障以免污染。此類屏障可以是至 少部分氣體/蒸氣可透過的(例如，透過性遠(yuǎn)低于常規(guī)紡織織物、高于塑料膜和/或類似于 銅版紙)，因此能交換氣體，例如二氧化碳和氧，但對(duì)于固體和液體至少是部分透過的，優(yōu)選 不透過。在一些實(shí)施方式中，光生物反應(yīng)器可包含半透屏障層和氣體供應(yīng)管線以在生長(zhǎng)表 面周圍或附近區(qū)域維持高二氧化碳濃度。在一些實(shí)施方式中，選擇性屏障的平均孔徑或直徑不大于約10微米，氣體交換率 至少約5，不大于約10，000葛爾萊秒(葛爾萊秒或葛爾萊是描述在給定壓力差下100立方 厘米氣體經(jīng)過1. 0平方英寸的給定材料所需秒數(shù)的單位)。因此，除了允許氣體交換，所述 選擇性屏障可防止水分從封閉的系統(tǒng)中流失。保護(hù)屏障的選擇性屏障部分可由任何合適的聚合物材料構(gòu)成，例如紡絲粘合烯烴 屏障(spunbonded olefin barrier)?？蓮亩虐罟?DuPont)容易地購(gòu)得商標(biāo)Tyvek 的具有各種特性的紡絲粘合烯烴屏障(極細(xì)的聚乙烯纖維)。此類材料因組合了多種物理 特性而尤其有利，即，它們能阻止液體傳遞，例如水，但具有高度氣體/蒸氣透過性；它們強(qiáng) 度較高，吸附少量或不吸附水分，耐撕裂，具有明顯的彈性和高度柔韌性。當(dāng)在MIT彎曲測(cè)試儀(flex tester) (TAPPI方法T_42;3)上測(cè)試時(shí)，紡絲粘合烯烴可超過20，000輪。此外， 它們對(duì)大多數(shù)酸、堿和鹽呈惰性，雖然長(zhǎng)期接觸氧化物質(zhì)，例如濃硝酸或過硫酸鈉會(huì)導(dǎo)致強(qiáng) 度有一定喪失。紡絲粘合烯烴屏障具有良好的尺寸穩(wěn)定性，即，恒溫，0-100%相對(duì)濕度下， 薄片尺寸的改變小于0.01%。某些產(chǎn)物符合美國(guó)聯(lián)邦規(guī)則法典第21條(Title 21 of the United States Code of Federal Regulations) (21 CFR177. 1520)對(duì)于直接食品接觸應(yīng)用 的要求。它們還具有優(yōu)秀的霉菌和發(fā)霉抗性；以及中性PH。然而，遺憾的是，它們的UV抗 性不好。即，通常預(yù)期室外使用壽命至少1-3個(gè)月。此外，可用不透明涂層或通過在聚合物 纖維中包含入U(xiǎn)V抑制劑來改進(jìn)它們的UV抗性。此外，由于迄今為止生產(chǎn)的紡絲粘合烯烴 是不透明的，包含這種材料的保護(hù)屏障部分優(yōu)選不存在和/或不多從而不會(huì)損害光合微生 物的培養(yǎng)。具體地說，可以產(chǎn)生“硬”和“軟”結(jié)構(gòu)類型的紡絲粘合烯烴。10型是“硬的”面-粘 合產(chǎn)品，其是光滑的、硬的非定向的紙-樣形式。14和16型是“軟的”點(diǎn)-粘合產(chǎn)品，其具 有浮雕花紋以提供織物-樣柔性基材。14型(或其等價(jià)物)可在，例如要求屏障的耐用性 和呼吸性的情況下使用。16型是穿有5-20mil (0. 13-0. 51mm)孔的針，從而給予它們比14 型更高的空氣和水分透過性，額外的柔軟度和更高的柔韌性和懸垂性，但撕裂強(qiáng)度和屏障 特性較低。因此，可通過選擇一種或多種類型的紡絲粘合烯烴產(chǎn)品來定制選擇性屏障的特 定特性。選擇性聚合物屏障的其它例子包括但不限于尼龍、聚砜、聚四氟乙烯、纖維素、玻 璃纖維、聚酯和聚丙烯酸酯膜和過濾材料以及它們的組合。保護(hù)屏障的整體無需是氣體透過性的，從而提供對(duì)于光合微生物的生長(zhǎng)具有充分 選擇性的屏障。只需足夠進(jìn)行充分氣體交換的保護(hù)屏障部分是氣體透過性的。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述選擇性部分是保護(hù)屏障面板(參見，例如圖1)?？筛淖兣c支持物表面面積相關(guān) 的選擇性面板的大小和位置以獲得特定應(yīng)用所需的氣體交換量而不會(huì)過度阻礙微生物的 培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道由氣體可透過的選擇性材料構(gòu)成的外部屏障面積百分比將取 決于該材料的氣體透過率。事實(shí)上，由于氣體可透過部分將仍允許水蒸氣穿過其運(yùn)送，在各 種實(shí)施方式中，選擇該保護(hù)屏障的氣體可透過部分的大小以充分運(yùn)送氧和二氧化碳，同時(shí) 使水分流失最小化。懸掛和傳送系統(tǒng)可將本文所述的光生物反應(yīng)器構(gòu)建為用于大規(guī)模生產(chǎn)和/或通過，例如整合入操 控和傳送系統(tǒng)來收獲。圖3顯示用于以連續(xù)方法操控大量光生物反應(yīng)器的光生物反應(yīng)器場(chǎng) (photobioreactor farm)的示范性設(shè)計(jì)的俯視圖。將該光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)面板(未單獨(dú) 顯示)連接于傳送系統(tǒng)8。傳送系統(tǒng)8將培養(yǎng)面板沿著它們的路徑移動(dòng)。多個(gè)傳送系統(tǒng)匯 聚到位于中心的接種和收獲中心9。因此，培養(yǎng)面板移入接種和收獲中心9，在此處對(duì)它們 進(jìn)行加工(例如，收獲和/或接種)，然后在接種后以及生物量的培養(yǎng)期間將面板移離中心。 隨后在收獲前的培養(yǎng)后期將面板移回中心，最終攜帶用于收獲的成熟生物量到達(dá)中心。然 后重復(fù)該周期。收獲的生物量可經(jīng)管道10運(yùn)送以便進(jìn)一步加工。可通過加入額外傳送系統(tǒng) 或額外接種和收獲中心來提高光生物反應(yīng)器場(chǎng)的性能以形成專用于生物量產(chǎn)生的大陣列。光生物反應(yīng)器的懸掛為給光合微生物提供光，光生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方式中的培養(yǎng)支持物是薄的，片狀的。當(dāng)水平定位時(shí)，底層空間(floor space)的充分利用率易降低，因此，在本發(fā)明的 某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)支持物是非水平定位的，優(yōu)選基本上垂直的，或者更優(yōu)選垂直的。然 而，培養(yǎng)支持物基本上可以任何方式定位，只要足夠量的光化射線可達(dá)到微生物。因此，當(dāng) 光生物反應(yīng)器的類型是保護(hù)屏障在固體支持物周圍形成緊密結(jié)合的膜或?qū)訒r(shí)，整個(gè)光生物 反應(yīng)器的優(yōu)選方向是垂直的，但任何方向均可接受。為清楚起見，上述方向(例如，垂直、水 平、基本上垂直、非水平等)是相對(duì)于培養(yǎng)支持物下方的底層或底面而言，假定該底層或底 面是水平的?？衫酶鞣N結(jié)構(gòu)、支架、平臺(tái)、擱物架等以所需方向放置或懸掛培養(yǎng)支持物或整個(gè) 光生物反應(yīng)器。具體地說，培養(yǎng)支持物和/或保護(hù)屏障可懸掛在能懸掛固體培養(yǎng)支持物和 /或光生物反應(yīng)器的繩、線、鉤、纜繩、軌道、鋼軌、鏈、架子、桿、管、支架、平臺(tái)、梁或任何其它 此類結(jié)構(gòu)上，或與其相連。多個(gè)培養(yǎng)支持物和/或光生物反應(yīng)器可懸掛在同一結(jié)構(gòu)上，類似 晾衣繩上懸掛的被單?？伸o態(tài)，或以允許它們移動(dòng)的方式懸掛培養(yǎng)支持物和/或光生物反 應(yīng)器?？?、環(huán)、鉤等的位置優(yōu)選將培養(yǎng)支持物和/或光生物反應(yīng)器的重量基本上平均分布。懸掛光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物(尤其是以垂直方向)在空間上高效，并可提供 操作優(yōu)勢(shì)。然而，本發(fā)明的生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物無需懸掛。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施 方式中，所述培養(yǎng)支持物具有足夠的剛性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如，在支 持物類似于剛性平板、面板、柵格等的實(shí)施方式中，通過將其基底固定或安置于某表面或其 上)定位，其可支持其本身重量并將維持如此定位。在另一實(shí)施方式中，保護(hù)屏障自由樹 立，例如溫室，多個(gè)培養(yǎng)支持物在其內(nèi)懸掛和/或自由樹立。懸掛光生物反應(yīng)器和/或培養(yǎng)支持物(特別是以垂直方向)在空間上高效，可能 提供操作優(yōu)勢(shì)。然而，本發(fā)明的生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物無需懸掛。例如，在本發(fā)明的某些 實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)支持物具有足夠的剛性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如， 在支持物類似于剛性平板、面板、柵格等的實(shí)施方式中，通過將其基底固定或安置于某表面 或其上)定位，其可支持其本身重量并將維持如此定位。在另一實(shí)施方式中，保護(hù)屏障自由 樹立，例如溫室，多個(gè)培養(yǎng)支持物在其內(nèi)懸掛和/或自由樹立。傳送本文還描述了將光生物反應(yīng)器、光生物反應(yīng)器的保護(hù)屏障內(nèi)的培養(yǎng)支持物或它們 的某些組合從一個(gè)位置傳送至另一位置的系統(tǒng)。對(duì)于各種原因，可運(yùn)送光生物反應(yīng)器和/ 或培養(yǎng)支持物的能力是有利的。例如，可以優(yōu)化它們的位置以便接受光線，維持所需溫度 或氣體含量。當(dāng)多個(gè)光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物分屬不連續(xù)步驟，例如接種、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和 /或收獲時(shí)，運(yùn)送能力可特別有利，因?yàn)榭赡懿捎眠B續(xù)型方法將光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物 更有效地移動(dòng)至數(shù)個(gè)指定的位置，而不是將所需材料和設(shè)備運(yùn)送至固定的光生物反應(yīng)器或 培養(yǎng)支持物。因此，即使在接種后，亦可傳送生長(zhǎng)表面，無論是單獨(dú)傳送培養(yǎng)支持物或封閉在保 護(hù)屏障中的培養(yǎng)支持物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉常用于工業(yè)應(yīng)用的多種類型的傳送系統(tǒng)。該 傳送系統(tǒng)不限于任何特定類型，只要其能移動(dòng)一個(gè)或多個(gè)光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物與傳送系統(tǒng)之間的連接類型會(huì)依據(jù)所用 傳送系統(tǒng)的類型而有所不同，可作出選擇與作為培養(yǎng)支持物和/或保護(hù)屏障一部分的任何 固定點(diǎn)共同起作用。雖然預(yù)想能通過一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的機(jī)械方式(例如，通過鏈條和齒輪的作用)傳送培養(yǎng)支持物或光生物反應(yīng)器，但還可用人力傳送它們(例如，簡(jiǎn)單地推動(dòng) 懸掛的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器通過沿著軌道滑動(dòng)的軸承機(jī)構(gòu)連接于軌道)。懸掛光生物反應(yīng)器和/或培養(yǎng)支持物(特別是以垂直方向)的傳送系統(tǒng)在空間上 高效，可能提供操作優(yōu)勢(shì)。但傳送系統(tǒng)無需依賴于將光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物懸掛起來。 例如，光生物反應(yīng)器可沿著傳送系統(tǒng)的頂部移動(dòng)，例如通過在滾筒傳送帶上滑動(dòng)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，該傳送帶系統(tǒng)可移動(dòng)包含封閉在保護(hù)屏障中的培養(yǎng)支持物的光生物反應(yīng)器?；?者，光生物反應(yīng)器的保護(hù)屏障可以是保護(hù)一個(gè)或多個(gè)移動(dòng)多個(gè)培養(yǎng)支持物的傳送帶系統(tǒng)的 大封閉外殼。光生物反應(yīng)器場(chǎng)對(duì)于大規(guī)模應(yīng)用，構(gòu)建具有足夠大小的單個(gè)培養(yǎng)支持物可能不實(shí)際。因此提供了 利用兩個(gè)或數(shù)個(gè)或數(shù)十或數(shù)百或數(shù)千或更多個(gè)培養(yǎng)支持物以便在光生物反應(yīng)器“場(chǎng)”中培 養(yǎng)光合微生物。這些培養(yǎng)支持物可均位于單個(gè)保護(hù)屏障內(nèi)，因此包含單個(gè)光生物反應(yīng)器，或 者多個(gè)培養(yǎng)支持物可以是多個(gè)光生物反應(yīng)器的一部分。在任一情況中，將多個(gè)光生物反應(yīng) 器或培養(yǎng)支持物組織在光生物反應(yīng)器場(chǎng)內(nèi)以便有效操作和處理是有利的。組織它們的配置 以最大程度得到從光源，例如太陽(yáng)獲取的能量也是有利的。這種組織可包括以有序方式配 置多個(gè)光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物，所述方式例如但不限于行、列、同心圓、柵格形式，從 中點(diǎn)向外輻射，等等。在各種實(shí)施方式中，該場(chǎng)包括懸掛在同一結(jié)構(gòu)上，例如軌道、鋼軌、鏈、線等的多個(gè) 光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該結(jié)構(gòu)是傳送系統(tǒng)的一部分，且該光 生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物沿著傳送系統(tǒng)的路徑從一個(gè)位置移動(dòng)至另一位置。光生物反應(yīng)器場(chǎng)可包括一個(gè)傳送系統(tǒng)或經(jīng)配置的多個(gè)傳送系統(tǒng)，從而操控多個(gè)光 生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物。這種配置能放大以便同時(shí)包括兩個(gè)或數(shù)個(gè)或數(shù)十或數(shù)百或數(shù)千 或更多個(gè)傳送系統(tǒng)，從而操控兩個(gè)或數(shù)個(gè)或數(shù)十或數(shù)百或數(shù)千或更多個(gè)光生物反應(yīng)器或培 養(yǎng)支持物。除了傳送系統(tǒng)外，光生物反應(yīng)器場(chǎng)可包括指定的區(qū)域、站或中心以便執(zhí)行諸如接 種、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和/或收獲光合微生物等步驟。這些中心可以是執(zhí)行某些步驟的專門設(shè)備的 位置。傳送系統(tǒng)的路徑可將光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物帶至執(zhí)行特定步驟的此類中心。然 后該光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物可沿之移動(dòng)至序列中的下一區(qū)域或中心。沿傳送系統(tǒng)的不 同光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物可沿著該路徑位于不同中心，因此可同時(shí)進(jìn)行不同步驟。在 一個(gè)實(shí)施方式中，傳送系統(tǒng)的路徑是環(huán)。一旦光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物完成一輪培養(yǎng)過 程中的步驟，其可重復(fù)該過程。留出要被破壞或者最終需要替換的一些單位，基本上可反復(fù) 使用同一套光生物反應(yīng)器或固體培養(yǎng)支持物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可在相同或幾乎相同的位置進(jìn)行培養(yǎng)和收獲。該位置稱 為接種和收獲中心(參見，例如圖幻。在接種和收獲中心接種光生物反應(yīng)器和/或固體培 養(yǎng)支持物。傳送系統(tǒng)形成環(huán)，然后運(yùn)送光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物離開接種和收獲中心。所 述光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物隨后沿著傳送系統(tǒng)的路徑移動(dòng)足以獲得所需細(xì)胞生長(zhǎng)量的 時(shí)間。然后傳送系統(tǒng)將光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物返回接種和收獲中心收獲。多個(gè)傳送系 統(tǒng)可共有它們自此輻射出去的同一接種和收獲中心。如果還需要更大的生產(chǎn)力，光生物反 應(yīng)器場(chǎng)可包括多個(gè)接種和收獲中心以操作多個(gè)傳送系統(tǒng)的光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物。雖 然可實(shí)現(xiàn)效率提高，但接種和收獲位置無需是相同的或幾乎相同的位置。
光生物反應(yīng)器的使用方法培養(yǎng)光合微生物本文所述的固相光生物反應(yīng)器可用于培養(yǎng)光合微生物。可在固相光生物反應(yīng)器 中培養(yǎng)的光合微生物包括但不限于天然光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌，或工程改造的光合微生 物，例如人工光合細(xì)菌。天然具有光合作用或經(jīng)工程改造具有光合作用的示范性微生物包 括但不限于細(xì)菌；真菌沽細(xì)菌；原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動(dòng)物，例如浮游生物、 渦蟲和變形蟲。天然光合微生物的例子包括但不限于極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏 藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、 斜生柵藻、項(xiàng)圈藻、管鏈藻屬、柱孢藻屬、聚球藍(lán)細(xì)菌、集胞藍(lán)細(xì)菌和/或底棲藍(lán)藻。在固相光生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的光合微生物優(yōu)選包括藍(lán)細(xì)菌。可在生物反應(yīng)器中生 長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌可以是藍(lán)藻門的任何光合微生物。在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌可以是單細(xì)胞 或菌落(例如，絲狀、片狀或球狀)形態(tài)。在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌優(yōu)選是單細(xì)胞藍(lán) 細(xì)菌?？稍谏锓磻?yīng)器中生長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌的例子包括但不限于以下屬集胞藍(lán)細(xì)菌、聚球藍(lán) 細(xì)菌、熱聚球藍(lán)細(xì)菌、念珠藍(lán)細(xì)菌、原綠球藻、微囊藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌、螺旋藍(lán)細(xì)菌和粘桿 菌。在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌優(yōu)選集胞藍(lán)細(xì)菌或聚球藍(lán)細(xì)菌(例如，細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 (ATCC 33912)和/或集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 (ATCC 27184))。在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng) 的光合微生物更優(yōu)選如本文公開的經(jīng)工程改造以累積二糖的轉(zhuǎn)基因光合微生物。可給光生物反應(yīng)器的固體培養(yǎng)支持物接種光合微生物，以及添加水分和其它組 分，包括但不限于營(yíng)養(yǎng)物、鹽、緩沖劑、金屬、氮、磷酸、硫等。然后可松脫地密封該光生物反 應(yīng)器，其中培養(yǎng)支持物在保護(hù)屏障內(nèi)。例如，通過懸掛而將密封的光生物反應(yīng)器以能控制光 照和溫度的位置和方式安置。安置可以是靜態(tài)的，或者光生物反應(yīng)器可移動(dòng)，例如以確保在 一天時(shí)間中最大程度接觸太陽(yáng)輻射。光合微生物可培養(yǎng)所需的時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知 道時(shí)間長(zhǎng)度應(yīng)根據(jù)微生物類型和所需的細(xì)胞生長(zhǎng)密度而有所不同。例如，對(duì)于某些藍(lán)細(xì)菌 菌株，約4-約7天內(nèi)的培養(yǎng)期可提供每升當(dāng)量約50-約250克干生物量的細(xì)胞產(chǎn)量。一段 培養(yǎng)時(shí)間后，可打開可松脫密封并收獲光合微生物。本文所用的“每升當(dāng)量干生物量的克數(shù)”是通過計(jì)算在所述培養(yǎng)表面生長(zhǎng)的生物 量層的平均深度(例如，約150微米)并乘以培養(yǎng)表面的長(zhǎng)度和寬度值來確定的單位。該 計(jì)算得到的是體積。然后，使自培養(yǎng)表面收集的生物量的重量與該體積相關(guān)，表示為“每升 當(dāng)量干生物量的克數(shù)”。連續(xù)培養(yǎng)方法如果培養(yǎng)光合微生物的過程可以連續(xù)進(jìn)行，例如流水線那樣，則能實(shí)現(xiàn)更高的效 率。與要求設(shè)備和生產(chǎn)力能一次操控大量生物量，然后在批次之間無事可做不同，連續(xù)系統(tǒng) 要求的總生產(chǎn)力不高，但通過連續(xù)操作能更有效地利用生產(chǎn)力。通過將培養(yǎng)分成更小但更 多的組分，可將諸組分組織成空間上連續(xù)的配置。然后可以同時(shí)進(jìn)行總體生產(chǎn)工藝中的不 同離散步驟。培養(yǎng)組分經(jīng)歷某一工藝步驟后，該組分在工藝中向前移動(dòng)，而另一組分代替其 在該步驟中。因此，終產(chǎn)物的產(chǎn)生不限于大批次的完成，而可隨著各組分完成該流水線樣工 藝而定期產(chǎn)生。此外，一輪工藝完成后，諸組分可立即再次開始該工藝，如此反復(fù)。更具體地說，連續(xù)培養(yǎng)涉及利用可傳送光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物以采用連續(xù)方 式培養(yǎng)光合微生物的方法。連續(xù)工藝應(yīng)理解成允許光生物反應(yīng)器或固體培養(yǎng)支持物從培養(yǎng)工藝的一個(gè)步驟前進(jìn)至另一步驟的空間關(guān)系?；蛘?，可將一個(gè)大的結(jié)構(gòu)支持物用于連續(xù)工 藝中。具體地說，支持物可以是沿某線路(例如，類似于優(yōu)選垂直布置的傳送帶)運(yùn)行的環(huán) 狀材料(例如毛圈織物)。最終的結(jié)果是隨著多個(gè)光生物反應(yīng)器或固體培養(yǎng)支持物順序而 反復(fù)完成該工藝，可實(shí)現(xiàn)定期產(chǎn)生生物量。該類工藝表示大規(guī)模應(yīng)用有機(jī)會(huì)在大但頻率低 的批次中產(chǎn)生生物量的過程中提高效率。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，連續(xù)空間關(guān)系沿著傳送系統(tǒng)的路徑。操作方式類似于流水 線?？梢愿鞣N方式操作此類傳送系統(tǒng)。例如，可不間斷地操作傳送系統(tǒng)，同時(shí)將光生物反應(yīng) 器或培養(yǎng)支持物從一個(gè)位置移動(dòng)至另一位置。在此類實(shí)施方式中，進(jìn)行接種、收獲等的同時(shí) 光生物反應(yīng)器或培養(yǎng)支持物在移動(dòng)?；蛘?，可停止傳送系統(tǒng)以實(shí)施諸步驟，然后光生物反應(yīng) 器或培養(yǎng)支持物重新移動(dòng)至下一步驟的位置。此外，可不間斷地操作傳送系統(tǒng)，將光生物反 應(yīng)器或培養(yǎng)支持物與傳送系統(tǒng)的移動(dòng)相脫離以進(jìn)行處理，然后重新連接從而再次進(jìn)入傳送 流程。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道該通用方案也可能有其它排列。在連續(xù)培養(yǎng)方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在沿著傳送系統(tǒng)的一個(gè)位置接種多個(gè)光生物 反應(yīng)器。然后傳送系統(tǒng)將光生物反應(yīng)器移動(dòng)至進(jìn)行光合微生物培養(yǎng)的區(qū)域。在傳送的該部 分，可以最佳光照而定位該光生物反應(yīng)器以促進(jìn)生長(zhǎng)和光合作用。隨后，光生物反應(yīng)器到達(dá) 可收獲光合微生物的位置。然后光生物反應(yīng)器可沿傳送系統(tǒng)的路徑回到接種點(diǎn)以再次開始 該工藝。為提高效率，可使光生物反應(yīng)器離開接種位置和到達(dá)收獲位置之間的時(shí)間與光合 微生物產(chǎn)生的所需生長(zhǎng)量的時(shí)間一致。該工藝步驟不限于接種、培養(yǎng)和收獲；其它步驟可 包括誘導(dǎo)細(xì)胞合成所需產(chǎn)物或滅菌。雖然，以上實(shí)施方式描述了可傳送光生物反應(yīng)器的系 統(tǒng)，但應(yīng)該知道可在一個(gè)保護(hù)屏障內(nèi)實(shí)施相同類型的連續(xù)培養(yǎng)以便傳送和處理多個(gè)固體培 養(yǎng)支持物。產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法可從更有效地培養(yǎng)光合微生物中獲益的一種技術(shù)是為替代燃料，例如乙醇或生物 柴油而產(chǎn)生生物量。與目前培養(yǎng)以產(chǎn)生生物量的植物，例如玉米、甘蔗、大豆、油菜籽、麻風(fēng) 樹等相比，光合微生物，例如藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生生物量的速率更快，從而可導(dǎo)致更高的生產(chǎn)率。此 外，通過微生物直接產(chǎn)生二糖避免了利用植物生物量產(chǎn)生可發(fā)酵糖的大量能量密集型預(yù)處 理。此外，利用光養(yǎng)微生物替代植物可獲得較高的可發(fā)酵糖產(chǎn)率而沒有土壤耗竭、侵蝕和食 物供應(yīng)轉(zhuǎn)變。與其它微生物相比，優(yōu)選光養(yǎng)微生物，因?yàn)榭蓮沫h(huán)境中供應(yīng)它們的碳源(CO2) 和能源(光)，從而能極其廉價(jià)地培養(yǎng)它們。此外，可利用光養(yǎng)微生物消耗工業(yè)過程的碳排 放，因而提供了進(jìn)一步的環(huán)境益處。從光合微生物產(chǎn)生大量可發(fā)酵糖的一個(gè)難點(diǎn)是它們通常消耗產(chǎn)生的碳水化合物 而非累積它們。雖然某些糖，例如蔗糖或海藻糖不為光合微生物用作主要碳源，但仍有緩慢 同化的機(jī)制。盡管有再處理機(jī)制(reprocessing mechanism)，此類材料可累積而不代謝。 如果能適當(dāng)工程改造生物，則可滅活同化機(jī)制，從而能產(chǎn)生高產(chǎn)量的糖。本文提供由光合微生物產(chǎn)生可發(fā)酵糖，特別是二糖的方法?？砂l(fā)酵糖的例子包括 但不限于蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。所述可發(fā)酵糖優(yōu)選蔗糖或海藻糖。 該方法適用于連續(xù)方式，從而提高生產(chǎn)的成本效率。可利用能合成可發(fā)酵糖的光合微生物實(shí)施該方法的各種實(shí)施方式。一些實(shí)施方式 利用和控制滲透-和基質(zhì)水保護(hù)作用(matric water protection)等天然現(xiàn)象以產(chǎn)生發(fā)酵原料。在一個(gè)實(shí)施方式中，可發(fā)酵糖的合成誘導(dǎo)型的。在另一實(shí)施方式中，可通過遺傳操作 修飾可發(fā)酵糖的合成使之組成地產(chǎn)生。產(chǎn)生可發(fā)酵糖的光合微生物優(yōu)選藍(lán)細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，藍(lán)細(xì)菌根據(jù)誘導(dǎo)型 內(nèi)源性途徑累積二糖。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌根據(jù)工程改造的外源性途徑累積 二糖。上文進(jìn)一步詳細(xì)討論了內(nèi)源性和外源性途徑。轉(zhuǎn)基因光合微生物優(yōu)選上文討論的一種或多種。能累積二糖的藍(lán)細(xì)菌菌株的兩個(gè)非限制性例子是細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942和集 胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803。天然細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942接觸高達(dá)約700mM(其耐受上限)的鹽 濃度后合成蔗糖。當(dāng)通過刪除agp基因阻斷葡糖基甘油生物合成時(shí)，集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 在接觸其耐受上限(可高達(dá)900mM)的鹽濃度后產(chǎn)生蔗糖作為其滲透保護(hù)劑。在一些實(shí)施 方式中，可通過將霧化鹽溶液直接施加于培養(yǎng)表面進(jìn)行鹽誘導(dǎo)。該方法的優(yōu)點(diǎn)之一是根據(jù) 品種的生長(zhǎng)時(shí)間沿著生長(zhǎng)表面可控制地引入施加物，從而能平衡生物量的累積和二糖，例 如蔗糖的產(chǎn)生。為產(chǎn)生可發(fā)酵糖，可在固體培養(yǎng)基上或在液體或凝膠培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)光合微 生物。本領(lǐng)域熟知光合微生物的培養(yǎng)和生長(zhǎng)。因此，除了本文另有注釋，可根據(jù)此類已知的 方法進(jìn)行光合微生物的培養(yǎng)和生長(zhǎng)。例如，經(jīng)工程改造以累積二糖的轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌可在液 體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)。可從此類液體培養(yǎng)基中分離累積的糖，如果其從細(xì)胞中分泌的話。 可從自液體培養(yǎng)基收獲的光合微生物中分離累積的糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)工程改造以 累積海藻糖(如上所述)的轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)?？蓮囊后w培養(yǎng)基中 直接分離從轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌中分泌出的海藻糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)工程改造以累積蔗糖 (如上所述)的轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)?？蓮淖砸后w培養(yǎng)基收獲的工程 改造藍(lán)細(xì)菌直接分離蔗糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)工程改造以累積和分泌蔗糖(如上所述) 的轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)。可從液體培養(yǎng)基中直接分離轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌分 泌的蔗糖。優(yōu)選在誘導(dǎo)之前將光合微生物培養(yǎng)至每升當(dāng)量至少約50克干生物量的較高細(xì)胞 密度?？刹捎帽疚乃龅墓滔喙馍锓磻?yīng)器實(shí)現(xiàn)這種較高的細(xì)胞密度。然后可用濃度確定 的合適鹽化合物處理累積的生物量來啟動(dòng)/誘導(dǎo)二糖(例如，蔗糖)產(chǎn)生，所述合適鹽的濃 度能有效改變通過溶液電導(dǎo)率測(cè)得的培養(yǎng)基中水活性。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，氯化 鈉是所用的鹽。合適的響應(yīng)時(shí)期后(例如，至少約1小時(shí)到不超過約48小時(shí))，可收獲載有 蔗糖的細(xì)胞，并處理以分離和回收產(chǎn)生的蔗糖。合適的響應(yīng)期通常在至少約5小時(shí)到不超 過約M小時(shí)以內(nèi)。更常見的合適響應(yīng)期在至少約10小時(shí)到不超過約20小時(shí)以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，合成的大多數(shù)二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油、甘露糖 基果糖)累積在細(xì)胞內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞分泌所述二糖，然后從光生物反應(yīng)器 中回收。無論二糖是在細(xì)胞內(nèi)還是分泌的，可采用任何合適的收獲方法獲得該二糖，所述方 法包括但不限于施加于培養(yǎng)表面的水性噴霧洗滌液。可收集包含細(xì)胞和/或二糖的洗滌 液，并處理以分離和回收該二糖?，F(xiàn)已詳細(xì)描述了本發(fā)明，應(yīng)該明白可能有改型、變型和等同的實(shí)施方式而不脫離 隨附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍。此外，應(yīng)該知道本說明書中提供的所有實(shí)施例是非限 制性實(shí)施例。實(shí)施例提供以下非限制性實(shí)施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道以下 實(shí)施例公開的技術(shù)代表了發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能良好實(shí)施本發(fā)明的方法，因此可視作構(gòu)成其 實(shí)施方式的實(shí)例。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于本文公開應(yīng)知道可在公開的具體實(shí)施方式
中 作出許多改變并仍能獲得類似或相似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。實(shí)施例1 固相光生物反應(yīng)器構(gòu)建的靜態(tài)樣機(jī)裝置包括anil聚乙烯屏障層和Ziploc 可釋放外套。將60cm2 可呼吸面板整合入一面，將225cm2編織的棉織物培養(yǎng)支持物表面置于其中。用70體積％水 性乙醇處理，然后在50°C用無菌過濾空氣流干燥使該裝置滅菌。將30ml無菌BG-Il培養(yǎng)基 吸附到培養(yǎng)支持物上，然后利用氣溶膠點(diǎn)樣器將細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的預(yù)培養(yǎng)物接 種于生長(zhǎng)表面。在沈！下，在BG-Il培養(yǎng)基中使預(yù)培養(yǎng)物生長(zhǎng)2天，然后接種。將光生物反 應(yīng)器置于維持在33°C的孵育室中，用冷白熒光燈以300微愛因斯坦(microeinstein)照射。 2天后，反應(yīng)器顯示出有機(jī)體的活性生長(zhǎng)，繼續(xù)生長(zhǎng)2天，隨后從培養(yǎng)箱中取出該反應(yīng)器，用 去離子水洗滌生長(zhǎng)表面。蒸發(fā)除去水從而獲得25%ig干重生物量。實(shí)施例2 通過光合微生物產(chǎn)生蔗糖以下是說明通過聯(lián)用光合微生物和光生物反應(yīng)器產(chǎn)生蔗糖的方法的預(yù)言性實(shí)施 例可用。可在約15-40°C的溫度范圍內(nèi)，約60-300微愛因斯坦照射下，二氧化碳濃度為約 0. 2-15體積％的條件下，用集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803或工程改造的集胞藍(lán)細(xì)菌運(yùn)行至少一個(gè) 光生物反應(yīng)器，例如如實(shí)施例1或3所述得本發(fā)明的光生物反應(yīng)器約4-7天。初始培養(yǎng)期 后，可利用氣溶膠噴霧，以濃度范圍約0. 01-1. 5M，更優(yōu)選約0. 2-0. 9M的水性鹽溶液處理該 生長(zhǎng)表面。再培養(yǎng)約1-2天以使蔗糖產(chǎn)生。然后用去離子水洗滌表面以收獲生長(zhǎng)表面。在 進(jìn)一步的實(shí)施方式中，洗滌水是無菌的新鮮培養(yǎng)基，洗滌強(qiáng)度應(yīng)能收集約70-90%的細(xì)胞質(zhì) 量。然后可繼續(xù)培養(yǎng)保留在培養(yǎng)支持物上的生物量作為后續(xù)周期。根據(jù)所用的生長(zhǎng)表面材 料和有機(jī)體，估計(jì)這些培養(yǎng)的產(chǎn)量應(yīng)是約200-600mg干生物量。實(shí)施例3 用吸附劑聚合物包被的固體培養(yǎng)支持物用分散于BG-Il培養(yǎng)基中的無菌1. 5重量％瓊脂的熱溶液浸漬涂布實(shí)施例1所述 類型的靜態(tài)光生物反應(yīng)器的生長(zhǎng)表面。使涂布的生長(zhǎng)表面冷卻和硬化，隨后將該表面插入 滅菌的保護(hù)屏障內(nèi)以形成光生物反應(yīng)器裝置并用實(shí)施例1所述得在預(yù)培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì) 長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌接種?；旧习凑諏?shí)施例1所述進(jìn)行培養(yǎng)和收獲。實(shí)施例4:ASF基因靶通過調(diào)控蔗糖磷酸合酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶(spp)活性來研究藍(lán)細(xì)菌中蔗糖 的生物合成。許多藍(lán)細(xì)菌中早已具有此類活性以便適應(yīng)滲透和基質(zhì)水分應(yīng)激(參見，例如 Lunn, J.E.2002.Plant Physiol 128,1490-1500)。Lunn, J. Ε. (2002. Plant Physiol 128，1490-1500)分析了包括集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942在內(nèi)的幾種生物的sps和spp基因的基因組構(gòu)成。Lurm 提出集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的蔗糖磷酸合酶(SEQ ID NO 3)具有無活性的蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP-樣)結(jié)構(gòu)域和不同的SPP活性。該SPP-樣結(jié)構(gòu)域與spp的同一性水平高，但缺失鹵 代酸脫鹵素酶(haloaciddehalogenase) (HAD)超家族的許多保守性活性位點(diǎn)殘基。雖然還未對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942作研究，但Lurm提出兩種活性均包含在一種酶中。這些酶 的比對(duì)示于圖5。檢索細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942基因組未在染色體上其它處顯示有不同的sps基 因。利用細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942酶(SEQ ID NO :2)，從而無需多基因表達(dá)。雖然PCC 7942 的基因稱為sps，但由于它是攜帶SPS和SPP活性的一種酶融合體，其根據(jù)活性SPS/SPP融 合體而稱為asf (SEQ ID NO :1)(不同SPP酶的可能表達(dá)的進(jìn)一步信息見下文)。表達(dá)細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 794hsf基因產(chǎn)物(SEQ ID NO 2)有兩種方法。第一種方法是根據(jù)寬范圍宿主的載體PMMB67EH構(gòu)建的基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng) (Furste, J. P. , Pansegrau, W. , Frank, R. , Blocker, H. , Scholz, P. , Bagdasarian, Μ.禾口 Lanka, Ε. 1986. Gene 48,119-131) 質(zhì)粒 pMMB67EH 是 RSF1010 的衍生物，其在大多數(shù)革蘭 氏陰性，甚至在一些革蘭氏陽(yáng)性有機(jī)體中復(fù)制，因而能對(duì)大腸桿菌、集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803、 細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942和各種其它藍(lán)細(xì)菌中的蔗糖產(chǎn)生作基于質(zhì)粒的分析(Kr印s，S.， Ferino, F. , Mosrin, C. , Gerits, J. , Mergeay, M.禾口 Thuriaux, P. 1990. Mol Gen Genet221, 129-133 ；Marraccini, P. , Bulteau, S. , Cassier-Chauvat, C. , Mermet-Bouvier, P.禾口 Chauvat, F. 1993. Plant Molecular Biology 23,905-909 ；Gormley, Ε. P.禾口 Davies， J. 1991. J Bacteriology 173,6705-8)。第二種方法是穩(wěn)定整合入集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的染 色體的UPP (尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)基因座。出于下述原因選擇UPP基因座。實(shí)施例5 基于質(zhì)粒的表達(dá)為基于質(zhì)粒表達(dá)asf基因產(chǎn)物設(shè)計(jì)兩種質(zhì)粒PLybALll (參見，例如圖6 ；SEQ ID NO 19)和pLybAL12(參見，例如圖7 ；SEQ ID NO 20)。構(gòu)建質(zhì)粒pLybAL12以便從預(yù)定的 啟動(dòng)子表達(dá)，構(gòu)建PLybALll以便從隨機(jī)選擇的啟動(dòng)子表達(dá)。如下所示構(gòu)建兩種質(zhì)粒。采用全細(xì)胞作為模板，利用以下寡核苷酸，通過PCR擴(kuò)增 細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的asf基因，從而產(chǎn)生SEQ ID NO :1所示產(chǎn)物5' -AGACTACAAT TGGGGCGTTTTCTGTGAG-3' (MfeI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)是在核苷酸位置7_12) (SEQ ID NO 7)禾卩 5' -CTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTCTGAAAAGGTTAAGCGATCGCCTC-3' (SEQ ID NO :8)。在含和不含上游啟動(dòng)子的情況下，從pBeloBACll (GenBank登錄號(hào)冊(cè)111；3)擴(kuò)增編 碼氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因(cat)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從pBeloBACll擴(kuò)增缺乏啟動(dòng)子的cat基因，從而產(chǎn) 生 SEQ ID N0:11 所示產(chǎn)物5' -TTATCGCGATCGTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAG-3 ‘ (SEQ ID NO 9)和 5' -CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3‘ (SEQ ID NO 10) (PvuI和 PmlI 限 制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)分別是在核苷酸位置4-9和10-15)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從pBeloBACll擴(kuò)增攜帶啟動(dòng)子的cat基因，從而 產(chǎn)生 SEQ ID NO :14 所示產(chǎn)物5 ‘ -TTTTGGCGATCGTGAGACGTTGATCGGCACGTAAG-3 ‘ (SEQ IDNO 12)和 5' -CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3‘ (SEQ IDNO 13) (PvuI 和 PmlI 限 制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)分別在核苷酸位置7-12和10-15)。用PvuI消化攜帶cat基因的PCR產(chǎn)物，用T4DNA聚合酶填平末端。然后將它們分 別與asf PCR產(chǎn)物連接。通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的產(chǎn)物，用MfeI和RiilI消化，然 后用T4DNA連接酶連接于用EcoRI和HpaI消化的pMMB67EH的6. 6Kbp產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)的ΝΕΒδα (馬薩諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs ；IpSWich，MA))，37°C下，在補(bǔ)加了 100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂上作選擇。 37°C下，在補(bǔ)加了 100微克/毫升氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)所選的候選物以便小量制備，通 過限制性核酸內(nèi)切酶消化分析，然后利用以下寡核苷酸通過序列分析驗(yàn)證5' -GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3' (SEQ ID NO 15)、5' -TATCACTTATTCAGGCGTAGCAACCAG-3‘ (SEQ ID NO 16)、5' -GTCGTTAGTGACATCGACAACACACTG-3‘ (SEQ ID NO 17)和5' -GATCGCGATACTGATCGAGATAGGTC-3 ‘ (SEQ ID NO: 18)。選擇 pLybAL 11 的候 選號(hào) 5(pLybALll-5) (SEQ ID NO :19)和 pLybAL12 的候選號(hào) 1 (pLybAL12_l) (SEQ ID NO :20) 作進(jìn)一步研究。根據(jù)小量制備期間的質(zhì)粒產(chǎn)量，在大腸桿菌菌株NEB Turbo (馬薩諸塞州伊普斯威 奇新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)中增殖時(shí)，這些質(zhì)粒的拷貝數(shù)顯示極大減少，提示宿主菌株的選 擇對(duì)這些質(zhì)粒的重要性。實(shí)施例6:啟動(dòng)子插入選擇6個(gè)啟動(dòng)子插入pLybAL12_5。選擇編碼氨基甲酰磷酸合酶的集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC 6803carB的推定啟動(dòng)子，因?yàn)樗卩奏ず途彼嵘锖铣芍械淖饔枚赡苁菑?qiáng)啟動(dòng) 子，其可能緊鄰基因PyrR的上游，在此情況中它們作為操縱子共同轉(zhuǎn)錄。集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 (Aichi，M.，Takatani，N.和 Omata, T. 2001. J Bacteriol. 183,5840-5847)和細(xì)長(zhǎng)聚 球藍(lán)細(xì)菌 PCC 7942 (Maeda, S-I.等.1998. J Bacteriol 180，4080-4088)的硝酸鹽還原酶 (nirA)啟動(dòng)子因?yàn)槟芡ㄟ^氮源調(diào)節(jié)而選擇。還選擇細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的光系統(tǒng)II Dl 蛋白(psbAII)的強(qiáng)光照階段啟動(dòng)子(Golden, S. S. ,Brusslan, J.和 Haselkorn，R. 1986. EMBO Journal 5，2789-2798)和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的兩個(gè)暗階段啟動(dòng)子[dnaK (Aoki， S. , Kondo, T.和 Ishiura M. 1995. J Bacteriol 177,5606-11)和 kaiA(Kucho，K-I. 等.2005. J BaCteriO1187，2190-2199)]作為調(diào)節(jié)的藍(lán)細(xì)菌衍生啟動(dòng)子。最后，選擇已顯 示在藍(lán)細(xì)菌中有活性的入^溫度調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(Ferino，F(xiàn).和Chauvat，F(xiàn). 1989. Gene 84， 257-66 ；Mermet-Bouvier, P.禾口 Chauvat，F(xiàn). 1994.Current Microbiology 28，145—148)。采用全細(xì)胞作為模板，利用以下寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子，從而產(chǎn)生所示產(chǎn) 物。引入用于克隆的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)示于序列中。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 pyrR(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :23)5' -CGGTGTGCATGCCGTTATTGATGGAATG-3' (SEQ ID NO :21)和5' -TCACTAGGTACCTMATTACCTGGGAAGCCAG-3' (SEQ ID NO :22)，二者的限制性核 酸內(nèi)切酶位點(diǎn)在核苷酸位置7-12。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803nirA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :26)5' -CCCAAGGCATGCAGGAAAACAAGCTCAGAATGCTG-3' (SEQ IDNO :24)禾口5' -TTTATTGGTACCAACGCTTCAAGCCAGATAACAGTAGAGATC-3' (SEQ ID NO :25)，二者 的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)在核苷酸位置7-12。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942psbAII (Sphl/Kpnl)(SEQ ID NO :29)5' -ATCTTTGCGTTCCGTGACGGCTACTG-3' (SEQ ID NO :27)和5' -GCAGATGGTACCGGTCAGCAGAGTG-3‘(在核苷酸位置7_12具有限制性核酸內(nèi)切 酶位點(diǎn))(SEQ ID NO 28)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942nirA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :32)5' -CAGCCAGCATGCATAAATTTCTGTTTTGACCAAACCATCC-3' (SEQ ID NO :30)和5' -GTGGCTGGTACCATGGATTCATCTGCCTACAAAG-3' (SEQ ID NO :31)，二者在核苷酸 位置7-12具有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增XPK(XbaI/KpnI) (SEQ IDNO :35) 5' -GTGCATTCTAGATGGCTACGAGGGCAGACAGTAAG-3' (SEQ ID NO 33)禾口5‘ -TTCTGTGGTACCATATGGATCCTCCTTCTTAAGATGCAACCATTATCACC-3‘ (SEQ ID NO 34)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 dnaK(SphI/ KpnI)(SEQ ID NO :38) 5' -GCCCCAGCATGCACCAGTAAACATAAATCTC-3' (SEQ ID NO :36)和5' -ATTGGTGGTACCGAGGTCAATCCCMCAAC-3' (SEQ ID NO :37)，二者在核苷酸位置 7-12具有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細(xì)胞擴(kuò)增集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 kiaA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :41)5' -GCCAGAGCATGCAAAGCTCACTAACTGG-3' (SEQ ID NO :39)和5' -GGAAAAGGTACCTGAGTCTATGGGCAACGTG-3' (SEQ ID NO :40)，二者在核苷酸位 置7-12具有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。擴(kuò)增后，用以上顯示的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，凝膠純化并連接入類似 消化的 pLybAL12-l，從而分別產(chǎn)生質(zhì)粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO: 45)、pLybAL17(SEQ ID NO :46)、pLybAL18 (SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、 pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL21 (SEQ ID NO :50)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入電感受態(tài) ΝΕΒ5α (馬薩諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)，30°C下，在補(bǔ)加了 100微克/毫升 氨芐青霉素、34微克/毫升氯霉素和5%蔗糖的LB瓊脂上作選擇。30°C下，在補(bǔ)加了 100 微克/毫升氨芐青霉素、34微克/毫升氯霉素和5%蔗糖的LB中培養(yǎng)所選的候選物以便小 量制備，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化分析，然后利用以下寡核苷酸通過序列分析驗(yàn)證5' -GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3' (SEQ ID NO :42)和5 ‘ -ATGGGTCTGAATGTGCAGAATGTAGAG-3 ‘ (SEQ ID NO 43)。分別為質(zhì)粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO :45)、pLybAL17 (SEQ ID NO :46)、 pLybAL18(SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、pLybAL21 (SEQ ID NO :49)禾口 pLybAL21 (SEQ ID NO :50)選擇候選物 6 和 7 (pLybAL15-6 和 pLybAL15_7)、2 (pLybAL16_2)、 4 和 5 (pLybAL17-4 和 pLybAL17-5)、1 和 2 (pLybAL18-l 和 pLybAL18-2)、1 和 2 (pLybAL19-l 和 pLybAL19-2)、3 和 5 (pLybAL21-3 和 pLybAL21_5)及 4 和 8 (pLybAL22-4 和 pLybAL22_8)，在補(bǔ)加了蔗糖和兩種抗生素的LB上選擇和生長(zhǎng)這些質(zhì)粒對(duì)于獲得克隆是必要 的。最初在只補(bǔ)加氨芐青霉素的LB上進(jìn)行選擇，但不能分離含有啟動(dòng)子的質(zhì)粒。分離物或者僅是載體的重新連接，或者大小不一并且在氯霉素存在下缺乏增殖的能力。據(jù)認(rèn)為，不斷 產(chǎn)生的內(nèi)部蔗糖對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生滲透壓休克，從而導(dǎo)致阻止蔗糖產(chǎn)生的缺失。隨后的實(shí)驗(yàn)表明， 一旦分離，質(zhì)粒在沒有蔗糖存在下穩(wěn)定，可能通過最終誘導(dǎo)滲透應(yīng)激機(jī)制和/或蔗糖消耗 酶。實(shí)施例7 集胞藍(lán)細(xì)菌和聚球藍(lán)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化除非利用表述，與 Elhai，J.和 Wolk，C. P. 1988. Methods in Enzymologyl67, 747-754所述一樣，通過三親代接合(triparental conjugation)將含啟動(dòng)子的質(zhì) 粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO :45)、pLybAL17 (SEQ ID NO :46)、 pLybAL18(SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、pLybAL21 (SEQ ID NO :49)禾口 pLybAL21(SEQ ID NO :50)以及無啟動(dòng)子的 pLybAL12_l 載體(SEQ ID NO :20)(參見實(shí)施例 5-6)置于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942中。離心沉淀在30°C培養(yǎng)的負(fù)荷菌株(cargo strain)(攜帶帶轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的NEB5 α )的 過夜培養(yǎng)物以及攜帶輔助質(zhì)粒pRK2013(ATCC 37159)的HB101的過夜培養(yǎng)物，用LB洗滌兩 次，然后以1/10的原始體積重懸在LB中。30°C下，在恒定照射下用BGll-A使各藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng) 至OD73tl約為0. 5，所述BGl I-A與BGl 1相同，除了痕量元素替換為Nitsch痕量元素(Nitsch， J. P.和 Nitsch，C. 1956. American Journal of Botany 43，839_851)。離心沉淀的細(xì)胞成 小團(tuán)，用BGll-A洗滌兩次，重懸在含濃度增加7. 5-倍的BGll-A中。制備BGll-A的藍(lán)細(xì)菌 10倍系列稀釋液直至10_5。將100微升各稀釋液的藍(lán)細(xì)菌與各50微升的大腸桿菌負(fù)荷和 輔助菌株混合。然后將150微升的各混合物涂布到補(bǔ)加5% LB的BGll-A瓊脂(1. 5% )平 板上。在沈_281，恒定照射下溫育諸平板16-M小時(shí)。抬起各平板上的瓊脂(約30ml)， 加入300微升100X氯霉素溶液。對(duì)于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803氯霉素的終濃度是25 μ g/ml, 對(duì)于細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942是7. 5 μ g/ml。繼續(xù)溫育8_12天。在補(bǔ)加了適當(dāng)量的氯霉 素的BGll-A上反復(fù)劃線從污染大腸桿菌中純化轉(zhuǎn)化接合子的各菌落，從而再次獲得分離 的菌落。實(shí)施例8 :pLybALl 1-5中的啟動(dòng)子文庫(kù)以下實(shí)施例描述了利用pLybALll_5(SEQ ID NO :19)(參見實(shí)施例5)構(gòu)建藍(lán)細(xì) 菌DNA文庫(kù)以選擇啟動(dòng)子。采用改進(jìn)、放大的Wilson，K. (1997. Preparation of Genomic DNA from Bacteria(制備細(xì)菌的基因組 DNA) ·干Ij于 Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學(xué)方法).約翰威利父子公司(John Wiley and Sons)第1卷，第 2. 4. 1-2. 4. 5頁(yè))的染色體DNA分離方案，其中主要的不同在于溫育時(shí)間更長(zhǎng)和用肌氨酰 (Sarkosyl)替代SDS。分離的DNA數(shù)量足以進(jìn)行部分Sau3AI消化以插入pLybALll_5的 BamHI位點(diǎn)。如圖8所示，一些片段具有啟動(dòng)子，而另一些沒有。在文庫(kù)構(gòu)建過程中，在基因asf內(nèi)發(fā)現(xiàn)可能的啟動(dòng)子。要起到啟動(dòng)子克隆載體的 作用，當(dāng)啟動(dòng)子插入asf基因之前時(shí)，質(zhì)粒pLybALll-5(SEQ ID NO 19)應(yīng)只耐受氯霉素， 因?yàn)樵摌?biāo)記缺乏其正常的啟動(dòng)子并且不包括asf上游的啟動(dòng)子。然而，一旦構(gòu)建，在大腸桿 菌中檢查該質(zhì)粒賦予的氯霉素抗性。在37°C下，在補(bǔ)加了 34微克/毫升氯霉素的LB瓊脂 (1.5% )上培養(yǎng)攜帶pLybALll-5的ΝΕΒ5α?xí)r，觀察到生長(zhǎng)。然而，在補(bǔ)加了 34微克/毫 升氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)幾乎未觀察到至未觀察到。攜帶pLybAL12-l (SEQ ID NO 20)的ΝΕΒ5α在有氯霉素存在時(shí)，在固體和液體LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
為驗(yàn)證asf基因上游沒有缺失的啟動(dòng)子，而在轉(zhuǎn)錄終止子下游，利用盧西根公司 的克隆輕松試劑盒(Lucigen CloneSmart kit)與大腸桿菌的盧西根菌株(E. cloni 10G) 感受態(tài)細(xì)胞將置于PMMB67EH中以制備pLybALll的插入物克隆入威斯康星州米德爾頓的盧 西根公司(Lucigen Corp.，Middleton，WI)的pSMART-LCKan平端克隆載體(參見圖9)。由 于是平端克隆，該插入物可以任一方向與質(zhì)粒連接，從而產(chǎn)生pLybAL13f (SEQ ID NO :51)和 pLyAL13r(SEQ ID NO :52)。通過用終止子圍繞克隆位點(diǎn)將該載體專門設(shè)計(jì)成從載體消除轉(zhuǎn) 錄通讀。作為對(duì)照，用于構(gòu)建pLybAL12的插入物也置于該載體中，從而產(chǎn)生pLybAL14f (SEQ ID NO 53)和pLybAL14r(SEQ IDNO :54)。這些質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠上看起來大小合適，但插 入物未經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證來證實(shí)克隆的完整性。然而，攜帶pLybAL13和pLybAL14 (攜帶以正 向或反向連接的克隆DNA)的E. clonilOG觀察到類似結(jié)果，分別與攜帶pLybALll (SEQ ID NO 19)和pLybAL12(SEQ ID NO :20)的NEB5 α觀察到的一樣。這表明該啟動(dòng)子在大腸桿 菌中的活性弱。許多大腸桿菌啟動(dòng)子在藍(lán)細(xì)菌中不起作用，反之亦然?？赡苁窃搯?dòng)子活性在集 胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803或細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942中觀察不到。為檢查這一點(diǎn)，如上所述通 過接合將pLybALll-5(SEQ ID NO :19)插入兩種有機(jī)體中。在補(bǔ)加了氯霉素(對(duì)于集胞藍(lán) 細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942分別是25 μ g/ml和7. 5 μ g/ml)的BGll-A瓊 脂(1.5%)上觀察到生長(zhǎng)。檢測(cè)攜帶pLybALll_5(SEQ ID NO 19)的這些有機(jī)體在含氯霉素的液體BGll-Ai 的生長(zhǎng)。該活性可能非常弱，僅在存在于多拷貝質(zhì)粒上時(shí)觀察到。對(duì)于大腸桿菌可能是這 種情況，但對(duì)于藍(lán)細(xì)菌可能不是。RSF1010是較低拷貝的質(zhì)粒，在大腸桿菌中僅有12拷貝 (Frey, J. , Bagdasarian, Μ. M.和 Bagdasarian，M. 1992). Gene 113，101—106)。經(jīng)歷快速分 裂的大腸桿菌具有最多2拷貝的其染色體，因此拷貝數(shù)增加至少6-倍。該質(zhì)粒在藍(lán)細(xì)菌中 可能有相當(dāng)?shù)目截悢?shù)。集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的染色體拷貝數(shù) 類似，分別是 10-12 和 16(Labarre，J.，Chauvat，F(xiàn).和 Thuriaux，P. 1989. J Bacteriol 171， 3449-57)。以上結(jié)果提示藍(lán)細(xì)菌的asf基因中存在啟動(dòng)子。圖10顯示asf基因中啟動(dòng)子(或多個(gè)啟動(dòng)子)可能的位置。Curtis，S. E. [1994. The transcription apparatus and the regulation of transcriptioninitiation ( 錄裝置和轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控).刊于The Molecular Biology ofCyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌的 分子生物學(xué)).Bryant，D. Α.(編).克魯維學(xué)術(shù)出版社(Kluwer Academic Publishers) 第 613-699 頁(yè)]描述了轉(zhuǎn)錄起始元件。Sazuka，Τ.和 Ohara，0. (1996. DNA Research 3, 225-232)限定了翻譯起始元件。根據(jù)與已知SPS酶的比對(duì)和終止密碼子僅存在于上游兩個(gè)密碼子處，預(yù)計(jì)asf基 因的翻譯起始開始于GTG起始密碼子處。雖然ATG起始密碼子是最常用的，GTG和TTG是 較不常用的，但不是罕用的。除了間隔略遠(yuǎn)一些，還存在與16S rRNA的3’ -端互補(bǔ)的典型 大腸桿菌-樣Siine-Delgarno序列(GGAG或GAGG)，其中腺嘌呤核苷酸最好離也存在的起 始密碼子的第一個(gè)核苷酸9_12bp。該序列見于Mzuka和Ohara研究的約一半基因中。略 差的最適間隔并不罕見，但常導(dǎo)致表達(dá)水平降低。Siine-Delgarno序列上游但在MfeI位點(diǎn) 下游的序列太短從而不能引入啟動(dòng)子?？赡芤氩糠謫?dòng)子，但啟動(dòng)子的其余部分必須由 所有三種質(zhì)粒(pLybALll-5(SEQ ID NO :19) ；pLybAL13f (SEQ ID NO :51)禾口 pLybAL13r (SEQID NO 52))的載體序列產(chǎn)生，這是不可能的。因此，啟動(dòng)子活性可能位于asf基因內(nèi)。如果該啟動(dòng)子在asf基因內(nèi)，一個(gè)可能的 位置是在asf的SPP結(jié)構(gòu)域之前。這樣會(huì)得到細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的蔗糖生物合成 酶，其四級(jí)結(jié)構(gòu)類似于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的那些。各有機(jī)體具有彼此可能相互作用(或 不相互作用)的兩種蛋白質(zhì)，帶翻譯稠合的SPP或SPP樣結(jié)構(gòu)域的SPS結(jié)構(gòu)域以及不同的 SPP。首先測(cè)定asf的SPP結(jié)構(gòu)域是否甚至分別翻譯。從圖10和表1可以看出，TTG起 始密碼子緊鄰SPP結(jié)構(gòu)域上游，其前是aiine-Delgarno序列。表1 直接圍繞提出的spp起始密碼子的核苷酸。直接圍繞提出的spp起始密碼子 的核苷酸與72個(gè)藍(lán)細(xì)菌基因的共有序列比較。匹配共有序列的核苷酸以斜體字顯示，而與 共有序列不匹配的核苷酸以下劃線顯示。相對(duì)于起始密碼子的第一核苷酸給核苷酸編號(hào)。
NT#-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 123 4 5 6
共有序列A/G A/G Α/Τ Α/Τ Α/Τ Α/Τ Α/Τ A/T C/T T/C ATG A/G C C/T
Selo7942asfTGACTAGCGC GTG G CA
Selo7942sppTCGCAAACGC TTG A T T圍繞起始密碼子的區(qū)域幾乎與Mzuka和Ohara測(cè)定的72個(gè)藍(lán)細(xì)菌基因的共有序 列以及天然起始密碼子匹配。雖然根據(jù)大腸桿菌啟動(dòng)子建立的規(guī)則測(cè)定了藍(lán)細(xì)菌啟動(dòng)子， 但仍檢索了典型的-35和-10元件，因?yàn)閱?dòng)子確實(shí)在大腸桿菌顯示活性。鑒定了兩種可 能的啟動(dòng)子，如圖10所示。asf中其它處還可能有其它啟動(dòng)子。實(shí)施例9 將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移至藍(lán)細(xì)菌采用接合將基于PMMB67EH的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入藍(lán)細(xì)菌。已有方法轉(zhuǎn)化這些有機(jī) 體(Zang, X. , Liu, B. , Liu, S. , Arunakumara, K. K. I. U.禾口 Zhang, Χ. 2007. Journal of Microbiology 45, 241-245 ;Golden,S. S.禾口Sherman,L. A. 1984. Journal of Bacteriology 158，36-42)，但這些方法未能采用天然轉(zhuǎn)化將這些質(zhì)粒成功置于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和 細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942中。驗(yàn)證藍(lán)細(xì)菌中是否存在質(zhì)粒。通過asf/cat基因與以下寡核苷酸的組合的PCR產(chǎn) 生3. Ikb產(chǎn)物來分析轉(zhuǎn)化接合子中是否存在質(zhì)粒5 ‘ -AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3 ‘(SEQ ID N0:7)和 5' -GGTGGTTGTGTTTGACAGCTTATC-3‘ (SEQ ID NO :5 。此外，分離 并分析質(zhì)粒。離心沉淀在補(bǔ)加了氯霉素(濃度如上所述)的BGll-A中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物， 在TE中重懸，熱處理并利用普羅美加大師SV+小量制備試劑盒(Promega Wizard SV Plus miniprep kit)小量制備。但由于產(chǎn)量差，難以直接分析質(zhì)粒。如此，分離的DNA轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌ΝΕΒδα，利用普羅美加大師SV+小量制備試劑盒再分離，然后進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切 酶分析。實(shí)施例10 蔗糖產(chǎn)生測(cè)定和分析測(cè)定用pLybAL19或pLybAL17轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌(參見實(shí)施例7)的蔗糖累積 情況。利用加利福尼亞州山景市的生物視點(diǎn)公司的蔗糖測(cè)定試劑盒(BioVision，Inc., Mountain View, CA)檢測(cè)蔗糖。誘導(dǎo)4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)定(對(duì)于pLybAL17 (SEQ ID NO :46) 將光照從50微愛因斯坦增加至180微愛因斯坦，對(duì)于pLybAL19 (SEQ ID NO :48)將溫度從26增加至39°C )。根據(jù)細(xì)胞中存在的背景葡萄糖校正數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示用pLybAL19 (SEQ ID NO :48)轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌累積0. 78納摩爾蔗糖/ 毫克干生物量。結(jié)果還顯示用pLybAL17(SEQ ID NO :46)轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌累積0. 95納摩
爾蔗糖/毫克干生物量。進(jìn)一步分析大腸桿菌、集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942中基于質(zhì) 粒的蔗糖產(chǎn)生。由于細(xì)菌可消耗蔗糖，檢測(cè)可能困難。因此，在抑制條件下培養(yǎng)細(xì)胞，然后在 誘導(dǎo)后立刻測(cè)定。可利用尿嘧啶培養(yǎng)來抑制PyrR啟動(dòng)子，并通過轉(zhuǎn)移缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基 誘導(dǎo)?？衫娩@離子作為氮源培養(yǎng)來抑制nirA啟動(dòng)子，并通過轉(zhuǎn)移至硝酸鹽作為氮源的培 養(yǎng)基誘導(dǎo)?？蓪sbAII啟動(dòng)子從低光移至高光?？蓪惦A段啟動(dòng)子從光亮移至黑暗?？?將λ ρκ啟動(dòng)子從低溫(25°C )移至高溫(39°C )。實(shí)施例11 通過穩(wěn)定染色體整合的表達(dá)插入蔗糖生物合成基因可對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致難以完全分離10-16個(gè) 染色體。對(duì)于抗生素抗性標(biāo)記的常規(guī)選擇，具有額外拷貝的標(biāo)記不會(huì)顯著影響細(xì)胞在有抗 生素存在下的存活。因此，但面臨負(fù)表型時(shí)，采用抗生素選擇難以獲得完全染色體分離。在大多數(shù)有機(jī)體中，刪除upp基因(編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)導(dǎo)致對(duì)其它 情況中毒性5-氟尿嘧啶有抗性。為獲得完全抗性，必須刪除所有拷貝的upp基因。因此， 整合入集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 (SEQ ID NO 56)和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942 (SEQ ID NO 58) 的upp基因座將導(dǎo)致5-氟尿嘧啶抗性并能正選擇完全分離，即使有負(fù)表型存在。實(shí)施例12 =UPP/卡那霉素抗性表達(dá)盒利用upp/卡那霉素抗性表達(dá)盒的基因組操作的通用方案概述于圖11。描述了基 因刪除，但該方案不難在插入和突變的“替代”步驟作改變。構(gòu)建了 upp/卡那霉素抗性表達(dá)盒。按照生產(chǎn)商的方案，用埃匹中心生物技術(shù)公司 的拷貝控制克隆試劑盒(Epicentre Biotechnologies CopyControlcloning kit)，以平端 克隆載體PCCl和大腸桿菌菌株EPI300構(gòu)建該表達(dá)盒。利用以下寡核苷酸從全細(xì)胞擴(kuò)增枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的upp基因從而產(chǎn)生SEQ ID NO 62所示產(chǎn)物5' -AAGAAGCAAGACAGCGTGTAGCTGCTCTGACTG-3' (SEQ ID NO :60)和5' -TCCCGGGATTTGGTACCTTATTTTGTTCCAAACATGCGGTCACCCGCATC-3'(在核苷酸 位置2-7和12-17具有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn))(SEQID NO 61)。如埃匹中心生物技術(shù)公司方案所述，將PCR產(chǎn)物克隆入pCCl，利用補(bǔ)加了氯霉素 的LB選擇攜帶插入物的那些。相對(duì)于lacZ，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化作正向篩選，產(chǎn)生 pLybAL7f(SEQ ID NO :65)。利用候選物 3 和 8 (pLybAL7_3 和 pLybAL7_8)的以下寡核苷酸， 通過DNA測(cè)序驗(yàn)證插入物的確切序列5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘ (SEQ ID NO 63) 和 5' -CACACAGGAAACAGCTATGACCAT-3‘ (SEQ ID NO :64)。利用以下寡核苷酸擴(kuò)增Lybradyn載體pLybAAl [最初衍生自pACYC177 (Rose， R. Ε. 1988. Nucleic Acids Res. 16,356]的卡那霉素抗性標(biāo)記，從而產(chǎn)生 SEQ ID NO :68 所 示產(chǎn)物5 ‘ -GTCAGTGCACTGCTCTGCCAGTGTTACAACC-3 ‘(在核苷酸位置 5-10 處具有 ApaLI 限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn))(SEQ ID NO 66)和 5' -CTCAGTGGCGCCAAAACTCACGTTAAGGGATTTTG GTC-3' (SEQID NO 67)(在核苷酸位置7_12處具有NarI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn))。用ApaLI和NarI消化PCR產(chǎn)物，連接入類似消化的pLybAL7f，從而產(chǎn)生pLybAL8f(SEQ ID NO :69)。用補(bǔ)加了 50 μ g/ml新霉素的LB選擇合適的質(zhì)粒，并通過限制 性核酸內(nèi)切酶消化檢查。實(shí)施例13 =UPP缺失迫使染色體插入物分離以表達(dá)包括蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖的 糖的一種方案采用刪除染色體的upp，從而導(dǎo)致耐受5-氟尿嘧啶。雖然已在許多有機(jī)體中 (例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)建立了該方案，但對(duì)于藍(lán)細(xì)菌，例如集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942，以前未建立該方案。測(cè)試顯示1 μ g/ml 5-氟尿嘧啶完全抑制這些有機(jī)體各自的生長(zhǎng)。0. 5 μ g/ml5-氟 尿嘧啶完全抑制集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的生長(zhǎng)，該藍(lán)細(xì)菌對(duì)低至0. 1 μ g/ml的5-氟尿嘧啶 亦敏感。用寡核苷酸kpupp-F(SEQ ID NO :96)和 Sspupp-R(SEQ ID NO :97)擴(kuò)增集胞 藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的upp基因和周圍序列。用寡核苷酸kloupp-F(SEQ ID NO :98)和 Seloupp-R(SEQ ID NO 99)擴(kuò)增細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的upp基因和周圍序列。然后按 照生產(chǎn)商的使用說明書，將PCR產(chǎn)物(集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的upp，SEQ ID NO :100;細(xì)長(zhǎng) 聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的upp，SEQ ID NO :101)克隆入威斯康辛州麥迪遜市埃匹中心生物技 術(shù)公司的平端克隆載體PCCl。雖然將PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO :100或SEQ ID NO :101)可以任一方向連接入pCCl， 但選擇相當(dāng)于lac啟動(dòng)子的正向，從而分別產(chǎn)生pLybAL3f(SEQ ID NO :102)(含有集胞藍(lán)細(xì) 菌 PCC 6803 的 upp)和 pLybAL5f (SEQ IDNO 103)(含有細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC 7942 的 upp)。 利用寡核苷酸T71ong(SEQ ID NO 104)和M13rev (SEQ ID NO :105)測(cè)序插入物。集胞藍(lán) 細(xì)菌PCC 6803的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO :111所示，多肽序列如SEQ IDNO :112所 示。細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO :113所示，多肽序列如 SEQ ID NO 114 所示。通過除去BlpI和ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然后用T4DNA連接酶再 環(huán)化而從 pLybAL3f (SEQ ID NO :102)產(chǎn)生質(zhì)粒 pLybAL4f (SEQ ID NO :106)。然后用 AvrII 和SgfI消化pLybAL4f，用T4DNA聚合酶填平末端，隨后用T4DNA連接酶再環(huán)化刪除集胞藍(lán) 細(xì)菌 PCC 6803 的部分 upp 基因，從而產(chǎn)生 pLybAL9f(SEQ ID NO :107)。從 pLybAL9f (SEQ IDN0:107)切下攜帶藍(lán)細(xì)菌DNA的SacI/SphI片段(SEQ ID NO 108)，連接入類似消化 的 pAR0180 (序列未完全知曉；Parke, D. 1990. Construction ofmobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19 (衍生自質(zhì)粒 RP4、pUC18 和 pUC19 的可移 動(dòng)載體的構(gòu)建).Gene 93 :135-137 ；ATCC77123)，從而產(chǎn)生pLybAL25。通過除去SapI和 ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然后用T4DNA連接酶再環(huán)化而從pLybAL5f產(chǎn)生質(zhì)粒 pLybAL6fb (SEQ ID NO :109)。然后用 BssHII 和 BsaI 消化 pLybAL6fb，用 T4DNA 聚合酶填 平末端，隨后用T4DNA連接酶再環(huán)化刪除細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的部分upp基因，從而 產(chǎn)生 pLybAL10fb(SEQ ID NO :110)。從 pLybALlOfb 切下攜帶藍(lán)細(xì)菌 DNA 的 &icI/SphI 片 段(SEQ ID NO :138)，連接入類似消化的pAR0180，從而產(chǎn)生pLybAI^6。將質(zhì)粒pLybAL25和pLybAL26置于大腸桿菌S17-1 (ATCC 47055)中。質(zhì)粒 pLybAL25和pLybAI^6有待通過雙親接合轉(zhuǎn)移至集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC 7942。由于這些質(zhì)粒不在藍(lán)細(xì)菌中復(fù)制，它們應(yīng)能起到自殺載體的作用，橫穿進(jìn)入染色體，從而刪除染色體拷貝之一上的upp。優(yōu)化方案能加速分離而不會(huì)因過早接觸太多的 5-氟尿嘧啶而殺傷細(xì)胞。實(shí)施例14 蔗糖降解酶的修飾進(jìn)一步工程改造用asf轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌以便通過調(diào)控蔗糖降解活性來提高蔗糖產(chǎn)量。本發(fā)明人鑒定了集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803 (核苷酸序列SEQ ID NO 70 ；多肽序列SEQ ID NO 71)和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942(核苷酸序列SEQ IDNO -J2 ；多肽序列SEQ ID NO 73)中編碼轉(zhuǎn)化酶同源物的基因。集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803還編碼蔗糖酶鐵氧還蛋白-樣蛋白 (核苷酸序列 SEQ ID NO 74 ；多肽序列 SEQ ID NO 75) (Machray G. C.等.1994. FEBS Lett 354，123-127)。采用圖11所述的無標(biāo)記刪除方案刪除這些基因。實(shí)施例15 蔗糖降解酶的修飾進(jìn)一步工程改造用asf轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌以促進(jìn)細(xì)胞分泌蔗糖。當(dāng)處于低滲環(huán)境中時(shí)，蔗糖可以從細(xì)胞中自動(dòng)除去，如一些生物從高鹽轉(zhuǎn)入低 鹽環(huán)境時(shí)滲透保護(hù)劑所做的那樣(Schleyer, M.，Schmidt, R.和Bakker，E. P. 1993. Arch Microbiol 160，424-43 ；Koo, S.P.，Higgins, C. F.和 Booth，I. R. 1991. J Gen Microbiol 137,2617-2625 ；Lamark, Τ. ，Styrvold, 0. B.禾口 Strgim，A. R. 1992.FEMS Microbiol. Lett 96,149-154).工程改造藍(lán)細(xì)菌可促進(jìn)該過程。進(jìn)一步工程改造用asf轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌以表達(dá)蔗糖通透酶，例如大腸桿菌和沙門 氏菌所用或?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)運(yùn)至某些藍(lán)細(xì)菌的固氮孢囊中所用的那些(Jahreis K.等.2002. J Bacteriol 184,5307-5316 ；Cumino, A. C. 2007. Plant Physiol 143，1385-97)。按照上述技 術(shù)將這些基因克隆并轉(zhuǎn)化入藍(lán)細(xì)菌。實(shí)施例16 通道蛋白轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌的蔗糖分泌可用蔗糖通道蛋白轉(zhuǎn)化來促進(jìn)集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942 的蔗糖分泌?？寺≮嫫槟c桿菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894的編碼蔗糖通道蛋白 的基因(scrY)以便在集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942中表達(dá)。該基因 的功能是從其序列及其鄰近序列推導(dǎo)得到。利用寡核苷酸hsCrTOamHI-F(SEQ ID NO :88) 和EsscrYSacI-R (SEQ ID NO 89)，通過PCR從染色體DNA擴(kuò)增阪崎腸桿菌scrY。用BamHI 和SacI消化PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO 90)，連接入類似消化的pLybAL19并克隆入NEB5 α，從 而產(chǎn)生 pLybAL32(SEQ ID NO :91)。然后用寡核苷酸 EsscrYmidseq-F (SEQ ID NO :92)禾口 EsscrYmidseq-R(SEQ ID NO 93)測(cè)序 scrY 基因(核酸 SEQ ID NO :94 ；多肽序列，SEQ ID N0:95)。引入宿主中時(shí)，該構(gòu)建物在溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下能共同表達(dá)基因scrY和 asf。通過三-親代接合(如上所述)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803中。檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化 的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803蔗糖分泌的效率。隨后對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942作類似轉(zhuǎn)化和 檢驗(yàn)。實(shí)施例17 海藻糖累積性藍(lán)細(xì)菌生成大腸桿菌的編碼海藻糖磷酸合酶和海藻糖磷酸磷酸酶的海藻糖生物合成基因 (分別是otsA和otsB)發(fā)現(xiàn)在雙基因操縱子otsBA (SEQ ID N0:115)中。利用寡核苷酸EcotsBA-F (SEQ ID NO :116)和 EcotsBA-R (SEQ ID NO :117)，通過 PCR 擴(kuò)增大腸桿菌 K12 基 因組DNA來克隆該操縱子。用Af III和NheI消化PCR產(chǎn)物，將其克隆入pLybAL19 (SEQ ID N0:48)中，從而替代大多數(shù)asf基因。新質(zhì)粒pLybAL23(SEQ ID NO :118)將海藻糖生物合成 基因置于溫度誘導(dǎo)型入^啟動(dòng)子的控制下。用寡核苷酸ECOtsBAmidseq-F(SEQ ID NO 119) 和ECOtsBAmidseq-R(SEQ ID NO :120)測(cè)序這些基因以驗(yàn)證它們的完整性。然后通過將攜 帶otsBA操縱子的pLybAL23的Af III (用T4DNA聚合酶填平)/NheI片段連接入用McI (用 T4DNA 聚合酶填平)和 NheI 消化的 pLybAL15、pLybAL17、pLybAL21 和 pLybAL22 中，分別產(chǎn) 生 pLybAL28 (SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO 122)、pLybAL30 (SEQ ID NO :123)和 pLybAL31(SEQ ID NO : 1 )，從而將 otsBA 操縱子的表達(dá)置于 pyrR、psbAII、dnaK 和 kiaA 啟 動(dòng)子的控制下(如上所述)。通過三-親代接合將質(zhì)粒pLybAI^8(SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO :122)、 pLybAL30 (SEQ ID NO :123)和 pLybAL31 (SEQ ID NO :124)各自移入集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC 6803 中(如上所述)。采用與其它啟動(dòng)子所述相同的方法，PLybAL23的otsBA操縱子的表達(dá)置于 pLybAL16和pLybAL18中集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942nirA啟動(dòng)子 (如上所述)的控制下，從而分別產(chǎn)生pLybAL36(SEQID NO :125)和pLybAL37 (SEQ ID NO: 126)。實(shí)施例18 海藻糖測(cè)定有必要通過離心分開生物量和培養(yǎng)液，經(jīng)0. 2微米濾器過濾從澄清培養(yǎng)液中除去 殘留的生物量。減壓蒸發(fā)將培養(yǎng)液濃縮成殘留物。將該濃縮的培養(yǎng)液溶解于Iml去離子 水中，然后在海藻糖測(cè)定中取樣10微升溶液。將離心收集的生物量轉(zhuǎn)移至稱重碟，加熱至 100°C以除去殘留的水分。稱重干生物量，然后將IOOmg樣品溶解于Iml去離子水中。然后 研磨該混合物，離心除去固體。用去離子水將澄清上清液的10微升樣品稀釋100倍，檢驗(yàn) 10微升稀釋樣品的海藻糖。海藻糖測(cè)定利用可從生物生物視點(diǎn)公司獲得的商品化提供的蔗糖測(cè)定試劑盒的 改進(jìn)方法。標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)之處是用海藻糖酶取代試劑盒提供的轉(zhuǎn)化酶溶液。該試劑盒包 括用海藻糖酶水解海藻糖以釋放葡萄糖。該葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶氧化以產(chǎn)生過氧化氫， 過氧化氫在有著色指示劑存在下通過過氧化物酶作用檢測(cè)。通過其在570nm處的特征性吸 光度定量檢測(cè)著色指示劑，從而得到樣品中最初存在的葡萄糖濃度。通過 Gutierrez C, Ardourel Μ, Bremer Ε, Middendo rf A, Boos W, Ehmann U. Mol Gen Genet. 1989年6月；217 (2-3) =347-54所述的相似方法，從工程改造入質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入 大腸桿菌宿主的重組大腸桿菌treA基因制備海藻糖酶(treA核酸SEQ ID NO :134編碼海 藻糖酶多肽SEQ ID NO :135)。從大腸桿菌K12克隆treA編碼的周質(zhì)海藻糖酶。用AflII/ ^CbaI消化treA PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO 127)，然后連接入類似消化的pLybCB6 (含有組成型 強(qiáng)大腸桿菌trp啟動(dòng)子的專有質(zhì)粒)中，從而產(chǎn)生pLybALM(SEQ ID NO :130)。通過寡核 苷酸EctreAmidseq-F和EctreAmidseq-R測(cè)序分析插入物的完整性。構(gòu)建C-末端His6_標(biāo)記的海藻糖酶。利用寡核苷酸EctreA_F2(SEQ IDNO 131) 和EctreA-R2 (SEQ ID NO 132)，通過PCR擴(kuò)增該基因。然后用Af ΙΙΙ/XbaI消化該P(yáng)CR產(chǎn) 物(SEQ ID NO :136)，隨后連接入類似消化的pLybALM中，從而產(chǎn)生pLybAL33(SEQ ID NO:133)。周質(zhì)海藻糖酶的組成型表達(dá)強(qiáng)對(duì)細(xì)胞有害，在37°C下導(dǎo)致強(qiáng)烈的生長(zhǎng)缺陷。這可 通過在30°C下培養(yǎng)細(xì)胞顯著減輕。該蛋白在攜帶質(zhì)粒pLYBAL24(SEQ ID NO :130)的大腸桿菌BW25113中表達(dá)，所述 大腸桿菌在含有卡那霉素的^cYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該蛋白利用Trp啟動(dòng)子組成型產(chǎn)生并含 有使該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)的信號(hào)肽。發(fā)酵和生物量收獲后，用在50mM Tris緩沖液pH 8中的 2% ν/ν 二氯甲烷處理經(jīng)洗滌和重懸的細(xì)胞團(tuán)，通過選擇性周質(zhì)釋放純化該酶。離心分離裂 解液與細(xì)胞碎片，利用裝有10，000道爾頓膜的Amicon超濾器濃縮作進(jìn)一步加工。濃縮的 裂解液可直接用于測(cè)定，或者可利用該酶C-末端上的工程改造6Χ多聚組氨酸標(biāo)簽(SEQ ID NO :137)，通過金屬離子親和層析進(jìn)一步純化該酶。實(shí)施例19 固相海藻糖產(chǎn)生固體復(fù)合織物覆蓋的由基底泡沫(substrate foam)構(gòu)成的親水性泡沫用作培養(yǎng) 基/水分儲(chǔ)器(FA公司O^amex Aquazone))，將該泡沫粘合于用作15cmX15cm見方生長(zhǎng)表 面的織物層(DuPont Sontara)。將該復(fù)合材料浸在70%乙醇水溶液中滅菌，然后懸掛在垂 直生物反應(yīng)器中，該生物反應(yīng)器垂直懸掛以將溶液遞送至復(fù)合材料的頂部。該溶液因重力 滲濾過生長(zhǎng)復(fù)合表面。將1升滅菌的去離子水以0. 2毫升/分鐘流過來除去滅菌的生長(zhǎng)表 面中的殘留乙醇。將0. 5升含10微克/毫升氯霉素的BGllA生長(zhǎng)培養(yǎng)基以0. 2毫升/分 鐘流過該復(fù)合材料以用培養(yǎng)基平衡該生長(zhǎng)表面。通過用質(zhì)粒pLYBAL23轉(zhuǎn)化的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的IOml 4天預(yù)培養(yǎng)物注滿平 衡的滅菌生長(zhǎng)表面以接種該表面。溫育30分鐘后，將反應(yīng)器轉(zhuǎn)成垂直位置，開始發(fā)酵。用 白色LED陣列的80微愛因斯坦光照射該反應(yīng)器。利用與生物反應(yīng)器相連的電阻加熱裝置 (resistive heating device)將溫度維持在。用0. 2微米過濾的空氣以0. 2升/分 鐘連續(xù)吹掃反應(yīng)器，每6小時(shí)供應(yīng)新鮮的培養(yǎng)基，用泵和經(jīng)生長(zhǎng)復(fù)合物的泡沫層重力滲濾， 速度為0. 2毫升/分鐘，持續(xù)30分鐘。反應(yīng)器持續(xù)操作4-7天，在此期間，復(fù)合物的生長(zhǎng)表 面鋪滿了稠密的藍(lán)細(xì)菌菌苔。最初的培養(yǎng)期后，將生物反應(yīng)器的溫度提高至40°C，在該溫度 再維持M小時(shí)。在升溫期間，收集用過的培養(yǎng)基，經(jīng)處理以作海藻糖測(cè)定。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，用 去離子水洗滌生長(zhǎng)表面來收集生物量，可對(duì)其加工以便用于海藻糖測(cè)定。產(chǎn)生的和保留在固體表面生長(zhǎng)的生物量?jī)?nèi)的海藻糖量占溫度誘導(dǎo)后從生物反應(yīng) 器中回收的生物量總干重的多達(dá)2. 5重量％。溫度誘導(dǎo)后，從培養(yǎng)基回收0. 8重量％的干 生物量當(dāng)量海藻糖。實(shí)施例20 海藻糖產(chǎn)生液相在Bioflow反應(yīng)器中制備1升無菌的BGllA培養(yǎng)基，向其中加入氯霉素至10微克 /毫升的濃度。然后用5體積％的質(zhì)粒PLYBAL23轉(zhuǎn)化的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的4天預(yù)培 養(yǎng)物接種該反應(yīng)器。該反應(yīng)器的運(yùn)行條件如下d8°C，300RPM，0. 2升/分鐘的0. 2微米過 濾空氣吹掃，利用熒光燈陣列的80微愛因斯坦光照射。培養(yǎng)維持4-7天，然后取200ml樣 品用于加工和海藻糖測(cè)定。然后將發(fā)酵溫度升高至40°C，持續(xù)M小時(shí)。隨后從生物反應(yīng)器 中取出200ml樣品用于加工和海藻糖測(cè)定。溫度誘導(dǎo)后，干燥的生物量產(chǎn)生多達(dá)3重量％海藻糖，而相對(duì)于生物量，用過的培 養(yǎng)基含有0. 3重量％當(dāng)量的海藻糖。
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權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)光合微生物的光生物反應(yīng)器，該光生物反應(yīng)器包括非膠狀的固體培養(yǎng)支持物，該支持物適于為在其表面的至少一部分上的光合微生物提 供營(yíng)養(yǎng)物和水分，其中當(dāng)該表面的所述部分非水平定位時(shí)，該表面的所述部分的形狀允許 光合微生物與其粘附；以及覆蓋該培養(yǎng)支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中該物理屏障設(shè)置成允許接種 該培養(yǎng)支持物表面的所述部分，形成并維持適于培養(yǎng)這種光合微生物和收獲這種培養(yǎng)的光 合微生物的環(huán)境。
2.如權(quán)利要求1所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，在培養(yǎng)支持物表面的所述部分上 還包括光合微生物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，培養(yǎng)支持物表面的所述部分能 以每升當(dāng)量至少約50克干生物量的密度培養(yǎng)光合微生物。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物是柔 性的。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物包含 一種或多種剛性材料。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物包含 至少兩層，第一層毗連第二層，其中所述至少兩層的材料是相同或不同的材料。
7.如權(quán)利要求6所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述第一層包含高表面積生長(zhǎng)材 料，所述第二層包含可滲透型材料。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物包含 柔性連接的剛性部分，其中所述剛性部分由一種或多種剛性材料構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述物理屏障對(duì)于固 體顆粒和液體至少是基本上不可滲透的，但不阻止氣體或蒸氣向和從培養(yǎng)支持物表面的所 述部分附近的空間運(yùn)輸，也不阻止培養(yǎng)支持物表面的所述部分的光化射線。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器還 包括位于培養(yǎng)支持物和物理屏障之間的光化射線源。
11.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述物理屏障在培養(yǎng) 支持物和光化射線源之間，其對(duì)于這種光化射線足夠透明并具有足夠的氣體透過性從而光 合微生物在培養(yǎng)期間能進(jìn)行光合作用。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述物理屏障對(duì)水 蒸氣充分不滲透，從而潤(rùn)濕后所述培養(yǎng)支持物將保留足夠的水分，因此光合微生物在培養(yǎng) 期間能維持充分的水合。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述屏障設(shè)置成包 含所述培養(yǎng)支持物和其上的任何光合微生物，以及設(shè)置成在光合微生物的至少部分培養(yǎng)期 間可松脫地密封。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 包含單個(gè)培養(yǎng)支持物。
15.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 包含多個(gè)培養(yǎng)支持物。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述物理屏障是柔 性的。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述物理屏障還包 含對(duì)于固體顆粒、液體、氣體和蒸氣至少基本上不可滲透的第一部分，和對(duì)于氣體和蒸氣可 滲透，但對(duì)于固體顆粒和液體至少基本上不可滲透的第二部分。
18.如權(quán)利要求17所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述屏障的第二部分的氣體或 蒸氣交換率是至少約5葛爾萊秒到不超過約10，000葛爾萊秒。
19.如權(quán)利要求17所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述屏障的第二部分包含選擇 性膜，該選擇性膜含有烯烴纖維或聚乙烯纖維材料、聚四氟乙烯過濾介質(zhì)、纖維素過濾材 料、纖維玻璃過濾材料、聚酯過濾材料、聚丙烯酸酯過濾材料、聚砜膜或尼龍膜。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述第一部分對(duì)于 光化射線至少是基本上透明的，且所述第二部分對(duì)于光化射線至少基本上不透明，所述第 一和第二部分相對(duì)于彼此和培養(yǎng)支持物表面的至少所述部分的設(shè)置具有充足量的光化射 線和氣體交換從而支持光合微生物的光合作用。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物包 含織物。
22.如權(quán)利要求21所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述織物由天然的、改性天然 的、合成的纖維或它們的組合構(gòu)成。
23.如權(quán)利要求21所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述織物是紡織織物、編織織 物、氈、交聯(lián)纖維聚合物構(gòu)成的篩網(wǎng)或它們的組合。
24.如權(quán)利要求22所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于天然纖維選自棉花、羊毛、大麻纖維、樹纖維、其它纖維素纖維和它們的組合；改性天然纖維選自硝酸纖維素、醋酸纖維素、磺酸纖維素、交聯(lián)的淀粉和它們的組合；合成纖維選自聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚酰胺、聚砜和它們的組合。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述培養(yǎng)支持物包 被有水分吸附聚合物。
26.如權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述織物、織物的 纖維或二者包被有水分吸附聚合物。
27.如權(quán)利要求25-26中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述水分吸附聚合 物選自瓊脂、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚胺、聚乙二醇、改性淀粉和它們的組合。
28.如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 還在培養(yǎng)支持物上、其內(nèi)或同時(shí)在其上和其內(nèi)包含水、營(yíng)養(yǎng)物或它們的組合。
29.如權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 還包括一個(gè)或多個(gè)連接點(diǎn)以連接所述光生物反應(yīng)器與一構(gòu)件。
30.如權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述固體培養(yǎng)支持 物還包括一個(gè)或多個(gè)連接點(diǎn)以連接該培養(yǎng)支持物。
31.如權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 還包括液體供應(yīng)系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)系統(tǒng)、氣體供應(yīng)系統(tǒng)和微生物供應(yīng)系統(tǒng)中的至少一種。
32.如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，其特征在于，所述光生物反應(yīng)器 還包含權(quán)利要求42-55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞粘附于所述固體培養(yǎng)支持物。
33.一種培養(yǎng)光合微生物的裝置，包括至少一個(gè)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器；和與所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器相連的構(gòu)件，該構(gòu)件將所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器的至 少一個(gè)培養(yǎng)支持物非水平地定位。
34.如權(quán)利要求33所述的裝置，其特征在于，所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器懸掛在該構(gòu) 件上。
35.如權(quán)利要求33-34中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述構(gòu)件基本上被所述物理屏障覆蓋。
36.如權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述構(gòu)件包括傳送系統(tǒng)或其 組件，從而所述至少一個(gè)培養(yǎng)支持物能沿著該傳送系統(tǒng)的路徑傳送。
37.如權(quán)利要求36所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括接種站，其在各培養(yǎng)支持物沿著傳送系統(tǒng)的路徑傳送時(shí)可用光合微生物接種；培養(yǎng)站，其在各培養(yǎng)支持物沿著傳送系統(tǒng)的路徑傳送時(shí)培養(yǎng)各接種的培養(yǎng)支持物上的 光合微生物；和收獲站，將培養(yǎng)支持物傳送到此處，從而可自各培養(yǎng)支持物收獲培養(yǎng)的光合微生物的 至少一部分。
38.如權(quán)利要求37所述的裝置，其特征在于，所述接種站和收獲站基本上彼此毗連或 者基本上是共存的。
39.如權(quán)利要求33-38中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括誘導(dǎo)站以誘 導(dǎo)各培養(yǎng)支持物上的光合微生物合成可發(fā)酵糖。
40.如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括液體供應(yīng)系 統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)系統(tǒng)、氣體供應(yīng)系統(tǒng)或微生物供應(yīng)系統(tǒng)中的至少一種。
41.如權(quán)利要求33-40中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包含權(quán)利要求 42-55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞粘附于所述固體培養(yǎng)支持物。
42.一種包含人工DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞，所述構(gòu)建物包含以5’到3’的 轉(zhuǎn)錄方向操作性相連的以下組分在所述光合微生物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子；包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽選自二糖 磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶；和轉(zhuǎn)錄終止序列；其中與不含DNA構(gòu)建物的光合微生物細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)基因光合微生物細(xì)胞累積的二 糖水平升高。
43.如權(quán)利要求42所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包含(i)含有第一核苷酸序列和 第二核苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而 所述第二核苷酸序列編碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽，或(ii)含有核苷酸序列的多 核苷酸，所述核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。
44.如權(quán)利要求42-43中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸選自如下(a)包含編碼選自如下的多肽的核苷酸序列的多核苷酸具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :2或與其有95%相同 的序列；具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO :4或與其有95%相同的序列； 具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 6與其有95%相同的序列； 具有海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO 77或與其有95%相同的序列； 具有海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 79或與其有95%相同的序列； 具有葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO 81或與其有95%相同的序列； 具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 83或與其有95%相同的序列； 具有甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO :85或與其有95%相同的序列；和具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO :87或與其有95%相同的序列；(b)分離的多核苷酸，其包含編碼蔗糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :1或與其有95%相同 的序列；編碼蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO 3或與其有95%相同的序列； 編碼蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 5或與其有95%相同的序列； 編碼海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO 76或與其有95%相同的序列； 編碼海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 78或與其有95%相同的序列； 編碼葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO 80或與其有95%相同的序列； 編碼葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 82或與其有95%相同的序列； 編碼甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO :84或與其有95%相同的序列；和編碼甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO :86或與其有95%相同的序列；(c)在嚴(yán)格條件下與選自如下的核酸序列雜交的分離多核苷酸SEQIDNO:1，其中該分離多核苷酸編碼具有ASF活性的多肽;SEQIDNO:3，其中該分離多核苷醒編碼具有SPS活性的多肽;SEQIDNO:5，其中該分離多核苷酸編碼具有SPP活性的多肽；SEQIDNO:76，其中該分離多核苷5脧編碼具有TPS活性的多肽SEQIDNO:78，其中該分離多核苷5脧編碼具有TPP活性的多肽SEQIDNO:80，其中該分離多核苷5脧編碼具有GPS活性的多肽SEQIDNO:82，其中該分離多核苷5脧編碼具有GPP活性的多肽SEQIDNO:84，其中該分離多核苷5脧編碼具有MPS活性的多肽SEQIDNO:86，其中該分離多核苷5脧編碼具有MPP活性的多肽其中所述嚴(yán)格條件包括65°C下，在包含6X SSC(0.9M氯化鈉和0.09M檸檬酸鈉)的溶 液中溫育；和(d)與(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互補(bǔ)的分離的多核苷酸。
45.如權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述累積二糖的單體對(duì)于細(xì) 胞是內(nèi)源性的。
46.如權(quán)利要求42-45中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞、光 合細(xì)菌或綠藻。
47.如權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求42-47中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是選自聚球藍(lán)細(xì)菌 或集胞藍(lán)細(xì)菌的藍(lán)細(xì)菌。
49.如權(quán)利要求42-48中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
50.如權(quán)利要求42-49中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子選自carB、 nirA、psbAII、dnaK、kaiA 禾口 λ PR。
51.如權(quán)利要求42-50中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述DNA構(gòu)建物包含選自 如下的核苷酸序列SEQ ID NO :19(編碼asf的pLybALll) ；SEQ ID NO :20 (編碼asf的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44(編碼 asf 的 pLybAL 15) ；SEQ ID NO :45(編碼 asf 的 pLybAL 16) ；SEQ ID NO 46 (編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO 47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO 48(編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID NO 49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQID NO 50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO 51 (編碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO 52 (編 碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO 53(編碼 asf 的 pLybAL 14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL 14r) ；SEQ ID NO :65(編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69(編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ IDNO :118 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO :121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO 123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125(編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO 126 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO 130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24)；禾口 SEQ ID NO 133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33)。
52.如權(quán)利要求42-51中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞累積至少約0.1微 克二糖/分鐘/克干生物量。
53.如權(quán)利要求42-52中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞累積至少約0.1微 克二糖/分鐘/克干生物量至多達(dá)約10微克二糖/分鐘/克干生物量。
54.如權(quán)利要求42-53中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，至少滿足以下一條所述細(xì)胞不包含選自如下的核苷酸序列SEQ ID NO 70, SEQ ID N0:72和SEQ ID NO: 74，或與它們有至少95%相同，且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的核苷酸變 體；所述細(xì)胞不表達(dá)選自如下的多肽序列:SEQ ID N0:71、SEQ ID N0:73和SEQ ID NO :75， 或與它們有至少95%相同，且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的多肽變體；或所述細(xì)胞表達(dá)對(duì)選自如下的核苷酸序列有特異性的小干擾RNA =SEQ IDNO :70、SEQ ID NO 72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，且具有轉(zhuǎn)化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋 白活性的核苷酸變體。
55.如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞還包含編碼活性通道蛋白多肽的分離的多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID N0:94或與其有 95%相同的序列；編碼多肽的分離多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO :95或與其有95%相同的序列并具 有通道蛋白活性；或包含SEQ ID NO 91的分離多核苷酸(編碼通道蛋白的pLybAL32)；其中累積的二糖是蔗糖，所述細(xì)胞表達(dá)通道蛋白，且表達(dá)的通道蛋白將累積的蔗糖從 細(xì)胞中分泌。
56.一種人工DNA構(gòu)建物，其包含至少一條選自如下的序列SEQ ID N0:19(編碼 asf 的 pLybALll) ；SEQ ID NO 20(編碼 asf 的 pLybAL12) ；SEQID NO 44(編碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO :45 (編碼 asf 的 pLybAL16) ；SEQ ID NO :46 (編碼 asf 的 pLybAL17)； SEQ ID NO :47(編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO :48 (編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID N0:49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO :50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID N0:51(編 碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO 52(編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQID NO :53(編碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO 65(編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69(編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ ID NO :118(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQID NO 121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO :123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID N0:124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO 125 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :126 (編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO 130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24) ；SEQ ID NO 133(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33) ； SEQ ID NO :91 (編碼通道蛋白的 pLybAL32) ； SEQ ID NO: 102 (編碼 SS-UPP 的 pLybAL3f) ； SEQ ID NO 103 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL5f) ； SEQ ID NO: 106 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL4f) ； SEQ ID NO 107 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL9f) ； SEQ ID NO 109 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL6fb) ；SEQ ID NO :110 (編碼 SE-UPP 的 pLybALlOfb)；和 SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的pLybAL32)。
57.一種培養(yǎng)光合微生物的方法，所述方法利用權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的光生物 反應(yīng)器或裝置，所述方法包括用光合微生物接種培養(yǎng)支持物；在接種的培養(yǎng)支持物上培養(yǎng)該光合微生物；和從該培養(yǎng)支持物上收獲至少一部分培養(yǎng)的光合微生物。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述方法還包括接種該培養(yǎng)支持物后密 封該光生物反應(yīng)器的物理屏障，從而在培養(yǎng)光合微生物的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分的同時(shí)密封該物理屏障。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述物理屏障可松脫地密封。
60.如權(quán)利要求57-59中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將各培養(yǎng)支 持物輸送至接種站、培養(yǎng)站和收獲站。
61.如權(quán)利要求57-60中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下的至少 一種為培養(yǎng)支持物供水；為培養(yǎng)支持物供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物；或?yàn)榕囵B(yǎng)支持物供氣。
62.如權(quán)利要求57-61中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物培養(yǎng)至每升 當(dāng)量至少約50克干生物量的密度。
63.如權(quán)利要求57-62中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包含權(quán)利要 求42-55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
64.一種產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法，所述方法利用權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的光生物反 應(yīng)器或裝置，所述方法包括用能累積可發(fā)酵糖的光合微生物接種培養(yǎng)支持物；在接種的培養(yǎng)支持物上培養(yǎng)該光合微生物；分離累積的可發(fā)酵糖。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述可發(fā)酵糖在所述光合微生物內(nèi)累積。
66.如權(quán)利要求64-65中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分離累積的可發(fā)酵糖包括從培養(yǎng)支持物上收獲至少一部分培養(yǎng)的光合微生物；和從收獲物回收可發(fā)酵糖。
67.如權(quán)利要求64-66中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，累積的可發(fā)酵糖從所述光合 微生物分泌，并從培養(yǎng)基中分離。
68.如權(quán)利要求64-67中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，分離累積的可發(fā)酵糖包括從 培養(yǎng)基分離累積的可發(fā)酵糖。
69.如權(quán)利要求64-68中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在接種培養(yǎng) 支持物后可松脫地密封該光生物反應(yīng)器的物理屏障，從而在培養(yǎng)光合微生物的全部或?qū)嵸|(zhì) 性部分的同時(shí)密封該物理屏障。
70.如權(quán)利要求64-69中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下的至少 一種為培養(yǎng)支持物供應(yīng)液體；為培養(yǎng)支持物供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物；或?yàn)榕囵B(yǎng)支持物供氣。
71.如權(quán)利要求64-70中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將培養(yǎng)支持 物傳送至接種站、培養(yǎng)站和收獲站中的至少一個(gè)。
72.如權(quán)利要求64-71中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括誘導(dǎo)光合微 生物合成可發(fā)酵糖。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)可發(fā)酵糖合成包括使光合微生物接 觸選自以下的誘導(dǎo)因素溫度、PH、代謝物、光、滲透劑、重金屬和抗生素。
74.如權(quán)利要求72-73中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)可發(fā)酵糖合成包括用鹽 化合物處理所述光合微生物。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述鹽化合物是氯化鈉。
76.如權(quán)利要求74-75中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述鹽化合物的添加濃度是 約 0. OlmM-L 5M 或約 0. 2-0. 9M。
77.如權(quán)利要求73-76中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過氣溶膠噴霧將誘導(dǎo)劑施 加于生長(zhǎng)表面。
78.如權(quán)利要求64-77中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將所述光合微生物培養(yǎng)至每 升當(dāng)量至少約50克干生物量的密度。
79.如權(quán)利要求64-78中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述可發(fā)酵糖包括選自如下 的至少一種糖葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。
80.如權(quán)利要求64-79中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述可發(fā)酵糖包括選自蔗糖或海藻糖的至少一種糖。
81.如權(quán)利要求64-81中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括天然光 合微生物。
82.如權(quán)利要求64-81中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括遺傳修 飾的光合微生物。
83.如權(quán)利要求64-82中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括藍(lán)細(xì)菌。
84.如權(quán)利要求64-83中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括選自聚 球藍(lán)細(xì)菌或集胞藍(lán)細(xì)菌的藍(lán)細(xì)菌。
85.如權(quán)利要求64-84中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包含權(quán)利要 求42-52中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
全文摘要
本文提供工程改造以累積碳水化合物，例如二糖的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌。還提供培養(yǎng)光合微生物的光生物反應(yīng)器，其包括適合于為光合微生物提供營(yíng)養(yǎng)物和水分的非凝膠的固體培養(yǎng)支持物和覆蓋所述培養(yǎng)支持物表面的至少一部分的物理屏障。還公開了整合有光生物反應(yīng)器的大規(guī)模和連續(xù)培養(yǎng)光合微生物的裝置以及使用方法。還公開了利用本發(fā)明的光生物反應(yīng)器從光合微生物產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法。
文檔編號(hào)C12N1/13GK102149809SQ200980107937
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日
發(fā)明者J·艾肯斯, R·J·特納 申請(qǐng)人:普羅特羅公司