用于檢測(cè)人il28b基因多態(tài)性的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及用于人IL28B基因rsl2979860 和rs8099917兩個(gè)位點(diǎn)核巧酸多態(tài)性的檢測(cè)引物、試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒化巧atitisCvirus,HCV)引起的一種傳染 病，主要通過(guò)靜脈毒品注射、輸血、器官移植和血液透析等途徑傳播。目前全球丙型肝炎患 者約有1. 3至1. 7億人，每年因HCV感染而死亡者高達(dá)35萬(wàn)人。相對(duì)己型肝炎，丙型肝炎 更容易慢性化，它已經(jīng)成為導(dǎo)致肝硬化和肝癌的主要原因之一，嚴(yán)重危害著人類健康，所W 對(duì)丙型肝炎進(jìn)行積極預(yù)防W及有效的治療是十分必要的。
[0003] HCV感染的具體機(jī)制尚不清楚，除與病毒本身有關(guān)，更重要的是與不同個(gè)體的遺傳 易感性有關(guān)。白細(xì)胞介素-28B(interle址in-28B，比-28B)又稱為IFN-3,屬于IFN-S干擾 素家族，亦即III型干擾素（interferon,IFN)家族，該家族另外2個(gè)成員是IL-29、IL-28A， 分別又稱為IFN-1、IFN-2。編碼人IFN-S的基因均位于19號(hào)染色體（19ql3. 13)。白細(xì)胞 介素28B(IL28B)基因多態(tài)性不僅與HCV感染者對(duì)治療的應(yīng)答有關(guān)，還與急性HCV感染者的 自發(fā)清除有關(guān)，其中，rsl2979860和rs8099917兩位點(diǎn)與丙肝疾病進(jìn)展及治療效果關(guān)聯(lián)性 最強(qiáng)。2011年3月歐洲肝病學(xué)會(huì)HCV感染防治指南已將IL28基因多態(tài)性與HCV基因型、肝 纖維化分期等一起作為基線預(yù)測(cè)SVR的最主要因素之一。
[0004] CN102816838A公開(kāi)了用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多態(tài)性 的試劑盒，其中檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括dNTP，用于PCR反應(yīng)的Tag酶及其緩沖 反應(yīng)液，檢測(cè)IL28化S12980275多態(tài)性用上下游引物，其中，IL28B上游引物序列； GTAGGGGGAATCATACAGCATT;IL28B下游引物序列；GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。通過(guò)使用針對(duì) IL28BSNP位點(diǎn)rsl2980275的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，具有很高的特異性及準(zhǔn)確性；采用PCR 方法擴(kuò)增目的基因并測(cè)序檢測(cè)其基因多態(tài)性，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。CN 102277441A公開(kāi)了一種快速檢測(cè)IL28B基于SNPrsl2979860多態(tài)性的試劑盒。該試劑盒 通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，與樣品中模板DNA進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)的結(jié)果判斷樣品 IL28BSNPrsl2979860的多態(tài)性形式（CC、CT、TT)，從而為丙型肝炎患者的臨床抗病毒治療 提供療效預(yù)測(cè)的結(jié)果。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)過(guò)程短、經(jīng)濟(jì)有效。上述公開(kāi)的檢測(cè)方法均 采用基因測(cè)序等常規(guī)方法，操作繁雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，結(jié)果容易出現(xiàn)偏差，不利于病患的及時(shí)治 療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物、單堿 基延伸引物、包含它們的試劑盒W及使用它們的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)人IL28B基因 多態(tài)性的方法能快速、特異、高效地檢測(cè)IL28B基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rsl2979860 (C/T)和 rs8099917(G/T)的多態(tài)性，從而能對(duì)丙肝標(biāo)準(zhǔn)方案療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)不同型別的患者采取 區(qū)別對(duì)待及治療，提高整個(gè)丙肝的診療水平。
[0006] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物，所述 PCR擴(kuò)增引物根據(jù)IL28B基因rsl2979860位點(diǎn)（T/C)多態(tài)性設(shè)計(jì)，其序列如下所示；
[0008] rsl2979860PCR上游引物；
[0009] 5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'(沈QIDN0:1);
[0010] rsl2979860PCR下游引物；
[0011] 5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'(SEQIDN0:2)〇
[0012] 第二方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的單堿基延伸引物，所述 單堿基延伸引物根據(jù)第一方面所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，其序列如下 所示：
[0013] rsl2979860單堿基延伸引物；
[0014] 5'-GGAGCTCCCCGAAGGCG-3'(沈QIDN0:3)。
[00巧]第S方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物根據(jù)IL28B基因rs8099917位點(diǎn)（T/G)多態(tài)性設(shè)計(jì)，其序列如下所示：
[001 引rs8099917PCR上游引物；
[0017] 5'-ACGTTGGATGCAATTTGTCACTGTTCCTCC-3'(沈QIDN0:4);
[001 引rs8099917PCR下游引物；
[0019] 5'-ACGTTGGATGACTGTATACAGCATGGTTCC-3'(沈QIDN0:5)。
[0020] 第四方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的單堿基延伸引物， 所述單堿基延伸引物根據(jù)第S方面所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，其序列 如下所示；
[0021] rs8099917單堿基延伸引物；
[0022] 5'-TTTTCCTTTCTGTGAGCAAT-3'(SEQIDN0:6)〇
[0023] 第五方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的試劑盒，該試劑 盒包括第一方面和/或第S方面所述的PCR擴(kuò)增引物。
[0024] 優(yōu)選地，還包括第二方面和/或第四方面所述的單堿基延伸引物。
[00巧]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括用于PCR擴(kuò)增的試劑，例如2XPCRmix、化tstarTaq酶 和純水。
[002引優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SAP反應(yīng)試劑，例如SAP緩沖液、SAP酶和純水。
[0027] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括單堿基延伸反應(yīng)試劑，例如iPLEX緩沖液、ddNTP混合 液、iPLEX聚合酶和純水。
[0028] 第六方面，本發(fā)明還提供了如第五方面所述的試劑盒在檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性 中的應(yīng)用。
[0029] 第走方面，本發(fā)明提供了一種人IL28B基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，所述方法使用如 第五方面所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0030] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法包括使用如第一方面和/或第S方面所述的PCR擴(kuò)增引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0031] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法還包括使用如第二方面和/或第四方面所述的單堿 基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。
[0032] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)方法包括：
[0033] (1)W待檢測(cè)基因組DNA為模板，使用第一方面和/或第S方面所述PCR擴(kuò)增引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0034] 似使步驟（1)所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)液與SAP酶進(jìn)行SAP反應(yīng)；
[0035] (3)使用第二方面和/或第四方面所述的單堿基延伸引物，對(duì)步驟（2)所得反應(yīng)液 進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。
[0036] 上述檢測(cè)方法中，作為優(yōu)選，步驟（1)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件如下：
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物 根據(jù)IL28B基因rsl2979860位點(diǎn)（T/C)多態(tài)性設(shè)計(jì)，其序列如下所示： rsl2979860PCR上游引物： 5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3' ；rsl2979860PCR下游引物： 5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3' 。
2. -種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的單堿基延伸引物，其特征在于，所述單堿基延 伸引物根據(jù)權(quán)利要求1所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，其序列如下所示： rsl2979860單堿基延伸引物： 5,-GGAGCTCCCCGAAGGCG-3, 。
3. -種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物 根據(jù)IL28B基因rs8099917位點(diǎn)（T/G)多態(tài)性設(shè)計(jì)，其序列如下所示： rs8099917PCR上游引物： 5'-ACGTTGGATGCAATTTGTCACTGTTCCTCC-3' ；rs8099917PCR下游引物： 5'-ACGTTGGATGACTGTATACAGCATGGTTCC-3' 。
4. 一種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的單堿基延伸引物，其特征在于，所述單堿基延 伸引物根據(jù)權(quán)利要求3所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，其序列如下所示： rs8099917單堿基延伸引物： 5'-TTTTCCTTTCTGTGAGCAAT-3' 。
5. -種用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1和/或3 所述的PCR擴(kuò)增引物； 優(yōu)選地，還包括權(quán)利要求2和/或4所述的單堿基延伸引物。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒在檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
7. -種人IL28B基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求5所述的試劑盒 進(jìn)行檢測(cè)。
8. -種人IL28B基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1和/或3所述 的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 優(yōu)選地，還包括使用權(quán)利要求2和/或4所述的單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 以待檢測(cè)基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1和/或3所述PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)； (2) 使步驟（1)所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)液與SAP酶進(jìn)行SAP反應(yīng)； (3) 使用權(quán)利要求2和/或4所述的單堿基延伸引物，對(duì)步驟（2)所得反應(yīng)液進(jìn)行單堿 基延伸反應(yīng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑴中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條 件如下：
優(yōu)選地，步驟（2)中，所述SAP反應(yīng)的條件如下： 37°C40分鐘 85°C 5分鐘 4°C00 ； 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述單堿基延伸反應(yīng)的條件如下：
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測(cè)人IL28B基因多態(tài)性的PCR擴(kuò)增引物、單堿基延伸引物、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。該試劑盒包括針對(duì)rs12979860位點(diǎn)(T/C)多態(tài)性設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物、單堿基延伸引物，和/或針對(duì)rs8099917位點(diǎn)(T/G)多態(tài)性設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物、單堿基延伸引物。通過(guò)使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，SAP反應(yīng)和單堿基延伸反應(yīng)，繼而用質(zhì)譜分析上述兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性形式。本發(fā)明的人IL28B基因多態(tài)性檢測(cè)方法能快速、特異、高效地檢測(cè)IL28B基因的上述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，從而能對(duì)丙肝標(biāo)準(zhǔn)方案療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)不同型別的患者采取區(qū)別對(duì)待及治療，提高整個(gè)丙肝的診療水平。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104774933
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510144657
【發(fā)明人】許蘊(yùn), 劉文蘭, 黃建林, 李赟
【申請(qǐng)人】深圳市第二人民醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年3月30日