的表達(dá)水 平。
[0021] 圖4是野生型（WT)、化轉(zhuǎn)基因株系（0X-1~0X-3)和化/7Z/7W狼基因株系 (0sbZIP60-6、0sbZIP60-9、0sbZIP60-10)種子萌發(fā)率。A、B、C;野生型（WT)、化鮮過(guò)表達(dá) 轉(zhuǎn)基因株系種子在常溫儲(chǔ)存=個(gè)月、六個(gè)月、一年后的萌發(fā)率；D;常溫儲(chǔ)存一年后的野生 型（WT)、化W過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系腿-扣種子在Ig/L赤霉素浸種24h或50°C處理5min 后的萌發(fā)率；E;野生型（WT)、化戶仿巧表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（0SZIP60-6)、化過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基 因株系腿-1~0X-：3)種子在4°C儲(chǔ)存一年后的萌發(fā)率；F;野生型（WT)、化/娘基因 株系（0sbZIP60-6、0sbZIP60-9、0sbZIP60-10)種子在常溫儲(chǔ)存一年后的萌發(fā)率。
[002引 圖5是野生型（WT)、化W轉(zhuǎn)基因株系腿-1~0X-：3)幼苗在高溫條件下的表型分 析。A;野生型、轉(zhuǎn)基因株系在高溫處理（45°C，12h/28°C，12h)21天后的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)增長(zhǎng)率； B、C;野生型、轉(zhuǎn)基因株系在高溫處理3天后植株中丙二醒MDA(malondialdehyde，MDA)含 量，及過(guò)氧化氨酶（catalase,CAT)酶活。柱狀圖中不同字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（K0. 05)。
[0023]圖6是野生型（WT)、化轉(zhuǎn)基因株系（0X-1~0X-3)幼苗在干旱、鹽脅迫或低溫 條件下的生長(zhǎng)情況。A;15%PEG6000模擬干旱處理14天幼苗的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)增長(zhǎng)率；B;100 ml化Cl處理14天幼苗的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)增長(zhǎng)率；C;4°C低溫條件下生長(zhǎng)14天幼苗的莖葉、根的 干重。柱狀圖中不同字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（K0. 05)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī) 條件，例如SambrookRussell的分子克隆；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarbor L油oratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實(shí)施例1冰稻化?盛因的克隆 1、試劑 RNA提取試劑Trizol購(gòu)于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶ReverTraAce購(gòu)于Toyobo公司； 高保真DNA聚合酶PrimeStar購(gòu)于TaKaRa公司；克隆載體祀ASY?-BluntSimpleCloning Vector購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其余 試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
[0026] 2、大腸桿菌菌株和植物材料 大腸桿菌co7i)菌株D冊(cè)a購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；水稻梗 稻品種日本晴（化Fza5別ireL.ssp.japonicaCV.Nipponbare)種子由四川省農(nóng)業(yè)科 學(xué)院繁育提供。
[0027] 3、培養(yǎng)基和溶液 LB培養(yǎng)基：膜蛋白腺10g/L，酵母粉5g/L，化Cl10g/L。用化OH調(diào)抑至7.0， 高壓滅菌。
[0028] SOB培養(yǎng)基：膜蛋白腺 20g/L，酵母粉 5g/L，化Cl0. 58g/L，KCl0. 19g/L， 100XMg" 10血。用化OH調(diào)抑至7.0,高壓滅菌。
[0029] S0C培養(yǎng)基：SOB+ 20%葡萄糖。
[0030] 100XMg2+溶液：20. 33gMgCl2. 6&0 和 24. 65gM拆〇4. 7&0 定容于 100ml&0， 局壓滅園。
[0031] 20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖定容于100血&0,過(guò)濾除菌。
[0032] 4、方法 4. 1水稻葉片RNA提取 1) 取新鮮水稻葉片，加入液氮研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移100-200mg粉末于不含RNase的 1.5血化管中，即刻加入1血Trizol提取液混勻，振蕩10S，室溫下放置5min; 2) 加入0. 2血氯仿，劇烈振蕩15S，室溫下放置2-3min; 3) 4°C，12000g離屯、15min,吸取上清約600uL至新EP管中，加入0.6血異丙醇， 室溫下放置10min; 4) 4°C，12000g離屯、10min,棄上清，沉淀用70%己醇沖洗兩次，4°C，7500g離屯、5 mi打； 5) 倒掉己醇，常溫干燥RNA沉淀10min,溶于50uLRNase-freedd&O中，保存 于-80°C中備用。
[0033] 4. 2RT-PCR 4. 2. 1RT 1) 取 1yg總RNA與 1uLpol^is(10yM)引物混合，用RNase-freedd&O補(bǔ)足 到12. 75uL輕輕混勻； 2) 65°C保溫5min,立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2min; 3) 加入 5X反應(yīng)緩沖液 4uL，10mldNTP2uL，RNA抑制劑 0. 25uL(40U/yL)， ReverTraAce反轉(zhuǎn)錄酶 1uL(100U/yL)，42°C1h，合成第一鏈cDNA; 4) 95°C加熱5min,失活反轉(zhuǎn)錄酶，終止合成反應(yīng)。
[0034] 4. 2. 2PCR
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻基因，所述水稻基因?yàn)镃rjzaFaSproutingInhibitor，縮寫(xiě)為ttsvST， 其特征在于：所述因其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示；所編碼蛋白的氨 基酸序列如序列表中SEQIDN0:2。
2. 如權(quán)利要求1所述水稻基因在降低水稻轉(zhuǎn)基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)方面的應(yīng)用。
3. -種水稻基因的過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)粒，其特征在于：將權(quán)利要求1所述的核苷 酸序列中基因全長(zhǎng)編碼序列插入到真核表達(dá)載體中獲得，所述真核表達(dá)載體為pHB。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒中插入的 基因?yàn)榈幌抻谠摶虻膯伪磉_(dá)，也適用于含有該基因的雙元或多元表達(dá)重組質(zhì)粒。
5. -種降低禾本科作物轉(zhuǎn)基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于：將權(quán)利要求3所述真核 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并獲得該植物轉(zhuǎn)基因植株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述降低禾本科作物轉(zhuǎn)基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于：所述禾 本科作物包括水稻。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻基因，該基因?yàn)镺ryza sativa Sprouting Inhibitor (OsSI)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。將SEQ ID NO：1所述基因全長(zhǎng)編碼序列插入到真核載體中，獲得上述OsSI基因過(guò)量表達(dá)真核重組質(zhì)粒。將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并獲得OsSI過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明所述水稻OsSI基因的過(guò)量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因種子收獲貯存后萌發(fā)率降低甚至無(wú)法萌發(fā)，從而降低了轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)，并且所述基因的過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)水稻對(duì)熱、旱、鹽和冷害的抵抗能力。因而可在自身單獨(dú)應(yīng)用或與其它功能基因共同進(jìn)行作物遺傳轉(zhuǎn)化，改良作物遺傳性狀時(shí)降低轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。
【IPC分類】A01H5-00, C07K14-415, C12N15-82, C12N15-29
【公開(kāi)號(hào)】CN104774846
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510065863
【發(fā)明人】牛向麗, 王安全, 劉瑩, 石瑋, 劉永勝
【申請(qǐng)人】合肥工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日