漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因JsPRP1及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)W及基因工程相關(guān)技術(shù)研究領(lǐng)域，特別是具有抗真菌活性 的濛潰大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)都有可能遭受病原菌的侵染。在種數(shù)繁多的植物病害中，真 菌病害約占植物病害的70~80%。興起于20世紀(jì)初期的經(jīng)典遺傳學(xué)使人們能夠通過雜交育 種成功地培育出抗病新品種，從而大幅度地提高糧食產(chǎn)量。然而，常規(guī)育種具有周期長(zhǎng)、費(fèi) 時(shí)費(fèi)力、有利變異少等缺點(diǎn)，不能從根本上解決植物病害難題。近年來，隨著分子生物學(xué)理 論和技術(shù)的不斷發(fā)展，使人們不但能夠從分子水平上深入認(rèn)識(shí)植物與病原物相互作用的機(jī) 審IJ，而且還可W通過基因工程快速和高效地培育抗病作物新品種。
[0003] 植物細(xì)胞明顯區(qū)別于動(dòng)物細(xì)胞的特征之一就是具有細(xì)胞壁。植物細(xì)胞壁是一個(gè)高 度復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，它們決定細(xì)胞的大小和形狀，在增強(qiáng)植物細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度、調(diào)控細(xì)胞 的生長(zhǎng)速度、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞間信息傳遞等方面起著非常重要的作用。此外，植物細(xì)胞壁還 構(gòu)成了阻止病原體入侵的第一道結(jié)構(gòu)屏障。植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和蛋 白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)占細(xì)胞壁干重的10%左右。細(xì)胞壁蛋白質(zhì)主要由結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白組成， 結(jié)構(gòu)蛋白被認(rèn)為形成一個(gè)獨(dú)立的決定壁結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而輔助細(xì)胞壁裝配，該些蛋白質(zhì)在結(jié) 構(gòu)上高度重復(fù)，富含特定的一兩種氨基酸（許文亮，黃耿青，王秀蘭，汪虹，李學(xué)寶. 一類新的編碼PRPs基因的分離及其在棉花纖維等組織細(xì)胞中的表達(dá).生物化學(xué)與生物物 理進(jìn)展.2007，34: 509 - 517.)。
[0004] 富含脯氨酸蛋白（proline-richprotein,PRP)是一類富含脯氨酸和哲脯氨酸 的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，它們最先發(fā)現(xiàn)于胡蘿h貶藏根中，被認(rèn)為是外界傷害的誘導(dǎo)產(chǎn)物（化en J,VarnerJE.IsolationandcharacterizationofcDNAclonesforcarrotextensin andaproline-rich33-kDaprotein.ProceedingsoftheNationalAcademyof Sciences. 1985,82: 4399 - 4403.)。植物富含脯氨酸蛋白可W分為=類：雜合的富含脯氨 酸蛋白化yPRPs)，包含P0VEKP0VXK重復(fù)序列的PRPsW及NHyPRP蛋白化uangG,GongS, XuW,LiP,ZhangD,QinL,LiW,LiX.GhHyPRP4,acottongeneencodingputative hybridproline-richprotein,ispreferentiallyexpressedinleavesandinvolved inplantresponsetocoldstress.ActabiochimicaetbiophysicaSinica. 2011, 43: 519 - 527. )〇
[0005]PRPs的表達(dá)具有組織器官特異性，并受發(fā)育階段及環(huán)境因素的調(diào)節(jié)。Wyatt等 在大豆中發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)編碼PRPs的基因：況巧?/義況巧?/巧日況巧p/y，盡管在核巧酸和氨基 酸序列上顯示很高的同源性，但它們的表達(dá)特性具有較大差異。5'/，化判在大豆下胚軸的 初皮部和木質(zhì)部表達(dá)，在下胚軸成熟區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的表皮細(xì)胞中也有表達(dá)；5&巧?巧在下胚軸 維管組織的皮層細(xì)胞中和成熟種子的內(nèi)珠被中表達(dá)；巧?巧在下胚軸快速伸長(zhǎng)區(qū)中柱的 內(nèi)胚層細(xì)胞中和葉子的表皮細(xì)胞中表達(dá)（WyattRE,化gaoRT,IfeyJL.Patternsof soybeanproline-richproteingeneexpression.ThePlantCellOnline. 1992， 4: 99-110. )。GmPRP化-1062是大豆（G炒偷戶瓜巧^的啟動(dòng)子，在大豆的毛狀根和擬 南芥的根中優(yōu)先表達(dá)（QienLJiangB,WuC,SunS,HouW,HanT?紐?戶瓜^promoter drivesroot-preferentialexpressionintransgenicArabidopsisandsoybeanhairy roots.BMCplantbiology. 2014,14: 245.)。
[0006] PRPs在抵抗真菌脅迫中有重要的作用。研究表明，沉積和交聯(lián)在珍珠粟 (戶€打(歴知auc歴）植物細(xì)胞壁的PRPs對(duì)植物病原菌優(yōu)7知(9677(9拘妍，細(xì)?7a有抵 抗和屏障作用Oe邵akS,沈ailasreeS,Sujeeth化Kini服，沈ettySH,MithSferA. Purificationandcharacterizationofproline/hydroxyproline-richglycoprotein frompearlmilletcoleoptilesinfectedwithdownymildewpathogenSclerospora 貧ra掛i打ic(97a.Phytochemistry. 2007，68: 298 - 305.)。擬南芥中編碼曲戶化的劍化i7 基因具有抗真菌的功能。Nc^thern印跡雜交結(jié)果顯示，灰霉病菌（化》化7(/6*cinarc苗接 種處理可臥誘導(dǎo)擬南芥劍化//基因的表達(dá)。采用臺(tái)m藍(lán)染色觀察真菌侵染狀況，發(fā)現(xiàn)灰 霉病菌對(duì)超表達(dá)劍化打的植株葉片的侵染程度比野生型植株的葉片要輕，而劍化//基因 突變體植株葉片被侵染的程度較為嚴(yán)重（徐丹.擬南芥劍化//基因在生物和非生物脅迫 中的抗性功能.西北大學(xué)碩±學(xué)位論文.2010.)。平板抑菌實(shí)驗(yàn)表明，重組EA化II蛋白 明顯抑制了尖抱鑲刀菌（化〇巧呵W/??)、灰葡萄抱（原cina/知）分生抱子的萌發(fā) 和菌絲生長(zhǎng)（LiL,ZhangC,XuD,SchlappiM,XuZQ.Expressionofrecombinant EA民LIl,ahybridproline-richproteinofArabidopsis,inEscherichiacoliand itsinhibitioneffecttothegrowthoffungalpathogensandSaccharomyces cerevisiae.Gene. 2012，506: 50 - 61.)。
[0007] 本發(fā)明中富含脯氨酸蛋白/5?戶化7來自濛潰大泡核桃（/媒si知77別aDode)。 濛潰大泡核桃是目前云南主要的核桃栽培品種，具有果大、殼薄、仁白、味香、出油率高、營(yíng) 養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)病原真菌膠抱炭痘菌具有較強(qiáng)的抗性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種從濛潰大泡核桃中克隆獲得具有抗真菌活性的富含脯 氨酸蛋白的全長(zhǎng)基因/5/WW，的核巧酸序列如SEQIDNO; 1所示，該基因全長(zhǎng)為815 bp，包含一個(gè)408bp的開放閱讀框、123bp的5'非翻譯區(qū)（untranslatedregions，UTR) 及284bp的3'UTR，編碼如SEQIDNO;2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明所述富含脯氨酸蛋白基因戶足^的編碼區(qū)是序列表SEQIDNO;1中第 124-531位所示的核巧酸序列。
[0010] 本發(fā)明分離克隆濛潰大泡核桃的一個(gè)抗真菌相關(guān)基因的完整cDNA片段，通過根 癌農(nóng)桿菌（瓜TO知C妃riuffltoffle/aciens)介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中過量表達(dá)，并通 過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物 抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)，發(fā)明人將該個(gè)基因命名為/5/WW。
[0011] 植物PRPs特異定位于細(xì)胞壁，屬于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，但與細(xì)胞膜也有相互作用。 PRPs在構(gòu)建植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)方面起作用，在生物和非生物脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，是植物防御 系統(tǒng)中重要的組成成分。PRPs的表達(dá)能提高植物組織的木質(zhì)化水平，增強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng) 度，而細(xì)胞壁是病原體入侵植物的第一道物理屏障，PRPs在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起到積極的作 用。另外，巧?基因的啟動(dòng)子片段中含有多個(gè)與脫水、病原物、高鹽、低溫等逆境相關(guān)的誘 導(dǎo)元件，超表達(dá)巧?/莖因能提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病性。
[0012] 本發(fā)明設(shè)及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在 一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，對(duì)該基因進(jìn) 行分析，表明化料全長(zhǎng)cDNA為815bp，包含一個(gè)408bp的開放閱讀框、123bp的5'UTR 及284bp的3'UTR，其中0RF編碼一個(gè)具有135個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST分析結(jié)果顯 示濛潰大泡核桃巧PW編碼的蛋白質(zhì)與甜澄PRP(仿皆si/?e/7sis，XP_006477234. 1)的 氨基酸序列具有84%的相似性。JsPRPl含有N端信號(hào)膚、富含脯氨酸重復(fù)區(qū)域和C端8個(gè) 特定排列的半脫氨酸，具有典型的PRPs特征，該表明其屬于濛潰大泡核桃中的富含脯氨酸 蛋白。超表達(dá)序列表SEQIDNO;1所示序列可W增強(qiáng)煙草對(duì)膠抱炭痘菌（仿WefWric扣/曲 gloeosporioides)、孩盛舊iScleroti打iascyei-ofioru曲）、葡萄座月空菌（公〇 沁沁a)W及串珠狀赤霉菌（GiA如'eWa 的抗性。
[0013] 上述基因可W應(yīng)用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下： (1)采用擴(kuò)增的特異引物，從接種膠抱炭痘菌后的濛潰大泡核桃葉中提取 總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-polymerasechain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增出/s戶足^的全長(zhǎng)編碼區(qū)，然后將其連接到pMD-lST載體上，經(jīng)測(cè)序 獲得具有目的基因的克隆。
[0014] 似用限制性內(nèi)切酶伽冊(cè)和仿oRI酶切pMD18-T-/s/WW載體和植物表達(dá)載體 PCAMBIA2300S，通過膠回收得到目的基因片段和載體大片段。再將所獲得基因片段 與PCAMBIA2300S載體片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體。之后將所構(gòu)建的重組載體通過根癌 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)。
[0015] (3)W重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過PCRW及RT-PCR檢 測(cè)得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于病原真菌的抗性，最后篩選出對(duì)真菌抗性明 顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016] 本發(fā)明為提高植物對(duì)真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培 育抗病植物可W克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡(jiǎn)單，容易獲得高抗材 料。本發(fā)明中來自濛潰大泡核桃的基因能增強(qiáng)植物對(duì)幾種病原真菌的抗性，將該基 因?qū)霟煵葜?，可W產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性植 物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)和不可取代的重要性。它不僅可W為大規(guī)模生產(chǎn)作物、花弁 等提供方便，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可W為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減少環(huán)境污染，因此本發(fā) 明具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發(fā)明中部分巧滬巧?；驘煵莼蚪MDNA的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中Marker; DL2000DMMarker(大連寶生物），由 2,000bp、l，000bp、750bp、500bp、250bpW及 100bp六條DNA片段組成；正對(duì)照：質(zhì)粒PMD18-T-/S巧為模板的PCR反應(yīng)；WT;非轉(zhuǎn)基因 煙草（野生型）總dm為模板進(jìn)行的PCR; 圖2是本發(fā)明中部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析結(jié)果圖， 其中Marker;DL2000DMMarker(大連寶生物）；WT;非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為 模板的PCR產(chǎn)物；正對(duì)照：質(zhì)粒PMD18-T-/S巧為模板的PCR產(chǎn)物； 圖3是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果圖；其中a、b、C、d圖 示中的真菌分別是核盤菌、膠抱炭痘菌、串珠狀赤霉菌W及葡萄座腔菌；WT為野生型煙草 的總蛋白；CK為空白對(duì)照，即無蛋白對(duì)照（用于提取蛋白的緩沖液）。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi) 容，本實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常 規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0019] 實(shí)施例1 全長(zhǎng)cDNA克