一種水稻基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物基因工程領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種水稻基因W及該基因在降低水稻轉(zhuǎn) 基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著1983年世界第一例轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物性狀改良和遺 傳育種研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了豐碩的成果。在過去的幾十年間，科研工作者們 先后培育出了具有抗蟲、抗逆境、抗除草劑、品質(zhì)改良等優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因作物品種。然而， 轉(zhuǎn)基因作物存在的安全性問題一直是研究人員爭議的熱點(diǎn)（Talas-化a,Acta化ysiology Plant, 2011)。轉(zhuǎn)基因植物設(shè)及的安全問題主要包括轉(zhuǎn)基因食品安全和轉(zhuǎn)基因環(huán)境生態(tài)安 全問題，其中環(huán)境和生態(tài)安全的一個(gè)主要方面是轉(zhuǎn)基因逃逸所帶來的風(fēng)險(xiǎn)（盧寶榮等，生 命科學(xué)，2011;左嬌等，玉米科學(xué)，2014)。轉(zhuǎn)基因逃逸指的是轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因 通過基因漂移轉(zhuǎn)移到非轉(zhuǎn)基因物種中的現(xiàn)象，根據(jù)傳播媒介的不同，基因漂移可W分為；花 粉、無性繁殖器官W及種子介導(dǎo)的基因漂移。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物均含有抗性篩選標(biāo)記（如 卡那霉素、潮霉素等標(biāo)記），并具有抗除草劑性狀，該種轉(zhuǎn)基因逃逸至近緣野生種中有形成 超級雜草的風(fēng)險(xiǎn)，或者轉(zhuǎn)基因植物本身成為超級雜草，從而威脅生態(tài)平衡（Andow，Ecology Letter, 2006)。為了解決該種問題，科研人員開發(fā)了若干種方法，例如，刪除抗性篩選標(biāo)記 或采用其它篩選方法，從而避免抗性篩選標(biāo)記帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；采用物理隔離的方法限制 轉(zhuǎn)基因逃逸；利用細(xì)胞質(zhì)及雄性不育系轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)手段降低轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)等。 上述幾種方法存在著隔離不徹底、實(shí)際應(yīng)用中操作難度大或者所需成本高等不足，因此開 發(fā)簡單、有效和低成本的方法具有重要意義。
[0003] 功能結(jié)構(gòu)域分析表明，本發(fā)明所設(shè)及的基因化SI具有小分子熱激蛋白相似結(jié)構(gòu) 域，推測可能屬于小熱激蛋白家族，但對其具體功能并不了解。小分子熱激蛋白是一組 分子量為12-43kD、在C端含有一個(gè)保守ACD結(jié)構(gòu)域（a-C巧stallindomain)的蛋白 質(zhì)（Perez等，Plant化ysiology, 2009)。植物的小熱激蛋白趨向于獨(dú)立進(jìn)化，通過基 因擴(kuò)增機(jī)制形成相較于動物更多的家族成員。如果蛹、人類中分別有4、10個(gè)小分子熱激 蛋白，而擬南芥、甘庶基因組中分別預(yù)測有19、24個(gè)小熱激蛋白（Scharf等，CellStress Chaperones, 2001；Borges等，Journalofplantphysiology, 2007)。Waters等（Cell Stress化aperones, 2008)進(jìn)一步將已發(fā)現(xiàn)的植物小分子熱激蛋白由7個(gè)亞家族擴(kuò)展為 11個(gè)亞家族，并通過比較基因組發(fā)現(xiàn)，龐大的小分子熱激蛋白超家族在各個(gè)植物物種中獨(dú) 立進(jìn)化。多數(shù)小分子熱激蛋白可在熱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，一些小熱激蛋白也可對冷、旱、鹽甚 至紫外線W及有毒物質(zhì)、過氧化物和病蟲害等脅迫產(chǎn)生反應(yīng)（Gorovits等，Molecular Plant-MicrobeInteractions, 2004)，可能在植物逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在重要糧食 作物水稻的ryzasativa)中共有23個(gè)小分子熱激蛋白候選基因，40個(gè)含有小分子熱激蛋 白保守ACD結(jié)構(gòu)域，可能編碼小熱激蛋白的基因（Sarkar等，BMCGenomics, 2009)。該些 推測的小分子蛋白是水稻自身基因資源，基因序列短易于克隆和遺傳操作，但其具體功能、 它們的表達(dá)是否影響水稻的其它性狀表型等尚待系統(tǒng)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻基因。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種水稻基因，該基因?yàn)榛痏7細(xì)5別iraSproutingInhibitor,縮寫為化57，化57基 因其核巧酸序列如序列表中SEQIDNO;1所示；所編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO;2。
[0006] 作為優(yōu)選，水稻基因化在降低水稻轉(zhuǎn)基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)方面的應(yīng)用。
[0007] -種水稻基因的過表達(dá)真核重組質(zhì)粒，將化的核巧酸序列中基因全長編碼序 列插入到真核表達(dá)載體中獲得，真核表達(dá)載體為P皿。
[0008] 作為優(yōu)選，重組質(zhì)粒中插入的基因?yàn)榛疭/，但不限于該基因的單表達(dá)，也適用于含 有該基因的雙元或多元表達(dá)重組質(zhì)粒。
[0009] -種降低禾本科作物轉(zhuǎn)基因逃逸風(fēng)險(xiǎn)的方法，將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并獲得該 植物的轉(zhuǎn)基因植株。
[0010] 作為優(yōu)選，禾本科作物包括水稻。
[0011] 本發(fā)明所述水稻基因化的過量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因種子收獲貶存后萌發(fā)率降低甚至 無法萌發(fā)，從而降低了轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)，并且所述基因的過量表達(dá)可增強(qiáng)水稻對熱、旱、 鹽和冷害的抵抗能力。因而可在自身單獨(dú)應(yīng)用或與其它功能基因共同進(jìn)行作物遺傳轉(zhuǎn)化， 改良作物遺傳性狀時(shí)降低轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)控制提供了一種新的方法。
[0013] 2、本發(fā)明為避免自留種保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)提供了一種新的手段。
[0014] 3、本發(fā)明為提高水稻對多種逆境（高溫、干旱、鹽、冷害）抵抗能力的性狀改良提 供了一種新的功能資源。
[0015] 4、本發(fā)明所述基因編碼序列短，易于克隆和基因工程操作。
[0016] 5、本發(fā)明所述基因的克隆和植物轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。
【附圖說明】
[0017] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0018] 圖1是水稻化基因在多種逆境脅迫條件個(gè)1A)、激素誘導(dǎo)個(gè)1B)和田間 生長成熟植株各組織中（圖1C)的表達(dá)情況。A;從左至右依次為：化在正常生長條件 (28°C)、高溫（38°C處理3h; 45°C處理24h)、鹽（100ml化C1處理48h)、旱（干旱處 理48h)、低溫（4°C處理48h)條件下的表達(dá)水平；B;從左至右依次為：化在無植物激素 正常生長條件下（對照）、10yM赤霉素佑A)、10yM蒙己酸（NAA)、1yM脫落酸（ABA)誘 導(dǎo)72h時(shí)的表達(dá)水平；C;從左至右依次為：化在生長于光照培養(yǎng)箱（28°C，12h光/12 h暗）的野生型日本晴幼苗葉片、成熟植株（午間平均室外溫度40°C)根、莖、葉、節(jié)和穎花 中的表達(dá)水平。柱狀圖中不同字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（K0. 05)。
[0019] 圖2是化基因植物過表達(dá)載體P皿-OsSI的構(gòu)建。A;化基因過表達(dá)真核重 組質(zhì)粒p皿-OsSI構(gòu)建示意圖;B;重組質(zhì)粒p皿-OsSI酶切鑒定圖。圖中，從左至右第1泳道 為DNA分子標(biāo)記，Trans2Kplus,第2泳道為抑B-OsSI質(zhì)粒jO別I、思aI雙酶切結(jié)果。
[0020] 圖3是化過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株鑒定結(jié)果。A;轉(zhuǎn)基因水稻植株中篩選標(biāo)記潮霉素 抗性基因（曲f)PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖中，M;DNA分子標(biāo)記，DL2000;1;陰性對照，PCR模板為野 生型植株基因組DNA;2 ;陽性對照，PCR模板為重組質(zhì)粒抑B-OsSI;3-5 ;PCR模板為3個(gè)獨(dú) 立轉(zhuǎn)基因植株0X-1、0X-2、0X-3基因組DNA。B;從左至右依次為；野生型（WT)、3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn) 基因株系幼苗（0X-1~0X-3)正常生長條件下（28°C，12h光/12h暗）化