一種利用細(xì)菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，設(shè)及一種利用細(xì)菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌展示技術(shù)又稱W細(xì)胞內(nèi)膜為基礎(chǔ)的細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)技術(shù)（anchored periplasmaexpressiontechnology，APEx)。該技術(shù)特點(diǎn)是利用細(xì)胞間質(zhì)膜脂蛋白的信號(hào) 膚NlpAleader將目的蛋白運(yùn)送到細(xì)菌間質(zhì)腔，而NlpAleader在蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸過程中 被逐步降解，剩下的6個(gè)氨基酸（CDQSS巧與細(xì)胞內(nèi)膜外側(cè)的磯脂層形成脂巧鍵，從而將與 其融合的抗體片段展示于細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)。當(dāng)細(xì)菌外膜被溶菌酶消化后成原生質(zhì)球，解育液 中的抗原可進(jìn)入細(xì)菌間質(zhì)與錯(cuò)定在細(xì)胞內(nèi)膜外側(cè)的抗體片段結(jié)合，然后將其與巧光標(biāo)記的 抗體進(jìn)行共解育，陽性克隆可被流式細(xì)胞儀高通量的檢測分離。
[0003]pelBleader為果膠酶基因前導(dǎo)膚，可W引導(dǎo)與其融合的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌間質(zhì)，并 且在進(jìn)入間質(zhì)后也被降解完全。其融合的蛋白質(zhì)在間質(zhì)腔中和牟定的具有結(jié)合能力的抗體 片段結(jié)合。
[0004] 細(xì)菌展示技術(shù)在篩選抗體方面具有很多優(yōu)勢(shì)如；（1)高富集比；（2)高陽性率；（3) 由于反應(yīng)在溶液狀態(tài)下進(jìn)行，可克服常規(guī)生物淘洗過程中由于篩選配基固定化而導(dǎo)致的 "親和效應(yīng)"。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM)進(jìn)行篩選可W真正的做到實(shí)時(shí)監(jiān)測同步跟進(jìn)，非常直觀 的追蹤抗原表位的甄別情況。此外，該技術(shù)相對(duì)簡便易行，只要經(jīng)過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)就可W 直接將抗體片段插入到展示載體中，并且經(jīng)過細(xì)菌電轉(zhuǎn)化可獲得庫容量高達(dá)1〇9~10W的 抗體庫，滿足了抗體篩選對(duì)庫容量要求。
[0005] 全世界范圍內(nèi)，只有美國Texas大學(xué)于2007年在美國科學(xué)院院報(bào)上報(bào)道了展示 F油抗體庫的展示技術(shù)APEx2-hybrid，所利用的宿主菌為E.coliDH10B，但是迄今為止尚 無文獻(xiàn)驗(yàn)證該方法的可行性和實(shí)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體的編碼基因 的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體的編碼基因的方法，具體可 包括如下步驟：
[0008]A)按照包括如下步驟的方法構(gòu)建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編 碼庫：
[0009] (al)根據(jù)已知的抗體框架區(qū)序列，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)的簡并引 物對(duì)1，W及用于擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)的簡并引物對(duì)2 ;
[0010] 所述已知的抗體框架區(qū)序列為源自于攜帶所述祀標(biāo)抗原的微生物的宿主的抗體 框架區(qū)序列；如所述祀標(biāo)抗原為能夠感染人的己肝病毒的某一蛋白，則所述已知的抗體框 架區(qū)序列為人的抗體框架區(qū)序列；
[0011] (a。采用所述簡并引物1和所述簡并引物對(duì)2從初始樣本中分別擴(kuò)增得到抗體重 鏈可變區(qū)集合和抗體輕鏈可變區(qū)集合；
[0012] 所述初始樣本中含有由不同種抗所述祀標(biāo)抗原的抗體組成的抗體庫；
[0013] 所述初始樣本可為如下a)或b):
[0014] a)健康個(gè)體的組織樣本（如血液等），所述健康個(gè)體為免疫了含有所述祀標(biāo)抗原 或其編碼核酸的疫苗后，激起免疫反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體的健康個(gè)體；
[0015] b)患病個(gè)體的組織樣品（如血液等），所述患病個(gè)體為因攜帶所述祀標(biāo)抗原的致 病微生物（如病毒、細(xì)菌或真菌等）感染所引起的患病個(gè)體，且經(jīng)證實(shí)已激起免疫反應(yīng)并產(chǎn) 生抗體。
[0016] 所述抗體重鏈可變區(qū)集合為由不同重鏈可變區(qū)組成的集合；所述輕鏈可變區(qū)集合 為由不同輕鏈可變區(qū)組成的集合；
[0017] 所述簡并引物對(duì)1和所述簡并引物對(duì)2均既可為一個(gè)引物對(duì)，也可為多個(gè)引物 對(duì)。當(dāng)為多個(gè)引物對(duì)時(shí)，采用所述簡并引物對(duì)1中的每個(gè)引物對(duì)分別對(duì)所述初始樣本進(jìn)行 擴(kuò)增，擴(kuò)增所得片段的集合即為所述抗體重鏈可變區(qū)集合；采用所述簡并引物對(duì)2中的每 個(gè)引物對(duì)分別對(duì)所述初始樣本進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增所得片段的集合即為所述抗體輕鏈可變區(qū)集 合。
[0018] (a3)將所述抗體重鏈可變區(qū)集合中的不同重鏈可變區(qū)和所述抗體輕鏈可變區(qū)集 合中的不同輕鏈可變區(qū)通過重鏈恒定區(qū)CH1進(jìn)行隨機(jī)連接，獲得由不同待檢測單鏈抗體編 碼基因組成的基因編碼庫；
[0019] 所述重鏈恒定區(qū)CH1為源自于攜帶所述祀標(biāo)抗原的微生物的宿主的重鏈恒定區(qū) CH1的前15個(gè)氨基酸；如所述祀標(biāo)抗原為能夠感染人的己肝病毒的某一蛋白，則所述重鏈 恒定區(qū)CH1為人的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個(gè)氨基酸；
[0020] 在本發(fā)明中，所述抗體重鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的上游；所述抗體 輕鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的下游。
[0021] B)按照包括如下步驟的方法獲得特異于所述祀標(biāo)抗原的所述目標(biāo)單鏈抗體的基 因編碼序列：
[0022] 化1)將所述基因編碼庫中的各待檢測單鏈抗體編碼基因分別與祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽 蛋白融合基因共同構(gòu)建于同一表達(dá)載體，并使所述待檢測單鏈抗體編碼基因融合于信號(hào)膚 1的編碼基因的下游，使所述祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽蛋白融合基因融合于信號(hào)膚2的編碼基因的下 游，獲得重組表達(dá)載體庫；所述重組表達(dá)載體庫中各載體上均含有所述祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽蛋 白融合基因和任一種所述待檢測單鏈抗體編碼基因；
[0023] 所述祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽蛋白融合基因?yàn)橛伤鲮霕?biāo)抗原的編碼基因和所述標(biāo)簽蛋 白的編碼基因融合而成的融合基因；
[0024] 所述信號(hào)膚1為具有如下功能的信號(hào)膚；將與其融合的目的蛋白展示于細(xì)菌內(nèi)膜 外側(cè)（即將所述與其融合的目的蛋白運(yùn)送到細(xì)菌間質(zhì)腔，并定位于細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)）；
[0025] 所述信號(hào)膚2為具有如下功能的信號(hào)膚；將與其融合的目的蛋白運(yùn)送到細(xì)菌間質(zhì) 腔后自身完全降解，所述目的蛋白游離于所述細(xì)菌間質(zhì)腔內(nèi)；
[0026] 所述信號(hào)膚1不具有所述信號(hào)膚2的W上功能；且所述信號(hào)膚2也不具有所述信 號(hào)膚1的w上功能。
[0027] 化2)將所述重組表達(dá)載體庫中的各重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌，得到重組細(xì)菌 庫；所述重組細(xì)菌庫中各重組細(xì)菌中均含有任一種所述重組表達(dá)載體（即在所述重組細(xì)菌 庫中，每個(gè)所述重組細(xì)菌中均只含有一種所述重組表達(dá)載體，該一種重組表達(dá)載體可為所 述重組表達(dá)載體庫中的任一種所述重組表達(dá)載體）；
[0028] 化3)培養(yǎng)所述重組細(xì)菌庫，誘導(dǎo)所述重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，由所述待檢測單 鏈抗體編碼基因編碼所得的待檢測單鏈抗體被展示于所述細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，由所述祀標(biāo)抗 原-標(biāo)簽蛋白融合基因編碼所得的祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽融合蛋白游離于所述細(xì)菌間質(zhì)腔內(nèi)；
[0029] 化4)去除所述重組細(xì)菌庫中各重組細(xì)菌的外膜（如用溶菌酶處理），得到原生質(zhì) 球庫；所述原生質(zhì)球庫中每個(gè)原生質(zhì)球上均展示有任一種所述待檢測單鏈抗體，游離于所 述原生質(zhì)球外的所述祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽融合蛋白能夠被所述待檢測單鏈抗體中的特異性單 鏈抗體所捕獲，形成抗原抗體復(fù)合物（而所述原生質(zhì)球表面的非特異性單鏈抗體則不能捕 獲所述祀標(biāo)抗原）；
[0030] 化5)將所述原生質(zhì)球庫與經(jīng)巧光標(biāo)記的抗所述標(biāo)簽蛋白的抗體共同解育，只有表 面形成了所述抗原抗體復(fù)合物的原生質(zhì)球能夠被標(biāo)記上所述巧光，從所述原生質(zhì)球庫中獲 得表面被標(biāo)記上了所述巧光的原生質(zhì)球（如采用流式細(xì)胞儀對(duì)所述原生質(zhì)球庫進(jìn)行流式 分選），記為巧光-原生質(zhì)球；所述巧光-原生質(zhì)球的表面展示的所述待檢測單鏈抗體即為 所述目標(biāo)單鏈抗體；
[0031] 化6)從所述巧光-原生質(zhì)球中提取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)入所述宿主細(xì)菌，進(jìn)行所述質(zhì)粒 的擴(kuò)繁培養(yǎng)，從培養(yǎng)后的細(xì)菌中提取所述質(zhì)粒，保種；
[0032] 對(duì)所述質(zhì)粒測序后獲得所述目標(biāo)單鏈抗體的基因編碼序列。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體的方法，是構(gòu)建單鏈抗 體庫并從中篩選單鏈抗體的方法。
[0034] 該方法除了包括所述A)步驟和所述B)步驟，在所述B)步驟之后還包括如下步驟 C)；
[003引 C)根據(jù)步驟B)獲得的所述目標(biāo)單鏈抗體的基因編碼序列，進(jìn)行蛋白表達(dá)，獲得所 述目標(biāo)單鏈抗體。
[0036] 在本發(fā)明中，所述信號(hào)膚1為NlpAleader信號(hào)膚；所述信號(hào)膚2為pelBleader 信號(hào)膚。
[0037] 所述NlpAleader信號(hào)膚的編碼基因的序列為序列表中序列1的第5258-5344位； 所述pelBleader信號(hào)膚的編碼基因的序列為序列表中序列1的第167-232位。
[0038] 在本發(fā)明中，所述宿主細(xì)菌為大腸桿菌；具體為大腸桿菌D冊(cè)a。
[0039] 在本發(fā)明中，所述標(biāo)簽蛋白為Flag蛋白。所述Flag蛋白的氨基酸序列具體為序 列表中序列2所示。
[0040] 在本發(fā)明中，所述巧光的標(biāo)記物為FITC。
[0041] 在本發(fā)明中，步驟化1)中，所述表達(dá)載體具體為地GD載體；所述地GD載體的序列 具體如序列表中序列1所示。
[0042] 在所述方法的步驟化5)中，所述"從所述原生質(zhì)球庫中獲得表面被標(biāo)記上了所述 巧光的原生質(zhì)球"中，所述"獲得"的方法即可為單輪篩選，也可為多輪（如2-4輪）篩選； 當(dāng)為多輪篩選時(shí)，自第2輪篩選起，每一輪篩選均從前一輪篩選所得的所述原生質(zhì)球中提 取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)入所述宿主細(xì)菌，重復(fù)化3)-化5)的步驟。隨著篩選輪數(shù)的增加可W逐漸降 低經(jīng)所述巧光標(biāo)記的抗所述標(biāo)簽蛋白的抗體（如FITC標(biāo)記的Flag抗體）的用量，該樣有 利于篩選到親和力更強(qiáng)的抗體。
[0043] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體或其 編碼基因的試劑盒。
[0044] 本發(fā)明所提供的用于獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體或其編碼基因的試劑 盒，可包括表達(dá)載體、宿主細(xì)菌、經(jīng)巧光標(biāo)記的抗標(biāo)簽蛋白的抗體；
[0045] 所述表達(dá)載體含有編碼所述信號(hào)膚1和所述信號(hào)膚2的基因，用于共表達(dá)所述待 檢測單鏈抗體和所述祀標(biāo)抗原-標(biāo)簽融合蛋白（如所述地GD載體）；
[0046] 所述宿主細(xì)菌可為大腸桿菌；具體如大腸桿菌D冊(cè)a;
[0047] 所述經(jīng)巧光標(biāo)記的抗標(biāo)簽蛋白的抗體可為經(jīng)FITC標(biāo)記的抗Flag蛋白的抗體。
[0048] 另外，所述試劑盒中還可含有記載有如上所述方法的可讀性載體，如說明書。
[0049] 所述試劑盒在獲得特異于祀標(biāo)抗原的目標(biāo)單鏈抗體或其編碼基因中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 在本發(fā)明中，所述祀標(biāo)抗原為源自病原微生物（如病毒、細(xì)菌或真菌）的具有抗原 活性的物質(zhì)，如蛋白、多膚、多糖或小分子化合物和載體蛋白的偶聯(lián)物等。
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述祀標(biāo)抗原具體為傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的 VP2蛋白。所述VP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列4,所述VP2蛋白的編碼基因的序列 為序列表中序列5。所述重鏈恒定區(qū)CH1為雞的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個(gè)氨基酸。所述雞 的重鏈恒定區(qū)CH1的氨基酸序列為序列表中序列6的第125-139位（對(duì)應(yīng)的編碼基因序列 為序列表中序列7的第373-417位）。所述