專利名稱：：轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁側(cè)序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的基因序列。具體的說，涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列。技術(shù)背景水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中的廣泛研究和應(yīng)用，已經(jīng)有多個轉(zhuǎn)基因水稻品系進(jìn)行了環(huán)境釋放，申請商業(yè)化種植。對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行品系特異性的檢測是對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要技術(shù)基礎(chǔ)。而轉(zhuǎn)基因植物的外源插入片段的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測方法的重要技術(shù)資料。目前已經(jīng)有部分專利和文獻(xiàn)報道了轉(zhuǎn)基因植物外源插入載體旁側(cè)序列，例如張大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁側(cè)序列，建立了轉(zhuǎn)基因MON863玉米的品系特異性檢測方法。然而，在對現(xiàn)有的專利和文獻(xiàn)的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的文章和專利報道。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領(lǐng)域中的空白，提供了一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供該轉(zhuǎn)基因品系特異性的PCR檢測方法。一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為5'端旁側(cè)序列，其特征在于5'端旁側(cè)序列如SEQIDN01所示。一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為3'端旁側(cè)序列，其特征在于3'端旁側(cè)序列如SEQIDN02所示。5'端旁側(cè)序列的制備方法，是通過TAIL-PCR擴增得到。3'端旁側(cè)序列的制備方法，是通過LD-PCR擴增得到。轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物為依據(jù)SEQIDN01中l(wèi)-884位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物為依據(jù)SEQIDN01的885-1544位序列設(shè)計的反向引物。所述正向弓l物為Dfl:5'-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3，，所述反向弓l物為LB-P3:5'-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3，。轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物依據(jù)SEQIDN02中1-1311位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物依據(jù)SEQIDN02的1312-1581位序列設(shè)計的反向引物。所述正向序列為1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3'，所述反向序列為Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'。根據(jù)Wu等(稱etal，2002，TheorApplGenet，104:727-734)報道的用于轉(zhuǎn)化的載體pKUB的結(jié)構(gòu)圖，其中T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)見圖1，由叩tll抗性基因表達(dá)盒、cryJAb基因表達(dá)盒、hpt抗性基因表達(dá)盒和gus基因表達(dá)盒組成。本發(fā)明采用常規(guī)方法，提取植物基因組DNA，利用TAIL-PCR分離法得到5，端旁側(cè)序列1544bp，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。通過分析，該5'端旁側(cè)序列包括水稻基因組序列，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707035-24707918位，其核苷酸序列與SEQIDNO.l中從l-884位的核苷酸序列完全相同；T-DNA左邊界區(qū)域序列，來源于外源插入載體pKUB，其核苷酸序列與SEQIDNO.l中885-1544位的核苷酸序列完全相同。利用LD-PCR分離法得到3'端旁側(cè)序列1581bp，其核苷酸序列如SEQIDN02所示。通過分析，該3，端旁側(cè)序列包括玉米啟動子PW/的部分序列，來源于外源插入載體pKUB，其核苷酸序列與SEQIDN0.2中的1-1311位的核苷酸序列完全相同；水稻基因組序列，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707954-24708223位，其核苷酸序列與SEQIDN0.2中從1312-1581位的核苷酸序列完全相同。轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，可以5'端旁側(cè)序列和/或3'端旁側(cè)序列作為目的DNA擴增片段。根據(jù)5'端旁側(cè)序列設(shè)計特異性引物，其正向引物可根據(jù)l-884位的核苷酸序列設(shè)計，即是按照水稻基因組序列設(shè)計，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707035-24707918位，反向引物可根據(jù)885-1544位的核苷酸序列設(shè)計，即是按照T-DNA左邊界區(qū)域序列設(shè)計，本發(fā)明設(shè)計的正向引物為Dfl:5，-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3，，反向引物為LB-P3:5，-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3'。根據(jù)3'端旁側(cè)序列設(shè)計特異性引物，其正向引物可根據(jù)卜1311位的核苷酸序列設(shè)計，即是按照玉米啟動子P"W的部分序列設(shè)計，反向引物可根據(jù)1312-1581位的核苷酸序列設(shè)計，即是按照水稻基因組序列，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707954-24708223位設(shè)計，本發(fā)明設(shè)計的正向序列為1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3，，反向序列為Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'。本發(fā)明首次克隆了轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列，并且明確了轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列可以用作目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的品系特異性定性、定量PCR檢測。本發(fā)明所克隆、分離的外源插入片段的旁側(cè)序列可以進(jìn)一歩用于建立轉(zhuǎn)基因品系特異性PCR檢測方法。圖l轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的轉(zhuǎn)化載體pKUB的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)示意2通過TAIL-PCR方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5'端旁側(cè)序列。M:markerDL2000;泳道上方的編號代表使用的簡并引物分別與第三級巢式引物組合的擴增結(jié)果。圖3通過LD-PCR方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3'端旁側(cè)序列。M:marker入/HindlII;1:Drl/crylA-R引物擴增；2:Drl/nos-R引物擴增圖4轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端旁側(cè)序列特異性引物Dfl/LB-P3檢測M:markerDL2000;1,2:轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1);3，4:對照秀水11圖5轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的3'端旁側(cè)序列特異性引物Drl/1145f檢測。M:markerDL2000;1,2:轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1);3，4:對照秀水1具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的克隆一、實驗材料1、植物材料轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMDl)。常規(guī)水稻秀水ll。2、酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物和簡并引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3、實驗儀器PCR擴增儀EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(AppliedBiosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。二、實驗方法和過程1、外源插入載體Wu等(wuetal,2002)報道了用于轉(zhuǎn)化的載體pKUB的結(jié)構(gòu)圖，其中T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)見圖l，由nptll抗性基因表達(dá)盒、czyiAb基因表達(dá)盒、hpt抗性基因表達(dá)盒和giis基因表達(dá)盒組成。2、植物基因組DNA提取與檢測2.1、植物DNA提取2丄1、抽提液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2丄3、提取方法a稱取200-400mg水稻葉片，在液氮中磨碎，裝入已經(jīng)用液氮預(yù)冷的1.5ml離心管中。b加入lml預(yù)冷至4。C的抽提液，劇烈搖動混勻后，在冰上靜置5分鐘，用13000r/min離心機，4。C離心15min，棄去上清液。c加入600^1預(yù)熱到65。C的抽提裂解液，用玻棒攪拌上下顛倒充分混勻，在65'C的水浴鍋中裂解40min。d用13000r/min離心機室溫離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入5plRNaseA(10mg/ml)，37°C水浴30min。e分別用等體積苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)和氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次。f用13000r/min離心機室溫離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。加入2/3體積異丙醇，1/10體積3M乙酸鈉(pH5.6),-20。C放置2-3h，充分沉淀DNA。g13000r/min，4。C離心15min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50nlTE(pH8.0)溶解DNA。h把DNA溶液濃度用重蒸餾水調(diào)制為100ng爾l，儲存于-20t:備用。3、TAIL-PCR分離已知序列的旁側(cè)序列TAIL-PCR詳細(xì)的描述見Liu等(Liuetal"1995,ThePlantJournal,8(3):457-463)，用于擴增已知區(qū)域的側(cè)翼序列。根據(jù)T-DNA左邊界區(qū)域設(shè)計三個巢式特異性PCR引物L(fēng)B-P1LB-P3，依次與8個簡并引物AD2-6、AD8、AD9、AD11分別組合進(jìn)行三次PCR擴增，引物序列見表l。PCR反應(yīng)條件見表2。表l用于TAIL-PCR擴增的簡并引物和特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>長鏈PCR用于擴增水稻基因組中的長片段。本實施例中用于擴增轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入載體的3'端旁側(cè)序列。根據(jù)擴增得到的5'端旁側(cè)序列中的水稻基因組，設(shè)計其下游區(qū)域的特異性引物Drl，在轉(zhuǎn)化載體pKUB右邊界附近設(shè)計引物nos-R和c/y"-R。引物Drl分別與nos-R和c/y"-R組合進(jìn)行擴增，引物序列見表3。表3用于LD-PCR的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>LD-PCR擴增體系為總體系50nL，ExTaq(Takaraco..Dalian)，1.25U10xExTaqBuffer5pL,dNTP(各2.5mM)4pL，水稻DNA2(iL(10ng/|iL)，引物各2^iL(25一)。LD陽PCR擴增程序94。C4min;(98°C10s，68°C15min)，30cycles;72°C10min。5、序列測定和分析PCR擴增產(chǎn)物在0.8X的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收擴增片段，連接至UpGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進(jìn)行序列測定。采用vectorNTI10.0(Invi加gen)比較和分析測定的序列與載體序列相似性，在NCBI數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN檢索相似的水稻基因組序列。三、實驗結(jié)果1、TAIL-PCR擴增和LD-PCR擴增分別獲得了5'端和3'端外源插入片段的旁側(cè)序列根據(jù)轉(zhuǎn)化載體T-DNA左邊界區(qū)域設(shè)計的特異性引物與8個簡并引物組合進(jìn)行TAIL-PCR擴增，獲得了5'端外源插入片段的旁側(cè)序列(圖2)。根據(jù)其中的水稻基因組序列，設(shè)計特異性的下游引物，與轉(zhuǎn)化載體pKUB右邊界附件的crylAb上的引物組合進(jìn)行擴增，獲得了3'端外源插入片段的旁側(cè)序列(圖3)。2、5'端外源插入片段的旁側(cè)序列分析TAIL-PCR擴增方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5'端外源插入片段的旁側(cè)序列，經(jīng)DNA序列分析和核酸數(shù)據(jù)庫中檢索表明5'端旁側(cè)序列長度為1544bp，其中含有884bp的水稻基因組序列，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707035-24707918位；660bp的T-DNA左邊界區(qū)域序列，來源于外源插入載體pKUB。具體的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端外源插入片段的旁側(cè)序列的信息見SEQIDNO1。3、3'端外源插入片段的旁側(cè)序列分析采用LD-PCR擴增的方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3'端外源插入片段的旁側(cè)序列，經(jīng)DNA序列分析和核酸數(shù)據(jù)庫中檢索表明3'端旁側(cè)序列長度為1581bp，其中含有1311bp的玉米啟動子Pubi的部分序列，來源于外源插入載體pKUB，270bp的水稻基因組序列，位于水稻2號染色體(GenBank登記號AP008208)的24707954-24708223位。具體的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的3'端外源插入片段的旁側(cè)序列的信息見SEQIDN02。實施例2基于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法一、實驗材料1、植物材料轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)。常規(guī)水稻秀水ll。2、酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3、實驗儀器PCR擴增儀EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。二、實驗方法和過程1、植物基因組DNA提取與檢測見實施例l中的"植物基因組DNA提取與檢測"2、基于5'端和3'端旁側(cè)序列的品系特異性PCR檢測根據(jù)實施例1中測定的5'端和3'端旁側(cè)序列，分別在其水稻基因組序列部分和轉(zhuǎn)化載體序列部分設(shè)計引物，見表4。PCR擴增結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端和3'端擴增引物組合分別得到了預(yù)期的508bp和437bp的擴增片段，而對照秀水ll均沒有相應(yīng)的擴增片段，見圖4和圖5。表4轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端和3'端品系特異性檢測引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Drl5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'附錄序列表SEQIDN01:5'端序歹U:(1544bp)1ACGAACCAACGCTCGAGCACAGATGCAGGTGAGCTCGATCAGATTCAGAACTGAATCACA61GGCAGCGAACTCTTTTTTTCTGTACATTCTGATTTCTAAATGAAGCTCAACGTTACGATG121CGCCAAACTAGTGCTCAATGAGTACAATATACGACCTCCTCGGATCGCGTACCCCTGACA181CCATGAAACGGTTGGCAGGTAATACGGTTTGAAATCGGAAATACTCCGTTTCACATGATA241GTACAGTACAATTGCGCTCGCGTTTCACATGATAGGTCACACTATTCTGTCAGGAGCAAA301CAGCTAAAACATTTTCATAAGATTCAGCAAATGAGGGGAGAGGCCAAATCCACTGTAAAC36丄TCAAAATACTATAATCGGCAGCAGGACGGTGATGTCAGACGAAAAACAGAGAGGAGAACA421CTTCCTTAATCACAATCCACAAGTCAACGGCAGATCCAGACACCGCATATGTGTTTCCGG481ACTCTGGATTCAGGCATAGTTTACTCGGGAGCAGCTCTTCGGGACACGGAAGATGCACAC541TGGATGGCATGGAGGTCAGGGGGAATAATCGAACATGCGAAATGGAAATTGGCTAGTTGT601GGAGCGTCAACTGGGAGCTTATCTTATTACTAATTAGTATTACCATTGCCATTACGTCTG661AAACAGACGGGGCTCCCATTTCTTTTTGATGTCGTTAGTACAGCCGGCTTCGTTTTTCTT"721TTCTGGCTGTCTCGGCTGTCACCTGTCAGTCTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGCCGACG781AGGGCGCCGTGGACTTCGCGGGCTCGCGGCGATGGCGATGCGCGCTCCAACTGCGGCGGG841TCTCACCGGGCTGCGTGCGTACGCCGATATGCCTGCCCATCTCGGGATATATTGTGGTGT901AAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGGGG961TGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCT1021GAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGA1081TGGTGGTTCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTT1141GAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAA1201AGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAG1261TTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATT1321TAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGG1381AGCGGGCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCi'mTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAG二501GGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCSEQIDNO2:3'立嶄序歹[J:(1581bp)1.TCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGTGAGCATCGACAAAAGAAACA61GTACCAAGCAAATAAATAGCGTATGAAGGCAGGGCTAAAAAAACCCACATATAGCTGCTGmCATATGCCATCATCCAAGTATATCAAGATCAAAATAATTATAAAACATACTTGTTTATTA181TAATAGATAGGTACTCAAGGTTAGAGCATATGAATAGATGCTGCMATGCCMOVTGTM1241ATGCATCAGTAAAACCCACATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCAT301CTTAAACTCGTAACTATGAAGATGTATGACACACACATACAGTTCCAAAATTAATAAATA361CACCAGGTAGTTTGAAACAGTATTCTACTCCGATCTAGAACGAATGAACGACCGCCCAAC421CACACCACATCMCACAACCAAGCGAACAAAAAGCATCTCTGTATATGCATCAGTAAAAC481.CCGCATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCATCATCTTCAATTCGTA541ACTATGAATATGTATGGCACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCACCAGGTAGTT601TGAAACAGAATTCTACTCCGATCTAGAACGACCGCXAACCAGACCACATCATCACAAC.C661AAGACAAAAAAAAGCATGAAAAGATGACCCGACAAACAAGTGCACGGCATATATTGAAAT721AAAGGAAAAGGGCAAACCAAACCCTMGCAACGAAACAAAAAAAATCATGAAATCGATCC781CGTCTGCGGAACGGCTAGAGCCATCCCAGGATTCCCCAAAGAGAAACACTGGCAAGTTAG841CAATCAGAACGTGTCTGACGTACAGGTCGCATCCGTGTACGAACGCTAGCAGCACGGATC901TAACACAAACACGGATCTAACACAAACATGAACAGAAGTAGAACTACCGGGCCCTAACCA961.TGGACCGGAACGCCGATCTAGAGAAGGTAGAGAGGGGGGGGGGGGGAGGACGAGCGGCGTi021ACCTTGAAGCGGAGGTGCCGACGGGTGGATTTGGGGGAGATCTGGTTGTGTGTGTGTGCG1081CTCCGAACAACACGAGGTTGGGGAAAGAGGGTGTGGAGGGGGTGTCTATTTATTACGGCG1141GGCGAGGAAGGGAAAGCGAAGGAGCGGTGGGAAAGGAATCCCCCGTAGCTGCCGTGCCGT12OGAGAGGAGGAGGAGGCCGCCTGCCGTGCCGGCTCACGTCTGCCGCTCCGCCACGCAATTTCTGGATGCCGACAGCGGAGCAAGTCCAACGGTGGAGCGGAACTCTCGAGAGGGGTCGGCACGATGGTCGCATCGTCGTGCGTGAGCTGCCTATCGACAGGTGGTGTGCCAATGAGGAGAT1381ACGTTGATCTGTGGTTTCCAAAAGTCCGGTGCAAAATGGGAGATAGCTGCGATGGCTTAT1441TTACTTGGGTGGTGCACACTTGTACAGGTTAGCTTGACAGTTAGAGAAGTACGTACTCCT1501ATAAAAGATTTCCAGGAATTCTCGTGCTGGACTCTTTCGCGAGCACCTGCACTTTGAGCA1561TGAGGTGCAACGGCTGATCTT權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為5’端旁側(cè)序列，其特征在于5’端旁側(cè)序列如SEQIDNO1所示。2.—種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為3，端旁側(cè)序列，其特征在于3'端旁側(cè)序列如SEQIDN02所示。3.權(quán)利要求1所述的旁側(cè)序列的制備方法，是通過TAIL-PCR擴增得到。4.權(quán)利要求2所述的旁側(cè)序列的制備方法，是通過LD-PCR擴增得到。5.轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物為依據(jù)SEQIDN01中l(wèi)-884位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物為依據(jù)SEQIDNOI的885-1544位序列設(shè)計的反向引物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述正向引物為Dfl:5'-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3'，所述反向引物為LB-P3:5'-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3'。7.轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求2所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物依據(jù)SEQIDN02中l(wèi)-1311位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物依據(jù)SEQIDN02的1312-1581位序列設(shè)計的反向引物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述正向序列為1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3'，所述反向序列為Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3，。全文摘要本發(fā)明涉及“一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁側(cè)序列”，其特征在于5’端旁側(cè)序列如SEQIDNO1所示，3’端旁側(cè)序列如SEQIDNO2所示。利用該旁側(cè)序列作為目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的品系特異性定性、定量PCR檢測。文檔編號C12Q1/68GK101240278SQ200710063778公開日2008年8月13日申請日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日發(fā)明者彭于發(fā),王錫鋒,謝家建申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所