隆W及序列分析 用膠抱炭痘菌接種濛潰大泡核桃，用接種后4h的葉提取總RNA，用液氮將處理過的濛 潰大泡核桃的葉研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)入離屯、管中，采用異硫氯酸脈法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn) 錄酶M-MLV(promega)W總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為；取5yg totalRNA，依次加入 50ngoligo(dT)，2uLdNTPMix(2. 5mleach),用DEPC水將反 應(yīng)體積補齊至14. 5yL;混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻5min,然后依次 加入 4uL5XFirst-standbuffer、0. 5uLRNasin(200U)、1yLM-MLV(200U)，混勻 并簡短離屯、，42°C溫浴1.5h，取出后70°C加熱10min,終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置 于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0020] W合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因/如?/乂所用上下游引物序列分別為 5' -CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG- 3'及y-ACCTTGCATCCATCGAAACAAT- 3'。采用Advantage? 2PCREnzyme(Clontech)擴增出目的基因。PCR反應(yīng)條件；95°C1min;94°C30S，60°C30s，72°C45s，32 個循環(huán)；72°C5min。反應(yīng)體系（20uL)為 1uLcDNA、2uL lOXAdvantage2PCRBuffer、1.8uLdNTPMix(lOmMeach)、0.2uL正向引物（10 jiM)、0. 2uL反向引物（10jiM)、0. 2uLAdvantage2PCRPolymeraseMix、14. 6uL PCR-Gradewater。PCR結(jié)束后，取8yL進行瓊脂糖凝膠電泳，用W檢測擴增產(chǎn)物的特異性 W及大小。
[0021] 所得到PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對PCR產(chǎn)物進行TA克隆，使用的試劑盒 為PMD18-Tvectorkit(大連寶生物），反應(yīng)體系和操作過程為：取1.5uLPCR產(chǎn)物，依 次加入 1uLpMD18-Tvector(50ng/uL)和 2.5uL2XLigationsolutionI，混勻 后置于16°C過夜反應(yīng)。通過熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌D冊a感受態(tài)中。用含 有氨節(jié)青霉素（ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個單菌落，搖 菌后用擴增的特異引物檢測多克隆位點插入的克隆。將得到的陽性克隆 進行測序，最終獲得的化W全長cDNA為815bp，通過NCBI0RFfinder〇ittp:/7w麗. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/go;rf.html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個408bp的開放讀碼框（見序列 表）。巧PW編碼一個含135個氨基酸的蛋白質(zhì)JsPRPl，其分子量約為14. 17KDa，等電點 為8. 91。借助生物信息學(xué)軟件Signal? 4. 1分析巧PW編碼的蛋白序列，檢測其是否具有 N端信號膚。結(jié)果顯示在JsPRPl的N端存在信號膚，因此推測該蛋白是分泌蛋白。
[0022] 實施例2 ;植物超表達載體構(gòu)建 采用SanPrep柱式質(zhì)粒DM小量抽提試劑盒（上海生工）提取插入/s巧PW的大腸桿 菌質(zhì)粒PMD18-T- /s/WWW及植物表達載體PCAMBIA2300S質(zhì)粒，取1yL用于瓊脂糖凝膠 電泳W(wǎng)檢測所提取質(zhì)粒的完整性及濃度高低。用限制性內(nèi)切酶仿oRI(TaKaRa)和化細(xì)I (TaKaRa)分別對質(zhì)粒PMD18-T-/S巧滬巧日PCAMBIA2300S進行雙酶切（100yL體系），反 應(yīng)體系和操作過程為；分別取20yLPMD18-T-/S巧滬巧日PCAMBIA2300S質(zhì)粒、依次加入10 UL10XKbuffer、5uL仿〇《/、5uL公a紐1、60uLd地2〇,混勻后短時離屯、，置于37°C 過夜反應(yīng)。將所有酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用SanPrep柱式DM膠回收試劑 盒（上海生工）對化W片段和PCAMBIA2300S載體大片段分別進行膠回收，取1yL回 收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小W及濃度，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0023] 利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的巧滬iDNA片段和PCAMBIA2300S載體 片段連接起來，反應(yīng)體系（20 y L)和操作過程為：取10 y L /S/WWDNA片段依次加入2 UL PCAMBIA2300S載體DNA、2 uL 10XT4 DNA Ligase Buffer、！uL T4 DNA Ligase、5 UL d地2〇,混勻后短時離屯、，然后16°C水浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入大腸桿菌D冊a中，用含有50 mg/L卡那霉素化anamycin，Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克 隆。挑選單菌落搖菌，W菌液為模板用擴增的特異引物進行PCR，挑選出與 PCAMBIA2300S成功連接的克隆，并向檢測得到的陽性菌株中加入甘油并置于-80°C保存?zhèn)?用。
[0024] 采用SanPr巧柱式質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工）提取并純化上述大腸桿菌 D冊a中的PCAMBIA2300S-/S化料質(zhì)粒。隨后用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達載體 PCAMBIA2300S-/S/WW轉(zhuǎn)入所制備的根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。操作步驟為：取 2ygPCAMBIA2300S-/S巧滬2質(zhì)粒加入含有200uL感受態(tài)細(xì)胞的離屯、管中，輕輕混勻后 冰浴5min,隨后轉(zhuǎn)入液氮中冷凍1min,然后迅速置于37°C水浴5min,再冰浴2min,之 后加入500yLLB液體培養(yǎng)基于28°C振蕩培養(yǎng)4h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50mg/ LKm的LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，再用擴增的特異性引物 進行PCR反應(yīng)，檢測PCAMBIA2300S-/S化料是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油后 置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[00巧]實施例3 ;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化W及轉(zhuǎn)基因植物篩選 本實驗的轉(zhuǎn)基因受體是煙草OVicWiana 知cufflL.)。將煙草種子用75%的酒精浸泡 30S，無菌水洗漆后用0. 1%的化Cl2浸泡8min,然后再用無菌水洗漆若干次，播種于1/2MS培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)5-8山發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱（25°C，16h/d光照），W后每月用 MS培養(yǎng)基繼代一次。
[0026] 從-80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-/s/WW質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌 種，取20uL接種于5血含有50mg/LKm和20mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培 養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。吸取1mL渾濁的菌液至含有50mg/LKm的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 48h。隨后將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于附加有20mg/L的己酷了香酬的 M化液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)5-8hW活化農(nóng)桿菌。
[0027] 取煙草無菌煙草幼嫩葉片切成約1cm2的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌 的M化液體培養(yǎng)基中，25°C浸染15min。用無菌濾紙吸干葉盤表面的菌液，將葉盤置于共培 養(yǎng)基上，22°C無光條件下共培養(yǎng)2天。煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0.02mg/L6-BA+2. 1mg/ LNAA+30g/L庶糖+6g/L瓊脂。
[0028] 將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時篩選轉(zhuǎn)基 因植株。煙草篩選培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L6-BA+0. 1mg/LNAA+30g/L庶糖+6g/L瓊脂 +50mg/LKm+200mg/L頭抱霉素（cefotaximesodiumsalt,Cef);篩選培養(yǎng)時將培養(yǎng)瓶 轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（25°C，16h/d光照，8h/d黑暗）。待煙草長出芽后用含有50mg/ LKm和200mg/LCef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株 進行進一步篩選。將煙草再生苗移至含有50mg/LKm的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用 生根較好的再生苗做進一步的檢測。
[0029] 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，取1yL所得基因組DNA進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。W轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用的 特異引物進行PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后，取8UL產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳W(wǎng)檢測陽性轉(zhuǎn)基因 植株。部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的擴增結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到32株陽 性轉(zhuǎn)基因植株。
[0030] 實施例4 ;轉(zhuǎn)基因煙草中的表達分析W及轉(zhuǎn)基因植株抗真菌活性分析 分別取陽性轉(zhuǎn)基因植株W及非轉(zhuǎn)基因煙草（野生型）的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDM第一鏈，并W此為模板用擴增戶足^的特異引物進行PCR，根據(jù)PCR結(jié)果分析各轉(zhuǎn)基 因植株中巧滬巧專錄水平的表達量。總RNA提取W及RT-PCR的方法與實施例1中相同。 PCR結(jié)束之后，取8yL用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結(jié)果如圖2所示，共檢測到 20個轉(zhuǎn)基因單株中在轉(zhuǎn)錄水平大量表達，該些單株的編號為1~20。
[0031] 將實驗室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基（200g/L馬鈴馨，15g/L瓊脂， 20g/L葡萄糖）上，28°C暗培養(yǎng)，待菌落生長至直徑約為2~3cm時添加蛋白，分析轉(zhuǎn)基因植 株體外抗真菌活性。膠抱炭痘菌（C如9e(〇s/7ari(9it/es)、核盤菌（5： 葡萄 座腔菌（公.沁沁<3)、和串珠狀赤霉菌（G 為了防止其它雜菌污染所提 取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作。首先取1g轉(zhuǎn)基因煙草單株（編號分別 為3、4、6、10)及野生型葉片放入研鉢中，加入1血蛋白提取液（1M化C1，0. 1M己酸鋼， 1〇/〇PVP，P冊.0)，充分研磨。轉(zhuǎn)入1.5血離屯、管中，混勻后4°C靜置過夜。4°C離屯、30min (12,000g)，取上清于新的1.5血離屯、管中，并取適量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度。 將轉(zhuǎn)基因和野生型植株的總蛋白濃度調(diào)整至0.2yg/uL然后分別取20UL滴于各真 菌培養(yǎng)基的無菌濾紙上。在每個真菌的平板上除了添加不同轉(zhuǎn)基因煙草植株的總蛋白，同 時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照（蛋白提取液）。28°C培養(yǎng)幾天后觀察各處理 真菌生長的情況，并據(jù)此來評價轉(zhuǎn)基因煙草的體外抗真菌活性。結(jié)果如圖3所示， 轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對膠抱炭痘菌、核盤菌、葡萄座腔菌W及串珠狀赤霉菌的生長具有 明顯的抑制作用。
【主權(quán)項】
1. 一種漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO:1 所示。
2. 權(quán)利要求1所述的漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因在提高煙草對膠孢炭 疽菌、核盤菌、葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌抗性中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因/#^7的應(yīng)用，其特征在 于提高煙草的真菌抗性的具體操作如下： (1) 將漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因與植物超表達載體PCAMBIA2300S連 接，構(gòu)建植物超表達載體； (2) 將上述構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中； (3) 以重組載體T-DNA上具有的卡那霉素抗性基因來篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，接種特定病原真菌，分析轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對真菌生長的抑 制活性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉(zhuǎn)基因植株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因JsPRP1及應(yīng)用，JsPRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，編碼富含脯氨酸蛋白，本發(fā)明通過功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)研究證實JsPRP1基因具有提高植物抗真菌侵染的功能，將本發(fā)明抗真菌JsPRP1基因構(gòu)建到植物表達載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達，轉(zhuǎn)基因煙草植株具有很強的體外抗真菌活性；JsPRP1超表達的轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌、核盤菌、葡萄座腔菌以及串珠狀赤霉菌的生長具有明顯的抑制作用。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-84, C12N15-29
【公開號】CN104774847
【申請?zhí)枴緾N201510118386
【發(fā)明人】劉迪秋, 韓青, 陳朝銀, 陳瑞, 葛鋒
【申請人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年3月18日