阻斷豬pd-1/pd-l1通路的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物分子免疫學(xué)，具體涉及阻斷豬ro-1/PD-Ll通路的多肽及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 免疫系統(tǒng)存在著活化和抑制調(diào)節(jié)兩種信號通路，免疫活化和抑制調(diào)節(jié)相互協(xié)調(diào)共 同維持免疫系統(tǒng)動態(tài)平衡。TCR或BCR與MHC分子-抗原肽和共刺激信號通路B7/⑶28共 同調(diào)節(jié)t細(xì)胞或b細(xì)胞活化；另外，t細(xì)胞表面存在一系列的免疫抑制性表面分子，如ro-i、 (^1^-4、11111-3、10)5、1^1、31^、1^-3等，與其相應(yīng)配體結(jié)合激活免疫負(fù)調(diào)節(jié)通路，導(dǎo)致丁 細(xì)胞功能衰竭。其中ro-1/PD-Ls通路是目前研宄的熱點(diǎn)，研宄表明，多種急性或慢性病毒 性疾病過程中，ro-1及其配體ro-Li和ro-L2表達(dá)量升高，ro-i與其配體相互結(jié)合后，激 活ro-l下游通路，抑制了 T細(xì)胞抗病毒細(xì)胞因子分泌、增殖和CTL等功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑 制。有趣的是用抗ro-i或ro-Li的抗體阻斷ro-i/PD-Ls通路后，可以逆轉(zhuǎn)已衰竭t細(xì)胞 的功能，為提高免疫水平和治療病毒性免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。
[0003] PD-L1比ro-L2的分布更加廣泛，如表達(dá)ro-Ll的細(xì)胞種類較多，如B細(xì)胞、DC、巨 噬細(xì)胞、骨髓源肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞星形膠質(zhì) 細(xì)胞等，而H)-L2僅表達(dá)于DC、巨噬細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞等，所以在阻斷ro-1/PD-Ls通路逆 轉(zhuǎn)T細(xì)胞功能方面，PD-1/ro-Ll通路比TO-1/PD-L2通路顯得更加重要。相關(guān)研宄表明，可 溶性ro-1重組蛋白免疫小鼠后，可以顯著提高T細(xì)胞抗病毒或抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到清除 病原或殺死腫瘤細(xì)胞的目的，為開發(fā)可溶性蛋白ro-i和ro-Ls的藥物或疫苗奠定基礎(chǔ)。目 前，PD-1和ro-Ls的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，在ro-i與ro-Ll復(fù)合物結(jié)合區(qū)域中，PD-1的n末 端結(jié)合區(qū)域與ro-Li的c端結(jié)合區(qū)域位于復(fù)合物的同一側(cè)面，ro-i的兩個e折疊鏈分別 位于ABED和A' GFCC C"區(qū)域，PD-L1的兩個0折疊鏈分別位于AGFW C"和BED區(qū) 域，為篩選和鑒定阻斷ro-1/PD-Ls通路的多肽表位提供有利信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了阻斷豬ro-1/PD-Ll通路的多肽及其應(yīng) 用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：阻斷豬ro-1/PD-Ll通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序 列為：CTRRNDSGTYFCGAHLPPKTQINESHQAKLT。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于，提供了阻斷豬ro-1/PD-Li通路的多肽在提高體液免疫 中的應(yīng)用。
[0007] 阻斷豬ro-i/PD-Li通路的多肽作為佐劑在提高體液免疫中的應(yīng)用。
[0008] 阻斷豬ro-1/PD-Li通路的多肽在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用。
[0009] 阻斷豬ro-1 /PD-L1通路的多肽的用途，用于結(jié)合PBMC上的ro-L 1，阻斷ro-1 / PD-L1通路，提高PBMC增殖。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計合成了基于ro-1/PD-Li復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)的系列多肽，對其阻斷ro-1/ PD-L1通路后的免疫效應(yīng)進(jìn)行研宄，為獲得提高免疫效應(yīng)的多肽藥物或疫苗佐劑奠定基礎(chǔ)?！靖綀D說明】
[0011] 圖la是PBMC與FITC結(jié)合的結(jié)合流式散點(diǎn)圖。
[0012] 圖lb是PBMC與FITC結(jié)合的流式熒光曲線圖。
[0013] 圖lc是PBMC與本發(fā)明多肽結(jié)合散點(diǎn)圖。
[0014] 圖Id是PBMC與本發(fā)明多肽結(jié)合曲線圖。
[0015] 圖2a是陰性對照組刺激PBMC增殖的流式圖。
[0016] 圖2b是本發(fā)明多肽刺激PBMC增殖的流式圖。
[0017]圖3a是本發(fā)明多肽高效液相圖。
[0018]圖3b是本發(fā)明多肽的質(zhì)譜圖。
[0019]圖4是本發(fā)明多肽作為佐劑免疫小鼠的抗體效價變化。
[0020] 圖5a是FITC對照組。
[0021] 圖5b是PD-15與重組蛋白PD-L1的結(jié)合。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0023] 多肽標(biāo)記FITC
[0024]用 FITCAntibody Labeling Kit試劑盒將 FITC 標(biāo)記于多肽上，F(xiàn)ITCAntibody Labeling Kit可以將FITC連接于氨基酸殘基中的巰基、咪唑基、羰基和酪氨酰等基團(tuán)，步 驟如下：
[0025] (1)多肽準(zhǔn)備，向0? 5mL 2mg/mL多肽溶液中加入40 y L 0? 67mol/L的硼酸鈉溶液， 并將多肽濃度調(diào)制lmg/mL;
[0026] (2) 0. 5mL多肽加入裝有約30 y L FITC試劑管中，混勻使試劑充分溶解，室溫避光 孵育60min;
[0027] (3)往反應(yīng)管中加入400 y L純化樹脂，將反應(yīng)管放入微型收集管中，1000r/min室 溫離心30~45sec，棄掉收集管；
[0028] (4)把反應(yīng)管放入新的收集管中，加入250~270 y L的標(biāo)記反應(yīng)液（0? 05mol/L 硼酸鈉溶液），混勻，l〇〇〇r/min室溫離心30~45sec，收集液即為標(biāo)記并純化多肽，分裝一 20 °C避光保存。
[0029] FITC標(biāo)記多肽與PBMC結(jié)合
[0030] PBMC 分離
[0031] (1)頸靜脈采集正常豬抗凝血5mL，抗凝劑為10%檸檬酸鈉，全血與抗凝劑比例為 10:1，抗凝血與等量PBS輕輕混勾；
[0032] (2)取4mL淋巴細(xì)胞分離液于15mL玻璃離心管中，將上述混勻血10mL沿管壁慢慢 加入離心管中（注：動作要輕，不能混勻），水平轉(zhuǎn)子2000r/min，室溫離心20min;
[0033](3)用毛細(xì)管吸取血漿層與分離液之間的白色細(xì)胞薄層（單個核細(xì)胞），移入新的 15mL玻璃離心管中，加入2~5倍體積PBS，輕輕懸浮細(xì)胞，1000r/min，室溫離心10min，棄 上清，加入10mL PBS，輕輕懸浮細(xì)胞，重復(fù)離心一次，棄上清；
[0034] (4)觀察白細(xì)胞中紅細(xì)胞量，適當(dāng)加入1~2mL紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解紅細(xì)胞 5min，加入10mL PBS，1000r/min，室溫離心10min，棄上清，加入0.5mL PBS，懸浮細(xì)胞，即為 PBMC細(xì)胞懸液。
[0035] PD-15 與 PBMC 結(jié)合
[0036] PBMC來自于臨床感染PCV2的斷奶仔豬，用PBS調(diào)整PBMC濃度至106個/mL，取10 6 個PBMC加入終濃度為0. lmg/mL的FTIC-多肽（總體積200 y L)，同時設(shè)FITC為陰性對照 組，混合均勻后冰上避光結(jié)合2h，期間多次懸浮細(xì)胞，PBS洗滌6次，加入0. 5mL PBS懸浮細(xì) 胞，200目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測多肽與PB