GmbHLH轉(zhuǎn)錄因子在促進大豆異黃酮合成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因 在轉(zhuǎn)基因大豆組織中提高大豆異黃酮含量水平的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 異黃酮作為豆科植物中特有的一種次級代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)起到植保素的作 用，特別是在植物抗外來真菌入侵方面起到重要的保護作用。與此同時，異黃酮作為人類 雌激素的類似物在促進人類健康方面也起到了重要作用。近些年對于描述異黃酮在生物學 及醫(yī)學方面的文章屢見不鮮，主要闡述了異黃酮在促進人體健康和預(yù)防疾病方面的作用。 這些內(nèi)容大多集中在：異黃酮平衡女性雌激素水平，預(yù)防和治療女性更年期并發(fā)癥；調(diào)節(jié) 心血管系統(tǒng)，改善心肌缺血，降低血固醇類物質(zhì)含量；防癌和抗癌的功效，特別是降低乳腺 癌的功能；另外，異黃酮還有預(yù)防老年癡呆和骨病等療效。
[0003] 隨著我國人民生活水平的普遍改善，人們在提高生活質(zhì)量方面的投入更多，特別 是增加了對于家庭身體健康方面開支。另一方面，我國老年人口比例也在逐步增加，這使得 健康方面支出占總財政方面支出的比例進一步增大。隨著人們對科學技術(shù)和知識更深入和 全面的了解，像是異黃酮制劑作為保健品已能夠被人們接受。異黃酮能夠預(yù)防和治療一些 多發(fā)的頑固性疾病，并且具有很好的療效，因此對其的消費需求也隨之增加。大豆作為當前 世界主要的經(jīng)濟作物之一，也是大豆異黃酮（soybeanisoflavone)主要分離提取來源。所 以，提高大豆植株的異黃酮含量具有很高的經(jīng)濟及社會價值。
[0004] 植物的轉(zhuǎn)錄因子一般定位在植物的細胞核內(nèi)，通過結(jié)合特定的DNA序列，調(diào)節(jié)下 游基因的表達，有時會起到調(diào)控同一代謝通路的作用，從而使這一代謝通路的下游產(chǎn)物能 夠大量積累。植物苯丙氨酸代謝主要分為前期代謝過程和后期代謝過程，在早期代謝過程 中，即在查兒酮異構(gòu)酶CHI的作用下生成4'，5'，7' -三羥基黃烷酮，該物質(zhì)將成為多種酶 作用底物，一方面在黃烷酮-3羥化酶（F3H)及二氫還原酶（DFR)作用下生成花青素，另一 方面在異黃酮合成酶（IFS)及2-羥基異黃烷酮脫水酶（HID)作用下合成異黃酮。所以，抑 制花青素合成相關(guān)基因的表達，能夠促使底物向異黃酮合成方向流動。Xie (2013)的研宄指 出，過量表達AtbHLH3轉(zhuǎn)錄因子能降低擬南芥花青素的合成代謝。
[0005] 目前，轉(zhuǎn)基因方法是提高作物品質(zhì)及產(chǎn)量的重要手段。由于傳統(tǒng)育種對于作物產(chǎn) 量的提高程度有限，并且新品種的的培育時間漫長，阻礙了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與進步，同時造 成大量投入的浪費。轉(zhuǎn)基因方法很好的解決了這一問題，縮短了育種期限，并且大幅提高作 物的目的性狀。但是，轉(zhuǎn)基因的安全問題也受到了廣泛關(guān)注。為了解決轉(zhuǎn)基因安全問題，一 方面是加緊完善審查制度，另一方面是加緊研宄導(dǎo)入的外源基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因作物內(nèi)部代謝 產(chǎn)物的影響，及自身蛋白的毒性研宄。目前，內(nèi)源基因的過表達能夠在一定程度上解決轉(zhuǎn)基 因作物所遇到的安全問題。內(nèi)源基因是來自于作物本身，通過內(nèi)源基因過量表達提高相應(yīng) 的植物性狀，從而大大降低外源基因?qū)朐斐傻漠a(chǎn)生不明代謝產(chǎn)物的隱患，也便于基因自 身研宄工作的開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種GmbHLH轉(zhuǎn)錄因子在促進大豆異黃酮合成中的應(yīng)用，以解決基因 代謝產(chǎn)物的安全隱患問題。
[0007] GmbHLH轉(zhuǎn)錄因子在促進大豆異黃酮合成中的應(yīng)用。
[0008] 所述的GmbHLH轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所述。
[0009] 編碼所述的大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所述。
[0010] 一種重組載體，利用植物表達載體PCAMBIA3301H，將克隆得到的GmbHLH3a轉(zhuǎn)錄因 子開放閱讀框的部分構(gòu)建成為重組載體pCAMBIA3301H-GmbHLH3a，所述pCAMBIA3301H載體 中含有35s啟動子。
[0011] 本發(fā)明所提供的提高大豆異黃酮含量的bHLH轉(zhuǎn)錄因子來源于吉林32大豆品種， bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因命名為GmbHLH3a。
[0012] SEQ ID No. 1由1515個堿基組成；SEQ ID No. 2由504個氨基酸殘基組成，自氨基 端的第51至227位氨基酸殘基含一個bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域和358至407位氨基酸殘基含一 個HLH結(jié)構(gòu)域，通過比對和預(yù)測得知這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)儆贛YC類轉(zhuǎn)錄因子家族成員；含有一個 核定位信號：自氨基端的第342至343位氨基酸殘基。
[0013] 利用植物表達載體pCAMBIA3301H，將克隆得到的GmbHLH3a轉(zhuǎn)錄因子開放閱讀框 的部分構(gòu)建成為重組載體pCAMBIA3301H-GmbHLH3a4CAMBIA3301H載體中含有35s啟動子， 從而使GmbHLH3a在植物中能夠高效表達；pCAMBIA3301H載體還包含草苷膦抗性Bar基因， 在多種轉(zhuǎn)基因作物中已驗證具有抗除草劑的功能，同時至今沒有發(fā)現(xiàn)其具有危害人體的毒 性。pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重組植物表達載體可以通過基因槍和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式 導(dǎo)入至各種大豆品種中，也包括各種雙子葉植物中。最終，可獲得高異黃酮含量的大豆品 種。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明克隆了一個與大豆苯丙氨酸代謝通路相關(guān)的大豆 GmbHLH3a轉(zhuǎn)錄因子基因，通過進化分析得到該轉(zhuǎn)錄因子的同源基因，得知其屬于bHLH基因 家族，尤其是其與擬南芥AtbHLH3同源，因此很可能具有相近的功能；通過實驗進一步證明 其基本結(jié)構(gòu)與MYC轉(zhuǎn)錄因子相同；進一步將構(gòu)建的pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重組植物表達 載體轉(zhuǎn)化大豆發(fā)根農(nóng)桿菌，檢測轉(zhuǎn)基因發(fā)根異黃酮含量，證明其提高了大豆異黃酮各組分 含量。這些研宄結(jié)果在基礎(chǔ)理論和實際功效上都為pCAMBIA3301H-GmbHLH3a重組載體導(dǎo)入 大豆提高大豆異黃酮含量提供了有效依據(jù)。
[0015] 本發(fā)明選用的GmbHLH3a轉(zhuǎn)錄因子，只在大豆細胞核中表達，通過結(jié)合DNA序列調(diào) 控下有基因的表達量從而提高了大豆異黃酮的含量。全過程由于GmbHLH3a為轉(zhuǎn)錄因子蛋 白，不產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，從而最大限度的降低了轉(zhuǎn)基因代謝產(chǎn)物的安全隱患。
【附圖說明】
[0016] 圖 1 是 GmbHLH3a 基因的 PCR 擴增結(jié)果圖，M:2000bp maker. l-3:GmbHLH3 擴增結(jié) 果；
[0017] 圖2是MYC類轉(zhuǎn)錄因子進化樹圖；
[0018] 圖3是大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子的表達模式圖；
[0019] 圖4是GmbHLH3a重組蛋白的表達模式圖，M :Protein Marker ;1 :pET28a空載體 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌；2 :pET28a空載體IPTG誘導(dǎo)菌；3 :pET28a-MYC2a未誘導(dǎo)菌；4-8 :分別為 pET28a-GmbHLH3a IPTG 誘導(dǎo) 4h，6h，8h，10h 和 12h 菌體；
[0020] 圖5是GmbHLH3a基因籽粒發(fā)育期表達模式圖；
[0021] 圖6是GmbHLH3a基因亞細胞定位試驗圖；
[0022] 圖7是報告質(zhì)粒、效應(yīng)質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023] 圖8是轉(zhuǎn)基因發(fā)根陽性結(jié)果的篩選示意圖，圖中：
[0024] A :轉(zhuǎn)化 K599pCAMBIA1300h - GmbHLH3 大豆根，
[0025] B :轉(zhuǎn)化 K599 (CK) pCAMBIA1300h 大豆根，
[0026] C :獲得陽性結(jié)果，
[0027] D:得到陰性結(jié)果；
[0028] 圖9是GmbHLH3a基因在轉(zhuǎn)基因發(fā)根中的qRT-PCR鑒定結(jié)果，其中
[0029] l-3:pCAMBIA1300h - GmbHLH3 ；
[0030] 4-6:pCAMBIA1300H ；
[0031] 圖10是轉(zhuǎn)基因發(fā)根異黃酮含量高效液相色譜HPLC的測定結(jié)果圖，其中：
[0032] 1.總異黃酮2.染料木苷3.黃豆黃苷4.大豆苷。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1 :GmbHLH3a基因的克隆及序列分析
[0034] 大豆RNA的提取及cDNA的合成：用RNAiso Plus (購自TaKaRa公司）提取大豆吉 林 32 軒粒發(fā)育 30 天的總 RNA，用 M-MLV reverse transcriptase (RNase H〇 (購自 TaKaRa) 進行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條cDNA。
[0035] 引物的設(shè)計與合成：將大豆品種吉林32的3個時期（20、30和50天）未成熟胚 表達譜測序所得序列（華大基因完成）輸入phytozomelO. 1中進行Blast比對，獲得一個 與植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列同源性較高的bHLH3-l ike的完整cDNA序列。根據(jù)已 獲得的cDNA序列，其核苷酸序列如Sequence NO. 1所述，設(shè)計合成引物，GmbHLH3a-RT_F : 5 ' -CGCCAAATCACAATACCC-3 '、GmbHLH3a-RT-R : 5 ' -GCCACTTAACCTACAAGACAGA-3 '。以上述 cDNA為模板，按照以下反應(yīng)體系及條件進行PCR擴增：總共25 :總體系，內(nèi)含10,內(nèi)含照以 下反應(yīng)體系及條件進行y〇,2.5mM dNTP mix 2ydNTPyd的引物GmbHLH3a-RT-F和引物 GmbHLH3a-RT-R各 lym，cDNA 2yD，Ex Taq(購自 1&1^1^)0.51^，補去離子水至25115。反 應(yīng)條件：預(yù)變性 94°C 8min ;94°C 40s, 58°C 90s, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C延伸 8min。將上 述擴增片段回收后與克隆載體PMD18-T(購自TaKaRa)進行連接，鑒定后送華大基因測序， 驗證序列正確后保留備用。
[0036] 經(jīng)PCR擴增得到包含有GmbHLH3a基因全長0RF的序列，編碼一個由502個氨基酸 殘基組成的蛋白質(zhì)，包含一個保守的HLH結(jié)合域，和MYC轉(zhuǎn)錄因子特有的bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu) 域，一個核定位信號。
[0037] 實施例2 :GmbHLH3a基因的進化樹分析
[0038] 根據(jù)plantTFDB在線數(shù)據(jù)庫公布的大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子及擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù) 據(jù)，使用ClustalW2軟件對兩組數(shù)據(jù)合成產(chǎn)生無根進化樹，使用MEGA 6. 0進行進化樹的亞 家族分類標記（分類方案參考2001年Ralf Stracke文章的分類內(nèi)容）從中得出大豆及擬 南芥MYC類轉(zhuǎn)錄因子家族。將得到的MYC類轉(zhuǎn)錄因子在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast，檢測出 相關(guān)研宄信息。將擬南芥或大豆轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)名稱更改為已公布的研宄命名，以便能夠更 好的了解對應(yīng)AtMYC轉(zhuǎn)錄因子的GmMYC基因同源性及功能分析。
[0039] 經(jīng)過分析最終得